裝載雞傳染性支氣管炎病毒 S1蛋白重組HD11細胞源外體的構建

謝 言，邢薿文，肖 倩，覃 堯

（海南大學 動物科技學院， ?？?570228）

外體(exosomes)是由細胞產(chǎn)生的直徑在30～100 nm的小囊泡狀結構[1]。外體表面和內(nèi)部可以攜帶多種物質，在細胞與細胞間以及各種蛋白質、脂類和核酸的細胞間扮演運輸工的角色[2]。目前，普遍用于標記外體結構的蛋白標記物包括CD63、CD81 和 TSG101等[2?3]。幾乎所有的細胞均可分泌外體并且廣泛存在于各類體液中[4]，隨體循環(huán)在體內(nèi)流動作用于鄰近的或者遠距離的受體細胞。研究發(fā)現(xiàn)包括活化的B淋巴細胞、樹突狀細胞以及巨噬細胞在內(nèi)的抗原呈遞細胞所分泌的外體都具有活化和調(diào)節(jié)免疫應答的功能[5]。這些抗原呈遞細胞分泌的外體攜帶 MHC-I、MHC-II和CD86 等誘導性共刺激分子（ICOS），并具有激活T細胞增殖的能力[6]。據(jù)此，有望利用抗原呈遞細胞分泌的外體作為多肽抗原的天然載體，制備成外體疫苗，激活機體產(chǎn)生針對該多肽的特異性免疫反應。

疫苗接種是預防與控制家禽疫病的重要手段。禽冠狀病毒—雞傳染性支氣管炎病毒(Infectious bronchins virus, IBV) ，是全球雞呼吸道疾病的主要病原體之一，給養(yǎng)雞業(yè)帶來嚴重的經(jīng)濟損失[7?9]。由于IBV血清型復雜多樣、抗體交叉保護力低，所以弱毒疫苗的使用無法有效控制感染并加劇病毒變異[10?11]。在防控此類傳染性疾病時，動物群體免疫亞單位疫苗等非復制性、無致病力的疫苗能夠在一定程度上提高疫苗接種的安全性[12]，但是亞單位疫苗免疫原性差，難以激活細胞免疫，因此不適用于初次免疫，其免疫效果還受免疫佐劑、免疫次數(shù)的明顯影響[13]。如果利用抗原呈遞細胞源外體激活細胞免疫的優(yōu)勢，在雞APC細胞的外體中裝載IBV病毒亞單位抗原，則可能有效提高多肽抗原的免疫原性。有研究報道了LPS刺激雞巨噬細胞系HD11細胞分泌的外體可作為佐劑增強細胞免疫反應[14]。此外，由于樹突狀細胞難以在體外穩(wěn)定傳代，而雞巨噬細胞已有可穩(wěn)定傳代的細胞系，并且B淋巴細胞的體外活化復雜于巨噬細胞。利用巨噬細胞的永生化細胞系開展外體疫苗的研發(fā)可能具有更好的應用性。

基于上述背景，本研究以雞巨噬細胞系HD11源外體作為研究對象，以IBV病毒中可誘導機體產(chǎn)生中和抗體的S1蛋白為模式抗原，構建裝載抗原的重組外體，并進一步對外體中S1蛋白的表達進行鑒定，以明確是否成功構建裝載抗原的重組外體。攜帶抗原的重組HD11源外體將作為重要的生物學材料，用于后續(xù)巨噬細胞源外體載體疫苗研發(fā)以及相應免疫應答機制的研究。

