引導編輯：突破堿基編輯類型的新技術(shù)

劉堯，周先輝，黃舒泓，王小龍

綜 述

引導編輯：突破堿基編輯類型的新技術(shù)

劉堯，周先輝，黃舒泓，王小龍

西北農(nóng)林科技大學，動物科技學院/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動物生物育種國際聯(lián)合研究中心/陜西省動物遺傳育種與繁殖重點實驗室，楊凌 712100

引導編輯技術(shù)(prime editing)是一種基于CRISPR/Cas系統(tǒng)的新型基因編輯技術(shù)。引導編輯器(prime editor, PE)的效應蛋白是逆轉(zhuǎn)錄酶與具有單鏈切割活性的nCas9(H840A)的融合蛋白，被稱為PE2；其向?qū)NA是通過在sgRNA的3′末端增加逆轉(zhuǎn)錄模板和引物結(jié)合位點序列構(gòu)成，被稱為pegRNA。PE系統(tǒng)可以實現(xiàn)所有12種類型的堿基突變，還可以實現(xiàn)短的插入刪除編輯，及多種編輯類型的組合。自2019年被開發(fā)以來，因其編輯類型多樣化及高特異性等優(yōu)勢，PE已經(jīng)被成功地應用在多種動植物及細菌中，同時在基因治療和農(nóng)業(yè)育種等領(lǐng)域也展現(xiàn)出良好的應用前景。本文對PE系統(tǒng)的開發(fā)過程、特點、優(yōu)化、應用、安全風險等方面進行了系統(tǒng)介紹，并對其發(fā)展前景進行了展望，以期有助于相關(guān)領(lǐng)域研究人員對PE系統(tǒng)的了解與應用。

引導編輯器；CRISPR/Cas9；優(yōu)化；應用

經(jīng)過近10年的發(fā)展，基于CRISPR的基因編輯技術(shù)因其精準性和高效性已經(jīng)被廣泛應用于基因組的修飾[1～3]。CRISPR/Cas9系統(tǒng)通過在基因組上誘導雙鏈斷裂損傷(double strand break, DSB)來實現(xiàn)靶位點的編輯[1]。細胞修復DSB的方式主要有兩種：非同源末端連接(non-homologous end joining, NHEJ)和同源重組(homology directed repair, HDR)[4]。細胞通過NHEJ修復DSB會隨機產(chǎn)生堿基的插入或缺失，造成基因的移碼突變，從而實現(xiàn)基因敲除[1]。細胞通過HDR修復時需要DNA片段作為修復模板，此時可以提供人為設計的外源DNA模板，從而在基因組上引入包括點突變、插入、刪除等在內(nèi)的基因修飾[1]。細胞傾向于利用NHEJ來修復DSB，造成HDR的效率偏低，因此CRISPR/Cas9系統(tǒng)無法高效地誘導點突變等編輯類型[4]。

為此，美國哈佛大學David R. Liu課題組于2016年首次開發(fā)出胞嘧啶堿基編輯器(cytosine base editor, CBE)[2]。他們將大鼠胞嘧啶脫氨酶、nCas9(D10A)和尿嘧啶糖基化酶抑制劑(uracil glycosylase inhibitor, UGI)進行融合表達，該融合蛋白可以在sgRNA的引導下靶向基因組目標位點，催化其解旋形成R-loop結(jié)構(gòu)，從而暴露出單鏈DNA，胞嘧啶脫氨酶催化一定窗口內(nèi)單鏈DNA上的胞嘧啶(C)脫氨形成尿嘧啶(U)，隨著DNA的復制或修復，最終轉(zhuǎn)化為胸腺嘧啶(T)?；陬愃频乃悸?，David R. Liu課題組又于2017年開發(fā)了腺嘌呤堿基編輯器(adenosine base editor, ABE)，這一工具可以完成腺嘌呤(A)向鳥嘌呤(G)的轉(zhuǎn)換[3]。CBE和ABE可以實現(xiàn)堿基之間的轉(zhuǎn)換，但還不能實現(xiàn)堿基間的顛換[2,3,5]；同時，小片段的插入刪除編輯也缺乏高效編輯工具，更為全面有效的基因編輯工具的開發(fā)成為必然。

