橡膠樹不同種群炭疽菌對(duì)殺菌劑的敏感性

賀競鋒，劉先寶，李博勛，蔡吉苗，馮艷麗，黃貴修

（1. 海南大學(xué) 熱帶作物學(xué)院，?？?570228; 2. 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院 環(huán)境與植物保護(hù)研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部熱帶作物有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/海南省熱帶農(nóng)業(yè)有害生物監(jiān)測與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，?？?571101）

橡膠樹炭疽病是一類由炭疽屬(Colletotrichum)真菌侵染引起的重要葉部病害[1]。該病在橡膠樹不同葉齡期、不同生長階段的多個(gè)組織上均能發(fā)生危害，給天然橡膠生產(chǎn)帶來嚴(yán)重?fù)p失。目前，橡膠樹炭疽病病原菌主要有膠孢炭疽菌(Colletotrichum glocosporioidesPenz.)、尖孢炭疽菌(C. acutalumSimmons)和 博 寧 炭 疽(C.boninense)3個(gè)復(fù)合種，每個(gè)復(fù)合種內(nèi)又包括多個(gè)種。其中，膠孢炭疽復(fù)合種包括暹羅炭疽(C.siamense)、果生刺盤孢(C. fructicola)和樂東炭疽(C.ledongense)等，尖孢炭疽復(fù)合種下包括華南炭疽(C. australisinense)、版納炭疽(C. bannanense)和C. laticiphilum等。暹羅炭疽和華南炭疽是引起我國橡膠樹炭疽病的優(yōu)勢種[2]。由于復(fù)合種間、種間生物學(xué)特性存在較大差異，由此推測不同復(fù)合種對(duì)藥劑的敏感性存在差異。目前，化學(xué)防治是橡膠樹炭疽病的主要防治方法。以多菌靈為代表的苯并咪唑類殺菌劑(BMZs)和以咪鮮胺為代表的三唑類(DMIs)殺菌劑是防治橡膠炭疽病的主要藥劑[3]。苯并咪唑類殺菌劑的主要作用機(jī)制是特異性地與病原真菌的β微管蛋白結(jié)合，進(jìn)而干擾微管裝配，抑制病原菌的生長。而三唑類殺菌劑防治病害的機(jī)制是抑制真菌體內(nèi)CytP450單加氧酶的活性，破壞麥角甾醇生物合成，導(dǎo)致細(xì)胞膜損傷而死亡[4]。印尼、馬來西亞和泰國等國家使用甲基托布津和8-hydroquinone coffer防治橡膠樹炭疽病，國內(nèi)則普遍使用多菌靈。國內(nèi)學(xué)者在復(fù)合種的水平上對(duì)橡膠樹膠孢炭疽菌和尖孢炭疽菌進(jìn)行了藥劑敏感性的評(píng)價(jià)[5?7]，但目前尚未見橡膠樹炭疽菌不同種群對(duì)殺菌劑敏感性評(píng)價(jià)與分析的報(bào)道。為了解橡膠樹不同炭疽菌種群對(duì)不同殺菌劑敏感性的差異，筆者開展了不同炭疽菌種群對(duì)不同殺菌劑的敏感性研究，旨在為生產(chǎn)上科學(xué)合理用藥提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試菌株及來源供試的17株菌株已經(jīng)明確其分類地位[8]，均由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所保存(表1)。

表1 供試菌株及來源

1.2 供試藥劑供試的8種藥劑均由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所熱帶工業(yè)原料作物病害課題組提供(表2)[9?10]。

表2 供試殺菌劑信息

1.3 帶毒培養(yǎng)基的配置將供試藥劑用二甲基甲酰胺溶解，然后配制為母液備用。向滅菌后的馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar，PDA)培養(yǎng)基中添加不同體積的母液，配置成不同濃度梯度帶毒培養(yǎng)基。供試藥劑的濃度梯度見表3。

