巴西橡膠樹(shù)雄性不育相關(guān)候選基因HbXTH23的表達(dá)

劉紅東，黨一敏，王 英，高和瓊，莊南生

（1. 海南大學(xué) 熱帶作物學(xué)院，?？?570228; 2. 中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院 橡膠研究所, ?？?571101）

雄性不育（Male sterility）是存在于植物界中的一種普遍現(xiàn)象，它是指植物在有性繁殖過(guò)程中雄蕊非正常生長(zhǎng)，自身不能產(chǎn)生有效花粉，但是雌蕊能正常發(fā)育受精[1]。目前研究人員已經(jīng)在蘿卜（Raphanus sativusL.）[2]、水稻（Oryza sativaL.）[3]、西瓜[Citrullus lanatus(Thunb.) Matsum. et Nakai][4]等多個(gè)品種或種間雜交品種中發(fā)現(xiàn)雄性不育現(xiàn)象，并開(kāi)展了育種工作[5?6]。橡膠樹(shù)存在雄性不育的現(xiàn)象，橡膠樹(shù)育種主要采用雜交育種法，大面積推廣種植的橡膠樹(shù)品種幾乎都是通過(guò)雜交選育獲得的。雜交育種主要采用人工授粉的方式進(jìn)行，普遍采用“雄蕊塞入法”。人工授粉耗費(fèi)大，工序繁雜，加之橡膠樹(shù)坐果率低（一般 5%～8%，最高不超過(guò) 10%），雖然每個(gè)雜交組合授粉數(shù)量超過(guò)2 000 朵，但真正獲得可用于后續(xù)選育的雜交種子非常少。因此，由于雜交種子少，選育范圍狹窄，橡膠樹(shù)選育效率不高[7?10]。云南省熱帶作物科學(xué)研究所利用親本雄性不育和雌性不育的特性，通過(guò)建立橡膠樹(shù)自然雜交授粉園獲得了大量雜交種子，擴(kuò)大了篩選范圍，通過(guò)授粉園獲得的橡膠樹(shù)自然雜交種子培育出了‘云研 77-2 ’和‘云研 77-4 ’兩個(gè)大面積推廣的優(yōu)良品種[11]。然而，由于橡膠樹(shù)雄性不育相關(guān)機(jī)制方面的研究報(bào)道尚少，使得橡膠樹(shù)雄性不育種質(zhì)的有效利用受到了限制。

XTH木葡聚糖水解酶/內(nèi)轉(zhuǎn)糖苷酶(xyloglucan endotransglucosylase/hydrolase, XTH) 是重構(gòu)細(xì)胞壁的重要物質(zhì)，其機(jī)制是通過(guò)催化作用，使木葡聚糖分子斷裂和重連，對(duì)植物的纖維素-木葡聚糖結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾從而影響細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)[12]研究表明，XTH也參與花的發(fā)育，在花藥與花絲柱上發(fā)生作用；在轉(zhuǎn)錄水平上，XTH的表達(dá)受植物激素和環(huán)境因素的調(diào)控，在植物生長(zhǎng)和發(fā)育的很多方面調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育，同時(shí)不同的XTH對(duì)激素響應(yīng)存在明顯的差異[13?14]。在擬南芥中研究發(fā)現(xiàn)XTH23基因參與鹽脅迫下的側(cè)根的發(fā)育，其突變體對(duì)鹽脅迫有極高的敏感度，其次XTH23是通過(guò)關(guān)鍵的油菜素內(nèi)酯信號(hào)通路轉(zhuǎn)錄因子BES1被鹽誘導(dǎo)的，BES1直接作用于XTH23的上游以控制它們的表達(dá)，表明XTH23通過(guò)BES1途徑參與側(cè)根發(fā)育，并有助于側(cè)根對(duì)鹽的適應(yīng)[15]。據(jù)報(bào)道，在玉米中Zm-XTH23表達(dá)具有組織特異性，在幼莖中的表達(dá)量最高，且受到脫落酸 、NaCl以及PEG6000的誘導(dǎo)，在應(yīng)答非生物逆境脅迫中具有重要作用[16]，GmXTH23在大豆各組織中皆有表達(dá)，在莖中的表達(dá)量最高；與野生型擬南芥相比，擬南芥中過(guò)表達(dá)GmXTH23基因使得擬南芥在干旱脅迫下的耐受性增強(qiáng)，同時(shí)在干旱脅迫下GmXTH23通過(guò)提高脯氨酸與超氧化物歧化酶含量，并降低植物細(xì)胞在脅迫下的損傷來(lái)提高植物的抗旱性[17]。在荔枝中花穗發(fā)育不同時(shí)期LcXTH基因家族表達(dá)存在差異，LcXTH23表達(dá)量較高，推測(cè)其在花穗發(fā)育中起關(guān)鍵作用[18]。