2019年，引導編輯器(prime editor, PE)的出現(xiàn)將精準基因組編輯推到新的高度[6]。PE系統(tǒng)通過對靶位點的“搜索”和“替換”，可以實現(xiàn)4種堿基之間的任意變換及小片段的精準插入和刪除，克服了CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導的HDR效率低和堿基編輯系統(tǒng)不能實現(xiàn)堿基顛換的弊端，具有明顯的優(yōu)勢[6,7]。PE系統(tǒng)目前已被廣泛地應用到農(nóng)業(yè)、基因治療、疾病模型構(gòu)建等多個研究領(lǐng)域[8～11]。2019年，發(fā)表PE系統(tǒng)的論文被雜志評為年度十大杰出論文。本文將對PE系統(tǒng)的開發(fā)過程、特點、優(yōu)化、應用、安全風險等進行系統(tǒng)介紹，并對其發(fā)展前景進行展望，從而增進人們對PE系統(tǒng)的了解，促進其應用。

1 PE系統(tǒng)的開發(fā)及特點

1.1 PE系統(tǒng)的開發(fā)

PE系統(tǒng)的核心包括效應蛋白及pegRNA兩部分[6]。效應蛋白是逆轉(zhuǎn)錄酶與具有單鏈切割活性的nCas9 (H840A)的融合蛋白，被命名為PE2蛋白[6]。pegRNA是在sgRNA的基礎上，對其3′端進行延長，增加逆轉(zhuǎn)錄模板(reverse transcriptase templates, RTT)和引物結(jié)合位點(primer binding site, PBS)。RTT序列攜帶人為設計的遺傳信息，而PBS序列是逆轉(zhuǎn)錄引物的結(jié)合位點[6]。引導編輯的核心原理可分為3步：第一步是PE2蛋白的靶向及切割，即PE2蛋白在pegRNA的引導下，靶向基因組目標位點，催化其解旋，形成R-loop結(jié)構(gòu)，從而暴露出單鏈DNA，隨后nCas9在PAM上游第3個堿基處切割DNA單鏈使DNA游離；第二步是逆轉(zhuǎn)錄反應，即游離的單鏈DNA與PBS堿基互補，起始逆轉(zhuǎn)錄反應，逆轉(zhuǎn)錄酶以RTT為模板，合成新的單鏈DNA[6]；第三步是DNA的修復，即新合成的單鏈DNA形成3′-flap，與原有的5′-flap進行競爭，細胞中的DNA修復機制傾向切除5′-flap，隨后，3′-flap在DNA連接酶的作用下，被整合進基因組，形成帶有錯配的DNA雙鏈；內(nèi)源DNA修復機制識別此錯配并以被編輯鏈為模板，修復未編輯鏈，從而實現(xiàn)雙鏈的編輯[6](圖1)。

2019年，David R. Liu課題組首次建立了3個版本的PE系統(tǒng)[6]。第一代PE系統(tǒng)PE1是由野生型的M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶與具有單鏈切割活性的nCas9 (H840A)組成[6]。PE1對點突變的編輯效率最高可達到5.5%，對于短的插入刪除的編輯效率在4%～17%之間[6]。為了提高PE系統(tǒng)的編輯效率，David R. Liu課題組在野生型逆轉(zhuǎn)錄酶上引入了5處突變來提高逆轉(zhuǎn)錄酶的熱穩(wěn)定性、反應的持續(xù)性、與DNA:RNA底物的親和性及抑制逆轉(zhuǎn)錄酶的RNaseH結(jié)構(gòu)域的活性，開發(fā)了第二代PE系統(tǒng)PE2[6]。相比于PE1，PE2將點突變的編輯編輯效率提高了1.6～5.1倍，同時對于短的插入刪除編輯也有了非常大的提高[6]。在PE2介導的基因編輯過程中，會存在一條鏈被編輯，一條鏈未被編輯的異源雙鏈狀態(tài)。在以往的堿基編輯系統(tǒng)開發(fā)過程中，為了提高編輯效率，David R. Liu課題組利用Cas9的單鏈切割活性在未編輯鏈上引入一個切口來促使DNA修復機制以編輯鏈為模板修復未編輯鏈，從而實現(xiàn)DNA的雙鏈編輯。基于此思路，David R. Liu課題組通過額外添加一條sgRNA來引入此切口，并將此三元系統(tǒng)命名為PE3[6]。如果額外添加的sgRNA在作用過程中其spacer序列與被編輯后的序列互補，則稱該系統(tǒng)為PE3b[6]，PE3和PE3b共同構(gòu)成了第三代PE系統(tǒng)。由于成功被編輯的鏈才能被sgRNA靶向，所以PE3b可以降低在DNA鏈上同時出現(xiàn)兩個切口的概率，從而減少DSB的形成和indels的產(chǎn)生。與PE2相比，PE3和PE3b將編輯效率提高了約3倍[6]。