1 材料與方法

1.1 材料慢病毒包裝組分Lenti-Mix購于廈門生命互聯(lián)科技有限公司。慢病毒表達載體pCDHCMV-MCS-EF1- copGFP-T2A-puro購于廈門生命互聯(lián)科技有限公司。HEK293T細胞和雞源巨噬細胞HD11細胞系購于上海冠導生物工程有限公司。25 cm2懸浮細胞培養(yǎng)瓶購于NEST。DMEM/HIGH GLUCOSE培養(yǎng)基購于HyClone。Tissue RNA提取試劑盒購于天根生化科技有限公司。胎牛血清(FBS)購于Gibco?。Exosome-depleted FBS購于SBI。MEM Nonessential Amino Acid Solution購于北京索萊寶（Solarbio）科技有限公司。青霉素-鏈霉素 (10 000 U·mL?1)購于Solarbio。0.45 μmol·L?1濾器購于biosharp。Centrifuge Tubes購于Beckman Coulter。增強型RIPA裂解液購于博士德生物。SDS loading buffer購于Biotopped。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳試劑盒、聚偏二氟乙烯(PVDF)膜、脫脂奶粉、IBV標準陽性血清購于IDEXX。Tubulin抗體購于博士德生物。Rabbit monoclonal to CD63（Abcam）、Rabbit monoclonal to TSG101購于Abcam。Western Antibody Dilution Buffer購于Cwbio IT Group。辣根酶標記山羊抗小鼠IgG購于鼎國生物技術有限公司。辣根酶標記山羊抗兔IgG購于鼎國生物技術有限公司。辣根酶標記山羊抗雞IgG購于鼎國生物技術有限公司。ECL發(fā)光試劑購于博士德生物。

1.2 主要儀器超凈工作臺（SW-CJ-2D）購于蘇州凈化。高速離心機（Centrifuge 5 418 R）購于艾本德中國有限公司。電泳儀（DYY-6C）購于北京六一生物科技有限公司。凝膠成像儀（ChampChemi 500 Plus）購于浙江柏奧生物科技有限公司。熒光定量PCR儀（Q2000B）購于杭州朗基科學儀器有限公司。超速離心機（Optima L-100XP）購于Beckman Coulter。納米流式分析（Flow NanoAnalyzer）購于廈門福流公司。納米顆粒濃度分析（S/N 17-310）購于ZetaVIEW。

1.3 引物的設計與合成根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中IBV M41 S1基因序列（Genebank ID：AY561711）全基因合成不含信號肽（N端1~19位氨基酸）的S1基因，根據(jù)慢病毒表達載體pCDH-CMV-MCSEF1-copGFP-T2A-puro中多克隆位點選擇限制性酶切位點Xba?和BamH?，同時插入起始密碼子和終止密碼子，設計上游引物5′-TCTAGA（Xba?）GCCACCATGTTGTATGACAGTAGTTCTT-3 ′和下游引物5′-GGATCC（BamH?）TTATGTTCCATTA GTGATT-3′，以合成的S1基因為模板進行PCR反應，擴增產(chǎn)物全長為1 563 bp。全基因與引物合成于生工生物工程（上海）有限公司。

1.4 重組慢病毒表達載體的構建將目的基因S1通過限制性酶切位點構建到具有非組成型表達綠色熒光標簽蛋白的慢病毒表達載體pCDHCMV-MCS-EF1-copGFP-T2A-puro中，得到表達S1基因的慢病毒表達載體 pCDH-CMV-S1-MCSEF1-copGFP-T2A-puro。將重組慢病毒表達載體進行雙酶切鑒定，并將陽性克隆送至生工生物工程（上海）有限公司進行測序分析。

1.5 慢病毒包裝與病毒滴度測定將重組質粒pCDH-CMV-S1-EF1-copGFP-T2A-Puro和空載質粒pCDH-CMV-EF1-copGFP-T2A-Puro分別與Lenti-Mix混勻后配制成Lenti-Mix-DNA轉染體系，轉染HEK293T細胞，包裝重組慢病毒Lenti-S1和空載慢病毒Lenti。包裝72 h后收集慢病毒上清，經(jīng)過離心去除細胞，并用0.45 μmol·L?1孔徑過濾器過濾細胞碎片后，添加5 mL慢病毒濃縮液，混勻后4 ℃過夜處理，再經(jīng)過低溫高速離心濃縮慢病毒顆粒，最后用1 mL DMEM重懸慢病毒顆粒得到病毒液。用梯度稀釋法（10?1到10?5）稀釋病毒液，感染HEK293T細胞72 h 后，在倒置熒光顯微鏡下觀察并計數(shù)綠色熒光細胞數(shù)。病毒滴度( TU·mL?1) =綠色熒光細胞數(shù)量×病毒液稀釋倍數(shù)/病毒液體積。