筆者所在的課題組在前期轉(zhuǎn)錄組分析篩選出了一系列與橡膠樹(shù)雄性不育相關(guān)的差異表達(dá)基因[19]，其中包括XTH23基因。本研究利用qRTPCR對(duì)HbXTH23基因在橡膠樹(shù)不同的組織器官及雄花不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)進(jìn)行分析，通過(guò)mRNA原位雜交(mRNA fluorescencein situhybridization,mRNA-FISH)技術(shù)明確HbXTH23在橡膠樹(shù)雄花中的特異性表達(dá)部位，以揭示HbXTH23基因在橡膠樹(shù)雄性不育的功能與作用，從分子水平分析橡膠樹(shù)雄性不育的機(jī)理，從而為橡膠樹(shù)雜交育種提供科學(xué)的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料雄花不育品種‘熱研93-114’和‘天任31-45’，雄花可育品種‘熱研7-33-97’和‘PR107’，均為5年以上樹(shù)齡的巴西橡膠樹(shù)種。‘熱研93-114’和‘天任31-45’品種采自國(guó)家橡膠樹(shù)種質(zhì)資源圃(儋州)；‘熱研7-33-97’品種采自中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗(yàn)場(chǎng)二隊(duì)(儋州)，PR107采自中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗(yàn)場(chǎng)一隊(duì)(儋州)。采集每個(gè)品種的幼嫩葉子、樹(shù)皮、膠乳、雌花和雄花，并于液氮中快速冷凍，放于?80 ℃保存?zhèn)溆谩＿x取‘熱研93-114’及‘熱研7-33-97’品種的新鮮雄花為樣本，使用RNase-Free的4%多聚甲醛固定液進(jìn)行固定，樣品固定1.5 h后用濃度為0.01 mol·L?1的磷酸緩沖液（pH 7.2）進(jìn)行沖洗。盡可能將固定液殘留液體沖洗干凈，然后分別用25%、50%和70%的酒精室溫下進(jìn)行脫水處理，每次需脫水處理5 min，處理后的樣品置于70%的酒精中，4 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 樣品總RNA的提取及cDNA的合成使用RNA提取試劑盒[TIANGEN（天根）, Cat.#DP441，多糖多酚植物總RNA提取試劑盒(離心柱型)]對(duì)巴西橡膠樹(shù)的雌花和雄花的RNA進(jìn)行提取，使用通用植物總RNA提取試劑盒[BioTeke(百泰克)Cat.#RP3301，植物總RNA提取試劑盒]對(duì)巴西橡膠樹(shù)的幼嫩葉子、皮和膠乳的RNA進(jìn)行提取，并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄后合成cDNA，用TaKaRa試劑盒反轉(zhuǎn)錄cDNA，?20℃下保存。（具體操作方法參照試劑盒說(shuō)明書(shū)）

1.3 熒光定量分析以合成的cDNA為模板，HbActin為內(nèi)參基因，HbActin_F：5′-gattccgttgccc agaagtc-3′, HbActin_R: 5′-caccactcagcacaatgttacc-3′,使用TaKaRa(寶生物) 試劑盒[Cat# RR820A, TB Green Premix Ex TaqTM II(Tli RNaseH Plus）]，以HbXTH23F: TCCAAAGAGCCAGCCAATG,HbXTH23R: TGTCTTCACAAGCCCACCC為引物，使用Bio-Rad伯樂(lè)PCR儀，采用兩步法進(jìn)行定量試驗(yàn)。每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù), 基因相對(duì)表達(dá)量用2-ΔΔCt法計(jì)算。用Origin 9.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理并作圖。