圖1 PE工作原理圖

PE系統(tǒng)主要通過3步在基因組靶位點引入基因修飾：PE2蛋白的靶向及切割、逆轉(zhuǎn)錄反應和DNA的修復。

1.2 PE系統(tǒng)的特點

PE系統(tǒng)相比原有的基于CRISPR/Cas9的基因編輯工具優(yōu)勢十分明顯，其主要特點可歸結(jié)如下：

(1)編輯類型的多樣化。PE系統(tǒng)可以實現(xiàn)所有12種類型的堿基突變，還可以實現(xiàn)小片段插入刪除編輯，及多種編輯類型的組合，研究人員可以根據(jù)目標突變設計相應的pegRNA來進行靶位點的編輯[6]。

(2)編輯的高精準性。相較于CRISPR/Cas9系統(tǒng)通過HDR途徑引入點突變和插入刪除，PE系統(tǒng)不依賴DSB的產(chǎn)生，避免了過多indels產(chǎn)物。另外堿基編輯系統(tǒng)在作用過程中，常常會引起鄰近非靶標堿基的編輯，而PE系統(tǒng)通過逆轉(zhuǎn)錄生成目標突變，避免了這種副產(chǎn)物的產(chǎn)生。對于PE3來說，雖然另一條sgRNA的引入造成了indels產(chǎn)物的增加，但indels的水平大多在10%以下，仍然保持了較高的精準性[6]。

(3)編輯的高特異性。以往的CRISPR/Cas9系統(tǒng)和堿基編輯系統(tǒng)均存在sgRNA依賴性脫靶，此外堿基編輯系統(tǒng)還存在sgRNA非依賴性脫靶和RNA脫靶，造成了很大的安全風險。PE系統(tǒng)在基因組靶位點上引入目標編輯過程中，需要發(fā)生3種核酸雜交：靶向區(qū)域DNA與pegRNA的spacer的雜交、靶向區(qū)域DNA與pegRNA的PBS序列的雜交、靶向區(qū)域DNA與逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的雜交，以上3種雜交的存在決定了PE系統(tǒng)在理論上很難脫靶[6]。

2 PE系統(tǒng)的優(yōu)化及其衍生技術(shù)

PE系統(tǒng)雖然優(yōu)勢明顯，但其早期版本的編輯效率均較低，極大地限制了其應用。目前，已經(jīng)有許多研究從pegRNA[12～17]、PE2蛋白[18～22]、靶向范圍[23]、DNA修復通路[20,24,25]等方面對其進行優(yōu)化，使其效率得到了極大提升(表1)。此外，還有研究在PE系統(tǒng)基礎上加以改造，建立了新的具有特殊編輯能力的新系統(tǒng)[26～29]。

2.1 pegRNA的優(yōu)化

pegRNA是PE系統(tǒng)的核心部分之一，其結(jié)構(gòu)及穩(wěn)定性對引導編輯效率有重要影響(圖2)[6]。David R. Liu課題組發(fā)現(xiàn)pegRNA的PBS和RTT長度會影響引導編輯效率，他們建議對PBS及RTT長度進行測試以便于找到最優(yōu)pegRNA[6]。本課題組發(fā)現(xiàn)pegRNA的PBS與spacer發(fā)生互補會導致pegRNA環(huán)化，進而影響Cas9的靶向效率，于是在pegRNA的3′末端添加RNA莖環(huán)結(jié)構(gòu)來抑制此互補，顯著提高了PE系統(tǒng)的編輯效率；隨后結(jié)合Csy4蛋白RNA加工系統(tǒng)，本課題組開發(fā)了增強型PE系統(tǒng)ePE，最高可平均提高4.9倍的編輯效率[12]。Nelson等[15]發(fā)現(xiàn)pegRNA 3′末端的降解會降低PE系統(tǒng)的活性，他們將結(jié)構(gòu)化RNA基序融合到pegRNA的3′末端，以防止3′末端的降解增強其穩(wěn)定性，由此產(chǎn)生了工程化pegRNA (epegRNA)；在多種細胞系中，epegRNA可將引導編輯效率提高3～4倍。類似地，本課題組[13]和Li等[14]分別將具有穩(wěn)定二級結(jié)構(gòu)的xrRNA和G-四鏈體融合到pegRNA的3′末端構(gòu)建了xrRNA-pegRNA和G-四鏈體修飾pegRNA，基于這兩種pegRNA的PE系統(tǒng)分別被命名為xrPE和G-PE；xrPE和G-PE均有效提高了引導編輯效率，且效果與epegRNA相當。Li等[30]分別通過在pegRNA的RTT上引入同義突變和改變pegRNA二級結(jié)構(gòu)構(gòu)建了spegRNA和apegRNA，二者將PE效率分別平均提高353倍和2.77倍。在植物上，Jiang等[16]通過增強pegRNA的表達在玉米上實現(xiàn)了比在水稻中更高的編輯效率。此外，有研究指出在合成的pegRNA上增加化學修飾可能會提高pegRNA的穩(wěn)定性，從而提高引導編輯效率[31]。