1.4 橡膠炭疽菌的敏感性測定用打孔器從PDA平板培養(yǎng)5 d的炭疽菌落外緣打取直徑為5 mm的菌餅轉(zhuǎn)接在含不同濃度供試藥劑(在預(yù)備試驗(yàn)的基礎(chǔ)上確定藥劑合適的濃度梯度，詳見表3)的 PDA平板培養(yǎng)基中，以不含農(nóng)藥的 PDA平板培養(yǎng)基為對(duì)照，菌絲朝下置于平板中央，每處理重復(fù)3次[11?12]。膠孢炭疽菌于28 ℃下培養(yǎng)5 d后，尖孢炭疽菌于28 ℃下培養(yǎng)7 d后，用十字交叉法測量菌落直徑，試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel 2021數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進(jìn)行分析，求出回歸方程、相關(guān)系數(shù)和EC50值。其中，計(jì)算公式[13?14]如下：

表3 供試藥劑及處理濃度梯度

1.5 殺菌劑復(fù)配設(shè)計(jì)根據(jù)供試殺菌劑單劑對(duì)菌絲生長的EC50測定結(jié)果，最終選取咪鮮胺和戊唑醇進(jìn)行復(fù)配，評(píng)價(jià)藥劑混用后的聯(lián)合作用。將咪鮮胺和 戊唑醇按2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2等進(jìn)行復(fù)配，測定復(fù)配劑對(duì)供試菌株菌絲生長和孢子萌發(fā)的EC50，同時(shí)按Wadley法計(jì)算增效系數(shù)(SR)。SR≤0.5為拮抗作用，0.5≤SR≤1.5為相加作用，SR>1.5為增效作用。

式中：a、b分別為相應(yīng)單劑在復(fù)配劑中所占比例，A、B分別為咪鮮胺和戊唑醇。

2 結(jié)果與分析

2.1 供試殺菌劑對(duì)膠孢炭疽復(fù)合種生長的影響從表4可知，咪鮮胺對(duì)菌絲生長的抑制效果最佳，其平均EC50為0.079 63 mg·L?1，膠孢復(fù)合種內(nèi)果生刺盤孢敏感性稍差，樂東炭疽和暹羅炭疽的敏感性較為接近，樂東炭疽、果生刺盤孢和暹羅炭疽的 平 均EC50分 別 為0.074 25 mg·L?1、0.089 43 mg·L?1和0.074 98 mg·L?1；對(duì)咪鮮胺·三唑酮和多菌靈表現(xiàn)為敏感，其平均EC50分別為0.329 6 mg·L?1和0.414 2 mg·L?1，各種對(duì)咪鮮胺·三唑酮的敏感性中，同樣是果生刺盤孢的敏感性較差，樂東炭疽較為敏感。在對(duì)多菌靈的敏感性評(píng)價(jià)中，樂東炭疽菌的敏感性稍差，暹羅炭疽較為敏感；膠孢復(fù)合種對(duì)戊唑醇，己唑醇和氟硅唑的平均EC50較為接近，分別為1.164 4 mg·L?1、1.325 7 mg·L?1和1.122 2 mg·L?1；對(duì)腈菌唑，粉唑醇表現(xiàn)為不敏感。在相同的種群內(nèi)，不同菌源的菌株對(duì)藥劑的敏感性存在一定的差異。果生刺盤孢種內(nèi)，海南的菌株對(duì)8種藥劑的EC50最大，云南地區(qū)的菌株除咪鮮胺外的EC50最小。暹羅炭疽種內(nèi)，云南的菌株的對(duì)咪鮮胺、氟硅唑、戊唑醇和己唑醇4種藥劑中的EC50最大；海南的菌株對(duì)粉唑醇、咪鮮胺·三唑酮和腈菌唑3種藥劑中的EC50最大；廣西的菌株對(duì)多菌靈的EC50最大，其他7種藥劑的EC50最小。