1.4 橡膠樹(shù)HbXTH23的原位雜交選取樣品新鮮雄花FAA固定液固定，梯度酒精脫水，并于70%酒精中保存?zhèn)溆?。制作石蠟切片，石蠟切片?biāo)本制備過(guò)程主要參考文獻(xiàn)[20]方法，并進(jìn)行封片備用。利用AlleleID 6.0軟件，通過(guò)基因的mRNA序列信息進(jìn)行探針設(shè)計(jì)，探針長(zhǎng)度在30~44 bp之間。在探針的5′末端含有5-FAM的熒光基團(tuán)(Carboxyfluorescein-5-succimidylester)為5′-FAMAATATATTTGTATGGAGAATATAAGGGTCT CCACTAAGAT-3′，在藍(lán)光的激發(fā)下，該熒光基團(tuán)可發(fā)出綠光。mRNA-FISH參照刁艷茹[21]的方法，通過(guò)熒光顯微鏡（型號(hào)為BX51TR-32FA1-A03）觀察，使用Image-Pro Plus 6.0軟件進(jìn)行圖像采集。

1.5 生物信息學(xué)分析通過(guò)在線工具對(duì)基因HbXTH23（LOC110641156、XM_021792777）進(jìn) 行分析。利用ExPASy ProtParam tool（http://web.expasy.org/protparam/）分 析HbXTH23的 理 化 性質(zhì)。利用ExPASy ProtScale（http://web.expasy.org/protscale/）分析HbXTH23氨基酸序列的親水性。利用ngLOC（http://genome.unmc.edu/ngLOC/index.html）和Plant-mPLoc（http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/）工具預(yù)測(cè) HbXTH23 蛋白的亞細(xì)胞定位情況，利用TMHMM Server v. 2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/)預(yù)測(cè)HbXTH23基因氨基酸序列的跨膜結(jié)構(gòu)，氨基酸序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)使用SOPMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html），三 級(jí) 結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)使用SWISS-MODEL（https://swissmodel.expasy.org/），用SignalP-5.0 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)對(duì)信號(hào)肽進(jìn)行預(yù)測(cè)，利用MEGA構(gòu)建HbXTH23蛋白與其他植物的同源蛋白的進(jìn)化樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1RNA的提取提取的RNA進(jìn)行檢測(cè)顯示其OD260/OD280在1.9~2.1之間，表明RNA高質(zhì)量，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄為cDNA經(jīng)電泳檢測(cè)條帶清晰。

2.2HbXTH23基因表達(dá)模式分析利用qRTPCR技術(shù)對(duì)HbXTH23基因在橡膠樹(shù)雄性不育品種‘熱研93-114’、‘天任31-45’和可育品種‘熱研7-33-97’、‘PR107’的雄花、雌花、膠乳、幼嫩葉子及嫩皮中的表達(dá)量進(jìn)行分析。結(jié)果表明，HbXTH23基因在不育品種的雄花表達(dá)量明顯高于在可育品種雄花的表達(dá)量，也明顯高于在其他組織的表達(dá)量，而在膠乳中幾乎沒(méi)有表達(dá)（圖1）。

圖1 HbXTH23基因在不同器官組織中的表達(dá)分析

為了解HbXTH23基因在雄花發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)變化趨勢(shì)，本研究對(duì)HbXTH23在小孢子母細(xì)胞時(shí)期、四分體和單核小孢子時(shí)期3個(gè)發(fā)育階段雄花的表達(dá)量進(jìn)行了比較分析。選擇育種和生產(chǎn)中應(yīng)用較多的2個(gè)品種‘熱研93-114’(雄性不育)和‘熱研7-33-97’(雄性可育)做比較分析（圖2）。結(jié)果表明：HbXTH23基因在可育品種‘熱研7-33-97’中在小孢子母細(xì)胞時(shí)期、四分體和單核小孢子時(shí)期3個(gè)階段的變化呈現(xiàn)平緩上升的趨勢(shì)，3個(gè)時(shí)期表達(dá)量均比較低，變化差異不明顯；在不育品種‘熱研‘93-114’中，從小孢子母細(xì)胞時(shí)期到四分體時(shí)期表達(dá)量逐漸上升，在四分體時(shí)期達(dá)到最高。從四分體時(shí)期到單核小孢子時(shí)期表達(dá)量呈下降趨勢(shì)，在四分體時(shí)期的表達(dá)量高于同一時(shí)期的可育品種。該基因在不育品種與可育品種的四分體時(shí)期的表達(dá)差異最大，這表明該基因調(diào)控雄花不育主要在四分體時(shí)期。推測(cè)該基因在不育品種四分體時(shí)期的超高表達(dá)可能是導(dǎo)致橡膠樹(shù)雄性不育的原因之一。