表1 各種優(yōu)化版本的引導編輯器

圖2 不同pegRNA修飾示意圖

圖中展示6種對pegRNA的優(yōu)化方式，spacer、scaffold、RTT和PBS表示pegRNA的組成部分，Csy4 recongnition site、xrRNA、G-quadruplexes和pseudoknot表示具體特殊二級結(jié)構(gòu)的RNA序列，SSMs表示RTT編碼的DNA為同義突變。

PE3系統(tǒng)需要另一條sgRNA來在非編輯鏈引入切口，研究人員通過使用另一條pegRNA來替代這條sgRNA，即雙pegRNA策略。其中，Lin等[32]通過優(yōu)化pegRNA的PBS的解鏈溫度及使用兩條pegRNA來編碼反向互補的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在水稻中引入目標突變，將編輯效率最高提升了17.4倍。Zhuang等[17]使用配對的pegRNA開發(fā)了HOPE系統(tǒng)，HOPE顯示出比PE2和PE3系統(tǒng)更高的編輯效率，并且具有比PE3更高的編輯產(chǎn)物純度。

2.2 效應蛋白的優(yōu)化

效應蛋白是PE系統(tǒng)的另一個核心組成部分，對其進行精心設計改良是優(yōu)化PE系統(tǒng)的另一種途徑，且優(yōu)化的方向主要有3個方面。一是融合表達相關(guān)功能元件；將PE2蛋白分別與染色質(zhì)調(diào)節(jié)肽(CMPs)、Rad51蛋白的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域、c-Myc NLS融合表達構(gòu)建的PE2蛋白變體均可有效提高引導編輯效率[18,19,33]；此外，Zong等[22]通過去除逆轉(zhuǎn)錄酶的RNase H結(jié)構(gòu)域并添加具有核酸伴侶活性的病毒核衣殼蛋白來優(yōu)化逆轉(zhuǎn)錄酶，將引導編輯效率平均提高了5.8倍，且不會增加副產(chǎn)物和脫靶編輯。二是對效應蛋白序列和結(jié)構(gòu)的優(yōu)化；David R. Liu課題組通過對逆轉(zhuǎn)錄酶進行人類密碼子優(yōu)化、在SpCas9上引入兩個可以提高其活性的R221K和N394K突變、在C端添加c-Myc NLS序列和將nCas9和RT之間連接肽中的XTEN換成SV40 NLS得到了具有高度普適性的PEmax蛋白，經(jīng)過測試，PEmax顯著優(yōu)于已報道的包括利用c-Myc NLS構(gòu)建的PE2*在內(nèi)的其他變體，后續(xù)對效應蛋白的進一步改進均可在PEmax的基礎上進行[20]；Xu等[21]發(fā)現(xiàn)在nCas9 (H840A)的N端融合逆轉(zhuǎn)錄酶比現(xiàn)有的C端融合具有更高的編輯效率，于是他們使用N端融合逆轉(zhuǎn)錄酶的PE2蛋白結(jié)合含有多個堿基替換的逆轉(zhuǎn)錄模板在水稻和玉米上分別實現(xiàn)了最高達24.3%和6.2%的編輯[21]。三是對效應蛋白尺寸的優(yōu)化；PE2蛋白較大的尺寸會降低其遞送的效率，在兩項研究中，Liu等[34]和Zheng等[35]分別采取將nCas9(H840A)和逆轉(zhuǎn)錄酶分開表達和去除逆轉(zhuǎn)錄酶的RNase H結(jié)構(gòu)域的策略來減小蛋白尺寸，且未造成明顯的編輯效率損失。