1.6 篩選穩(wěn)定表達IBV S1蛋白的HD11細胞系將1.5中得到的病毒液（已計算好病毒滴度）感染HD11細胞，48 h后提取細胞總RNA進行qPCR檢測S1基因的RNA表達水平。為了實現(xiàn)IBV S1蛋白在HD11細胞中的穩(wěn)定表達用于后期大量提取重組外體，本研究使用慢病毒表達系統(tǒng)相應的篩選標記為GFP和嘌呤霉素抗性，以此可篩選出可穩(wěn)定表達外源基因的重組細胞HD11-S1。用本研究構建的重組慢病毒Lenti-S1感染HD11細胞。感染48 h后進行完全換液，向培養(yǎng)基中添加嘌呤霉素（2.5 μg·mL?1），間隔2 d換液，實時觀察綠色熒光蛋白GFP的表達情況，直到所有細胞均為GFP陽性細胞，篩選停止，即獲得穩(wěn)定表達細胞系。

1.7 細胞培養(yǎng)及外體的分離將穩(wěn)定表達細胞系進行擴大培養(yǎng)，待細胞密度至 70%～80%后，把培養(yǎng)基換成含2% 無外體胎牛血清DMEM/HIGH GLUCOSE培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，作用24 h后收集細胞培養(yǎng)上清。通過差速離心方式進行外體的提取。具體步驟：（1）將上清于4 ℃、3 000 r·min?1離心30 min后將上清液移至新的離心管中，于12 000 r·min?1、4 ℃條件下，離心45 min以去除較大的囊泡；（2）經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，收集過濾液得到的上清液；（3）將上清于4 ℃，120 000 r·min?1條件下離心70 min，得到外體沉淀[15]；（4）棄去上清，用10 mL預冷的1×PBS重懸后再次在4℃，120 000 r·min?1條件下，超速離心70 min，得到外體。將外體用150 μL預冷的1×PBS重懸，取20 μL以便后續(xù)電鏡與粒徑分析，剩余外體于?80 ℃保存。

1.8 外體的透射電鏡鑒定將1.3.5得到的外體取出10 μL滴加于銅網(wǎng)上沉淀1 min后用濾紙吸去浮液。磷鎢酸10 μL滴加于銅網(wǎng)上沉淀1 min后用濾紙吸去浮液。常溫干燥5分鐘后100 kv進行電鏡檢測成像，獲得透射電鏡成像結果。

1.9 外體的粒徑分析與納米顆粒濃度測定取10 μL外體樣本于25 ℃水浴解凍，用10 μLPBS進行稀釋（v∶v=1∶1），直接用于粒徑大小檢測和納米顆粒濃度分析，剩余外體于?80 ℃下保存。

1.10 蛋白免疫印跡分析（Western Blot）通過Western Blot鑒定獲得重組外體中的S1蛋白以及外體標志蛋白的表達。將離心收集的外體(或微囊泡體)沉淀用RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑與磷酸酶抑制劑）作用后，向樣品中加入5×SDS loading buffer上樣緩沖液，100 ℃條件下熱變性10 min使蛋白充分變性。蛋白變性后，將其加到10%的聚丙烯酰胺凝膠中進行電泳分離。將聚丙烯酰胺凝膠轉移(400 mA，1 h)到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，用5%脫脂奶粉（TBST稀釋）室溫封閉1 h或4 ℃過夜孵育。然后將膜與兔IgG初級抗體（抗體稀釋液稀釋）室溫孵育1 h或4 ℃過夜孵育，用于CD63和TSG101鑒定，洗脫一抗后進行對應二抗IgG（5%脫脂奶粉TBST稀釋）室溫孵育30 min，洗脫后用ECL發(fā)光試劑對條帶進行化學發(fā)光檢測。

2 結 果

2.1 重組慢病毒表達載體的構建利用全基因合成技術，將S1基因克隆到具有非組成型表達綠色熒光標簽蛋白的慢病毒表達載體pCDH-CMVMCS-EF1-copGFP-T2A-puro中，獲得重組表達載體pCDH-CMV-S1-MCS-EF1-copGFP-T2A-puro。通過雙酶切鑒定（圖1）可見特異性目的條帶，片段大小與預期相符，且測序結果正確，即用于重組慢病毒包裝的表達載體構建成功。