圖2 HbXTH23基因在雄花不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)分析

2.3HbXTH23基因表達(dá)的RNA熒光原位分析對(duì)‘熱研93-114’(雄性不育)和‘熱研7-33-97’(雄性可育)四分體到單核小孢子時(shí)期的雄花進(jìn)行石蠟切片，利用mRNA-FISH技術(shù)對(duì)HbXTH23基因雄花不同細(xì)胞中的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明：不論是雄花不育品種還是可育品種，在花藥壁、花絲（柱）上均檢測(cè)到HbXTH23基因的表達(dá)（圖3）。這表明HbXTH23基因可能主要是在花絲（柱）、花藥壁中表達(dá)來(lái)調(diào)控雄花的發(fā)育，而在這些細(xì)胞中的異常表達(dá)可能導(dǎo)致了橡膠樹(shù)的雄性不育。

圖3 基因HbXTH23表達(dá)的原位分析

2.4HbXTH23基因的生物信息學(xué)分析

2.4.1HbXTH23基因編碼的蛋白理化性質(zhì)分析和亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析結(jié)果表明，HbXTH23蛋白有286個(gè)氨基酸，在已知的22個(gè)蛋白質(zhì)氨基酸中，除吡咯賴氨酸（Pyl，O)、硒半胱氨酸(Sec, U)沒(méi)有參與HbXTH23蛋白編碼外，其他氨基酸均參與了該蛋白的編碼，其中絲氨酸（Ser，S)含量較高占11.9%，組氨酸（His，H)最低占比1%（圖4）。蛋白分子量為31.95 kDa, 理論等電點(diǎn)7.62，總平均親水性GRAVY為?0.288，氨基酸序列密集分布在負(fù)值以下（圖5），為親水性蛋白。該蛋白不穩(wěn)定系數(shù)為31.96，蛋白不穩(wěn)定系數(shù)大于40為不穩(wěn)定蛋白，脂肪系數(shù)為73.01，熱穩(wěn)定性較好。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)其存在于細(xì)胞壁、細(xì)胞質(zhì)中。

圖4 HbXTH23的氨基酸組成

圖5 HbXTH23的疏水性曲線

2.4.2HbXTH23基因編碼的蛋白結(jié)構(gòu)分析HbXTH23氨基酸序列的跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果表明，HbXTH23氨基酸序列跨膜螺旋氨基酸殘基數(shù)量的期望值為15.50，蛋白前60個(gè)氨基酸中跨膜螺旋的氨基酸量的期望值為15.36，N-term位于膜細(xì)胞質(zhì)側(cè)的總概率0.468（圖6），不屬于跨膜蛋白。氨基酸序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果分析表明，HbXTH23氨基酸序列一共編碼286個(gè)氨基酸，形成α-螺旋（Alpha helix）的氨基酸有49個(gè)，占比為17.13%，形成延伸鏈的氨基酸（Extended strand）有85個(gè)，占比29.72%，17個(gè)氨基酸形成β-轉(zhuǎn)角（Beta turn），占比5.94%，形成無(wú)規(guī)則卷曲（Random coil）的氨基酸有135個(gè)，占比47.20%（圖7）。HbXTH23三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果（圖8）表明，HbXTH23蛋白的三維模型覆蓋了56.44%的蛋白序列，即161個(gè)氨基酸，可信度為92%。對(duì)HbXTH23基因編碼蛋白的信號(hào)肽預(yù)測(cè)結(jié)果（圖9）表明，HbXTH23具有信號(hào)肽且信號(hào)肽的剪切位點(diǎn)位于第26和第27號(hào)氨基酸之間。利用MEGA構(gòu)建HbXTH23蛋白與其他植物的同源蛋白的進(jìn)化樹(shù)（圖10）, 結(jié)果表明，HbXTH23蛋白與刺毛黧豆蛋白（Mucuna pruriensRDY03917.1）、煙 草 蛋 白（Nicotiana attenuataXP_019259007.1）親緣關(guān)系較近。

圖6 HbXTH23 蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)分析

圖7 HbXTH23蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

圖8 HbXTH23蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)分析

圖9 HbXTH23的信號(hào)肽預(yù)測(cè)