表4 膠孢復(fù)合種對(duì)供試藥劑的敏感性 mg·L?1

2.2 供試殺菌劑對(duì)尖孢炭疽復(fù)合種生長的影響從表5可知，藥劑對(duì)尖孢復(fù)合種炭疽菌菌絲生長的影響。咪鮮胺對(duì)菌絲生長的抑制效果最佳，其平均EC50為0.091 61 mg·L?1，高于膠孢復(fù)合種。尖孢復(fù)合種內(nèi)又以華南炭疽最為敏感，其平均EC50為0.038 06 mg·L?1，其他3個(gè)種的敏感性較為接近，C.laticiphilum、版納炭疽和新類群的EC50分 別 為0.125 2 mg·L?1、0.122 1 mg·L?1和0.124 7 mg·L?1；尖孢復(fù)合種對(duì)咪鮮胺·三唑酮、戊唑醇和氟硅唑表現(xiàn)為高度敏感，其平均EC50分別為0.532 2、0.368 8和0.558 6 mg·L?1，各種對(duì)咪鮮胺·三唑酮的敏感性中，以C.laticiphilum和新種群較為不敏感，華南炭疽和版納炭疽較為敏感；對(duì)戊唑醇的敏感性中，C.laticiphilum最為敏感；對(duì)氟硅唑的敏感性中，華南炭疽最為敏感；對(duì)腈菌唑，粉唑醇表現(xiàn)為不敏感。從菌源上看，華南炭疽種內(nèi)，廣西的菌株對(duì)氟硅唑、粉唑醇、腈菌唑、多菌靈和己唑醇的EC50最小，廣東的菌株對(duì)戊唑醇、咪鮮胺、咪鮮胺·三唑酮的EC50最小，整體來看云南的菌株最為不敏感。

表5 尖孢復(fù)合種對(duì)供試藥劑的敏感性 mg·L?1

2.3 不同種對(duì)供試殺菌劑的敏感性從圖1可知。在對(duì)多菌靈的敏感性中，尖孢復(fù)合種的菌株平均EC50顯著大于膠孢復(fù)合種的菌株。此外，在對(duì)戊唑醇的敏感性中，膠孢復(fù)合種菌株的平均EC50顯著大于尖孢復(fù)合種的菌株，在對(duì)多菌靈、腈菌唑和粉唑醇的敏感性中，尖孢復(fù)合種內(nèi)的新種群的EC50顯著高于其他的種，其他3個(gè)種群則沒有表現(xiàn)出顯著差異。

圖1 復(fù)合種對(duì)供試藥劑敏感性的平均值

2.4 供試殺菌劑復(fù)配藥劑對(duì)橡膠樹炭疽菌的影響從表6和表7可知，復(fù)配藥劑對(duì)不同種炭疽菌菌絲生長的影響。選取效果最好的2種單劑進(jìn)行復(fù)配實(shí)驗(yàn)，即咪鮮胺和戊唑醇，分別選取膠孢復(fù)合種和尖孢復(fù)合種內(nèi)的優(yōu)勢種群，即暹羅炭疽YNBN7-4、果生刺盤孢GD1603和華南炭疽GX1655和YNJP162。

表6 膠孢復(fù)合種對(duì)復(fù)配藥劑的敏感性

表7 尖孢復(fù)合種對(duì)復(fù)配藥劑的敏感性

從增效系數(shù)上來看，對(duì)于膠孢炭疽果生刺盤孢1 603來說，咪鮮胺∶戊唑醇比例為3∶7時(shí)增效系數(shù)為0.869 5，表現(xiàn)為相加作用且效果最好；對(duì)于膠孢炭疽暹羅炭疽7-4來說，咪鮮胺∶戊唑醇比例為7∶3時(shí)，增效系數(shù)為0.872 8，表現(xiàn)為相加作用且效果最好；對(duì)于尖孢炭疽華南炭疽162來說，咪鮮胺∶戊唑醇比例為4∶6時(shí)，表現(xiàn)為增效作用且增效系數(shù)達(dá)到1.788 8；對(duì)于尖孢炭疽華南炭疽1 655來說，咪鮮胺∶戊唑醇比例同樣為4∶6時(shí)抑菌效果最佳，增效系數(shù)為0.635 9表現(xiàn)為相加作用。

3 討 論

本研究選用8種殺菌劑對(duì)橡膠樹炭疽菌進(jìn)行了菌絲生長抑制試驗(yàn)。結(jié)果表明，咪鮮胺、多菌靈、氟硅唑、戊唑醇、己唑醇、咪鮮胺·三唑酮6種藥劑對(duì)橡膠樹炭疽菌菌絲生長有顯著抑制活性，腈菌唑和粉唑醇對(duì)病原菌菌絲抑制效果較差，多數(shù)以三唑類為代表的麥角甾醇生物抑制劑對(duì)病原菌菌絲生長有明顯的抑制效果，這與麥角甾醇生物合成抑制劑的作用機(jī)理相關(guān)。有研究認(rèn)為麥角甾醇生物抑制劑對(duì)菌絲生長有顯著影響，但在本研究中，同為三唑類殺菌劑的粉唑醇和腈菌唑效果不佳，特別時(shí)尖孢復(fù)合種的EC50較大，抑制效果不明顯，且遠(yuǎn)不及其他三唑類殺菌劑。