圖1 重組慢病毒表達載體的雙酶切鑒定

2.2 慢病毒包裝與病毒滴度測定將重組慢病毒Lenti-S1和空載體慢病毒Lenti分別感染HEK293T細胞72 h后，在40倍目鏡視野下的觀察結果（圖2） 顯示細胞表面、間隙均無細菌顆?；蚪z狀異物，無任何細菌、真菌污染現(xiàn)象。測定Lenti-S1病毒滴度為3×108(TU·mL?1)，空載體病毒滴度為5×108(TU·mL?1)。

圖2 慢病毒感染HEK293T細胞后的熒光成像

2.3 穩(wěn)定表達IBV S1蛋白的HD11細胞系的篩選將慢病毒Lenti、Lenti-S1以5×109TU·mL?1滴度分別感染HD11細胞，12 h后換液。感染48 h后，提取細胞總RNA進行qPCR檢測S1基因的RNA表達水平（圖3）。如圖3-A所示在重組慢病毒Lenti-S1的HD11細胞中可檢測到S1基因的表達。由于慢病毒載體表達非融合型的EGFP熒光蛋白和嘌呤霉素抗性基因，因此可通過流式細胞術篩選表達綠色熒光蛋白的陽性細胞或利用嘌呤霉素加壓篩選出被慢病毒改造的重組HD11細胞系。應用抗生素嘌呤霉素（2.5 μg·mL?1）加壓篩選后，采用熒光顯微鏡觀察EGFP熒光蛋白表達。如圖3-B所示，細胞均發(fā)出綠色熒光，即獲得經(jīng)慢病毒改造后的穩(wěn)定細胞系。筆者將表達S1蛋白的HD11細胞系命名為HD11-S1。

圖3 穩(wěn)定表達IBV S1蛋白的HD11細胞系

2.4 外體的提純與鑒定經(jīng)過嘌呤霉素篩選后的穩(wěn)定重組細胞系HD11-S1擴大培養(yǎng)，使用超速離心分離方法分離HD11細胞外體。如圖4所示，其形態(tài)符合外體在透射電鏡中的結構特點，即一側凹陷的半球型；測定外體的粒徑范圍為70～80 nm，符合外體粒徑的30～150 nm范圍。

圖4 外體的提純與鑒定

2.5 外體中重組蛋白以及標志蛋白的表達驗證通過Western blot進行外體蛋白標志物檢測。從圖5可知，所制備的外體樣本中CD63、TSG101呈高表達且未檢測到Tubulin蛋白，符合外體的蛋白標志物分布特點。通過IBV標準陽性血清檢測細胞或外體中載入抗原S1蛋白的結果表明，HD11-S1細胞與HD11正常細胞（Nor）以及感染慢病毒空載體HD11細胞（NC）的細胞總蛋白裂解液中均未能直接檢測到抗原S1蛋白的表達，但在HD11-S1細胞分泌的外體有S1蛋白的表達。S1蛋白分子量大小約60 kDu，由于S1蛋白存在糖基化修飾位點，糖基化S1蛋白大小預測值為98 kDu，與檢測到的主帶大小一致。此外，由于一抗使用的是IBV陽性血清，屬于多克隆抗體，因此可檢測到130 kDu的蛋白可能是S1蛋白的多聚物或者糖基化程度更高的結構。

圖5 外體的Western Blot鑒定

3 討 論

抗原呈遞細胞（APC）源外體的膜組分中包括了主要組織相容性復合體（MHC-I和 MHC-II）、誘導性共刺激分子 B7 等。因此，當 APC 經(jīng)抗原致敏后，其分泌的外體同樣攜帶了抗原肽-MHC 復合體，可直接供給相應的 CD4+T 和 CD8+T 淋巴細胞識別。并且，這些外體可被巨噬細胞、樹突狀細胞等 APC 本身攝取而發(fā)生交叉抗原呈遞[16]。目前，有多種方法可制備裝載抗原的APC源外體。例如，從病原感染動物的骨髓、外周血或脾臟分離APC進行體外培養(yǎng)，從培養(yǎng)液中分離與純化外體；也可從動物體內(nèi)分離APC后在體外培養(yǎng)的條件下，用病原感染或抗原致敏細胞再從培養(yǎng)液中分離得到外體。