圖10 不同物種間XTH23蛋白的進(jìn)化樹(shù)分析

3 討 論

木葡聚糖內(nèi)轉(zhuǎn)糖苷酶/水解酶(xyloglucan endotransglucosylase/hydrolase, XTH) 是植物細(xì)胞壁重構(gòu)過(guò)程中的關(guān)鍵酶，是一種細(xì)胞壁松弛酶，在細(xì)胞壁木葡聚糖的斷裂和再生及細(xì)胞壁重構(gòu)中具有重要作用。XTH蛋白在植物細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中不僅能夠松弛細(xì)胞壁，而且參與細(xì)胞壁合成，能夠強(qiáng)化細(xì)胞壁，還具有降解細(xì)胞壁功能作用。通過(guò)對(duì)萵苣和黃瓜下胚軸、豌豆節(jié)間，大麥葉伸長(zhǎng)生長(zhǎng)的過(guò)程[22?23]，以及對(duì)獼猴桃、番茄等果實(shí)的成熟軟化，浸水誘導(dǎo)的玉米通氣組織的形成[24?26]的研究，發(fā)現(xiàn)XTH參與細(xì)胞壁的降解過(guò)程。YOKAYAMA等[27]研究表明XTH 基因可響應(yīng)脫落酸、油菜內(nèi)脂、生長(zhǎng)素等植物激素，轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)，說(shuō)明 XTH可能參與植物激素對(duì)生長(zhǎng)的促進(jìn)作用。HE等[28]研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥AtXTH23基因的表達(dá)水平在脫落酸ABA處理下顯著上調(diào),在擬南芥中油菜素甾醇BR通過(guò)增加X(jué)ET表達(dá)量調(diào)控細(xì)胞壁伸長(zhǎng)。以上前人研究結(jié)果表明，不同的XTH基因影響植物激素機(jī)制不同。本研究中，HbXTH23基因在橡膠樹(shù)雄性不育的雄花中表達(dá)上調(diào)，該基因的高表達(dá)可能對(duì)脫落酸和油菜內(nèi)脂等激素的信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)產(chǎn)生影響。在不育品種的雄花表達(dá)量明顯高于在可育品種雄花的表達(dá)量而且也明顯高于在其他組織的表達(dá)量，但在膠乳中幾乎沒(méi)有表達(dá)。橡膠樹(shù)膠乳是其韌皮部乳管在受到傷害脅迫后排出的液體細(xì)胞質(zhì)，乳管的一個(gè)重要功能是合成和儲(chǔ)存天然橡膠，而本研究中該基因并未在膠乳中表達(dá)。該基因是否是在膠乳合成中或是在乳管中及其他與膠乳相關(guān)的組織中起作用需要進(jìn)一步研究。

雄性不育的發(fā)生受到多種因素影響，其中花粉壁及花絲（柱）的異常均會(huì)導(dǎo)致雄性不育。在對(duì)蘿卜的研究中發(fā)現(xiàn)不育花的花藥干癟, 瘦小、無(wú)粉、呈白色或乳白色, 且花柱大多彎曲，花絲縮短,花藥大小有變化[29]，擬南芥突變體ms1、dex1、nef1、rpg1、npu、efd和arf17都能造成花粉壁缺失進(jìn)而導(dǎo)致花粉壁發(fā)育異常引起雄性不育[30]。在水稻中突變體wda1造成花藥壁角質(zhì)蠟層消失，小孢子發(fā)育遲緩，導(dǎo)致花藥壁發(fā)育異常，最終導(dǎo)致雄性不育發(fā)生[31]。在水稻中不育系的漿片中的維管束數(shù)目少，缺少導(dǎo)管，花絲中無(wú)導(dǎo)管,細(xì)胞自溶慢，這可能是不育系開(kāi)穎遲、閉穎慢，花絲伸長(zhǎng)少及不易萎縮的主要原因[32]。在擬南芥中發(fā)現(xiàn)T-DNA插入突變體Salk_118 481株系的群體中, 篩選到1株雄性不育突變體，該突變體由基因FNE控制，通過(guò)花絲不能伸長(zhǎng)完成授粉造成雄性不育[33]。本研究通過(guò)對(duì)HbXTH23基因的原位分析，發(fā)現(xiàn)該基因在花藥壁及花絲（柱）上有表達(dá)，表明該基因在花絲柱與花藥壁的表達(dá)異常可能是造成雄花敗育的原因之一。HbXTH23蛋白的理化性質(zhì)、親疏水性、信號(hào)肽、跨膜結(jié)構(gòu)及蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)顯示HbXTH23編碼286個(gè)氨基酸,為疏水蛋白，具有信號(hào)肽，屬于不跨膜蛋白，與刺毛黧豆蛋白、煙草蛋白的親緣關(guān)系較近。本研究結(jié)果可為橡膠樹(shù)雄性不育分子機(jī)制的研究提供參考，并為橡膠樹(shù)的育種工作提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。