蔡志英等[5]于2008年對(duì)采自云南的1株膠孢炭疽菌和1株尖孢炭疽菌進(jìn)行了6種藥劑的敏感性測定并進(jìn)行了比較，結(jié)果表明，膠孢炭疽菌與尖孢炭疽菌均對(duì)咪鮮胺最為敏感。曹學(xué)仁等[6]檢測了從海南省4個(gè)市縣分離獲得的23株橡膠膠孢炭疽菌和20株尖孢炭疽菌對(duì)咪鮮胺和多菌靈的敏感性，結(jié)果表明，供試菌株對(duì)多菌靈的EC50值分布在0.332 3～7.425 6 mg·L?1范圍內(nèi)，平均值為1.714 1 mg·L?1；對(duì)咪鮮胺的EC50值分布在0.009 1～0.113 3 mg·L?1范圍內(nèi)，平均值為0.036 8 mg·L?1。林春花等[7]測定了來自海南、云南、廣東和廣西4省22株橡膠樹膠孢炭疽菌和15株尖孢炭疽菌對(duì)咪鮮胺的敏感性，結(jié)果表明，供試的37株橡膠炭疽病菌菌株對(duì)咪鮮胺的EC50值為0.022 0～0.272 1 mg·L?1，平均為(0.061 7±0.055 4) mg·L?1。本研究中，尖孢炭疽菌對(duì)多菌靈的敏感性要顯著低于膠孢炭疽病菌，對(duì)咪鮮胺的敏感性與前人研究結(jié)果基本一致。此外，不同復(fù)合種對(duì)藥劑的敏感性存在一定的差異。例如，樂東炭疽、果生刺盤孢、暹羅炭疽和尖孢炭疽對(duì)多菌靈的平均EC50分別為0.528 7、0.426 0、0.348 2、1.131 5 mg·L?1。尖孢炭疽對(duì)戊唑醇、腈菌唑和氟硅唑的敏感性均顯著高于膠孢炭疽復(fù)合種。在同一中群內(nèi)，來自不同菌源地的菌株在對(duì)同一種藥劑的敏感性上，也會(huì)有一定的差異。本研究中，測定了來自海南、云南、廣東和廣西省膠孢炭疽和尖孢炭疽2個(gè)復(fù)合種內(nèi)7個(gè)種群對(duì)8種藥劑的敏感性，在前人的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步明確了不同種群炭疽病菌的藥劑敏感性。

咪鮮胺和戊唑醇均為高效、廣譜﹑低毒的殺菌劑。筆者選擇這2種藥劑進(jìn)行復(fù)配，研究其單劑和復(fù)配劑對(duì)病原菌菌絲生長的影響，采用Wadley法計(jì)算復(fù)配藥劑的增效系數(shù)，最終獲得了對(duì)橡膠樹炭疽菌菌絲生長表現(xiàn)出相加作用最優(yōu)復(fù)配組合。

橡膠樹炭疽病是常年流行在橡膠產(chǎn)區(qū)的主要病害之一，對(duì)膠乳的產(chǎn)量造成了嚴(yán)重的影響，多種殺菌劑交替使用可以緩解由于長期施用單一殺菌劑產(chǎn)生的抗藥性問題，延長殺菌劑的使用壽命。另外，戊唑醇的價(jià)格遠(yuǎn)低于咪鮮胺，二者復(fù)配能降低田間施藥成本。在使用化學(xué)藥劑開展田間橡膠炭疽病防治前，應(yīng)首先明確膠園中病原菌的種類及其比例，選擇合適的使用藥劑種類和使用濃度。本研究為橡膠樹炭疽病的科學(xué)用藥提供了理論支持，但在自然條件下﹐由于氣候、施藥時(shí)期和方式、藥劑與病原菌的接觸程度等因素，室內(nèi)毒力測定試驗(yàn)的結(jié)果往往與田間試驗(yàn)獲得的結(jié)果有一定偏差。因此，本研究篩選的單劑及復(fù)配藥劑組合還需田間試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。