為了探究裝載病毒蛋白的外體功能，需要分離純化得到無病毒顆粒殘留的外體。由于病毒的粒徑大小范圍與外體接近，因此采用上述2種方法均需通過免疫磁珠法分離外體去除殘留的病毒。然而免疫磁珠法分離提取外體產(chǎn)量低且成本高昂，但缺少適用于家禽細胞外體提取的商品化免疫磁珠方法。有數(shù)據(jù)證實在病毒感染細胞分泌的外體中能檢測到病毒蛋白或病毒粒子。例如，禽白血病病毒ALV-J亞型感染的細胞分泌的外體中可檢測到病毒gag和env蛋白[17]，從而促進病毒介導的免疫抑制，或者在禽網(wǎng)狀內(nèi)皮增生病毒感染的精子分泌的外體中也可檢測到病毒蛋白的存在[18]；在新型冠狀病毒感染的宿主體液循環(huán)中的外體中也可檢測到SARS-CoV-2的S蛋白表達[19]，而IBV與SARS同屬冠狀病毒科，病毒組成與結構相似。據(jù)此筆者推測，在細胞中表達的IBV病毒S蛋白也可被裝載入外體中。本研究選擇采用慢病毒過表達系統(tǒng)以達到在抗原呈遞細胞系HD11中表達IBV病毒S1蛋白的目的，由于慢病毒包裝系統(tǒng)所產(chǎn)生的假病毒屬于復制缺陷型病毒，重組慢病毒僅保留感染細胞以及在細胞中表達攜帶外源基因的能力，但不會在宿主細胞中復制，所以，采用該方法可避免在外體提取過程中混入病毒，同時滿足模擬病毒感染抗原呈遞細胞以及實現(xiàn)病毒蛋白在細胞中的表達。

巨噬細胞通過吞噬作用清除其環(huán)境中的病原體，在先天性和適應性免疫反應中發(fā)揮重要的功能，而巨噬細胞中的蛋白酶體是巨噬細胞完成內(nèi)源性抗原呈遞和調(diào)控下游免疫應答和炎癥反應的重要部分[20]。在本研究構建的重組HD11細胞中檢測到了mRNA的表達，但用IBV陽性血清進行蛋白免疫分析時未檢測到S1蛋白水平的表達。筆者認為可能在細胞中表達的S1蛋白被免疫蛋白酶體識別而被剪切成短肽，因此在Western Blot中無法檢測到目的蛋白大小的條帶。由此推測在外體形成的過程中，可以保護載入外體的病毒蛋白，免受巨噬細胞蛋白酶體通路的降解。這可能是病毒蛋白逃逸免疫識別的一種方式，值得進一步研究。

本研究利用透射電鏡觀察到的形態(tài)符合外體在透射電鏡中的結構特點(圖4-A)。同時，用納米流式檢測技術測定外體的粒徑范圍為70～80 nm，符合外體粒徑的30～150 nm范圍（圖4-B）。用蛋白免疫印跡方法，從重組外體純化產(chǎn)物中可檢測到病毒蛋白S1以及外體標志蛋白CD63，TSG101的表達，同時并未檢測到細胞骨架蛋白Tubulin的表達，從而排除細胞組分殘留的影響。此外，在重組外體中檢測到S1蛋白分子量大小在100 kDu左右（圖5），大于預測分子量56 kDu。這是由于S1蛋 白 中 有17個 糖 基 化 位 點（Asn-X-Ser/Thr，X可為脯氨酸的任一氨基酸)，經(jīng)完全糖基化后的分子量為98 kDu[21]。而根據(jù)已有報道，通過原核或者真核表達載體所表達的重組IBV S1蛋白的分子量均小于98 kDu[22?24]。綜上所述，本研究成功純化到攜帶IBV S1抗原的HD11源外體，并且該外體中表達的S1抗原具有高度糖基化修飾，與病毒感染過程中S1蛋白的天然構象接近。本研究結果可為今后應用雞源巨噬細胞分泌的外體作為抗原載體的相關禽病疫苗研發(fā)提供重要的參考數(shù)據(jù)。