2.3 拓展引導編輯的范圍

PE系統(tǒng)最初是基于識別NGG PAM的SpCas9進行開發(fā)的，雖然PE系統(tǒng)的編輯窗口決定了其對PAM的依賴性較低，但仍有部分位點缺乏設計pegRNA所需的PAM[6]。利用可以識別不同PAM的Cas9的變體或者同系物如SpCas9-VQR、SpCas9- VRQR、SpCas9-NG、SpCas9-SpRY、SaCas9等構(gòu)建PE，是一種很好的解決策略[23,33]。此外，Oh等[36]利用SpCas9的同系物FnCas9構(gòu)建了新的PE；SpCas9是在PAM上游3～4 bp之間對非靶向鏈進行切割，而FnCas9的切割位置在PAM上游6～8 bp之間，且FnCas9和SpCas9識別同樣的NGG PAM，因此基于FnCas9的PE系統(tǒng)具有更大的編輯窗口，擴大了PE的編輯范圍。

2.4 調(diào)控DNA修復相關(guān)通路

PE系統(tǒng)在基因組上引入目標突變需要細胞內(nèi)源DNA損傷修復機制的參與，通過對影響編輯效率及編輯產(chǎn)物純度的關(guān)鍵DNA修復通路進行調(diào)控有助于改善PE系統(tǒng)的性能[20]。David R. Liu課題組利用CRISPRi篩選確定了錯配修復通路(mismatch repair，MMR)對引導編輯的效率和產(chǎn)物純度的影響；他們發(fā)現(xiàn)，敲低、、、這4種MutSα–MutLα錯配修復復合體組成蛋白的編碼基因，PE2的編輯效率可提高5.8倍，PE3的編輯效率可提高2.5倍；此外，敲低(MMR通路中的核酸外切酶)也會將PE2編輯效率提高2.3倍；隨后他們利用失去功能活性的MLH1蛋白變體(MLH1dn)來抑制MMR，并將共表達MLH1dn的PE2和PE3分別命名為PE4和PE5；與PE2相比，PE4的編輯效率提高了2.0倍，indels頻率從0.40%降低到0.31%；與PE3相比，PE5的編輯平均提高了1.2倍，編輯產(chǎn)物純度提高了2.8倍[20]。無獨有偶，Silva等[25]通過對涵蓋了所有已知的修復途徑的32種DNA修復因子進行遺傳篩選，發(fā)現(xiàn)在、、、和這些MMR通路的關(guān)鍵基因缺失的單倍體HAP1細胞系中，PE效率提高了2～6.8倍，表明MMR對PE的抑制作用；通過使用siRNA特異性降解細胞中MLH1 mRNA，可以將PE效率提高約2倍。

2.5 引導編輯的衍生技術(shù)

引導編輯技術(shù)以其高度的靈活性得到了廣泛的應用，并且基于其衍生出了多種針對特定編輯類型的編輯系統(tǒng)(表2)。其中，Anzalone等[37]使用兩條相向的pegRNA來逆轉(zhuǎn)錄出互補的DNA鏈進而替換兩個DNA切口之間的內(nèi)源性DNA序列，此系統(tǒng)被命名為TwinPE；TwinPE可以實現(xiàn)基因組中大片段的替換，插入或刪除，極大地提高了PE系統(tǒng)的精準基因編輯能力[37]。類似地，Choi等[38]同樣使用一對相向的pegRNA開發(fā)了PRIME-Del系統(tǒng)，PRIME-Del可以精準刪除長達10 kb的DNA片段，編輯效率介于1%～30%；Wang等[28]使用一對pegRNA編碼與靶位點非同源但彼此互補的DNA單鏈，開發(fā)出了GRAND系統(tǒng)，GRAND誘導150 bp插入的效率高達63.0%，誘導250 bp插入的效率為28.4%，最高可以實現(xiàn)約1 kb的插入。

PE系統(tǒng)中的nCas9(H840A)具有單鏈切割活性，最近有多項研究表明，具有雙鏈切割活性的Cas9同樣可以介導引導編輯的進行，并且具有一些獨特的優(yōu)勢。Peterka等[24]將逆轉(zhuǎn)錄酶與和野生型SpCas9進行融合構(gòu)建了PEn蛋白；利用常規(guī)的pegRNA，PEn可以通過同源依賴性DSB修復機制實現(xiàn)片段插入；利用在3′末端僅包含PBS和目標插入的pegRNA，PEn可以通過精確的NHEJ實現(xiàn)小片段插入編輯，效率高達50%。Jiang等[29]將雙鏈切割活性的Cas9與逆轉(zhuǎn)錄酶融合，并結(jié)合兩條靶向互補DNA鏈pegRNA，開發(fā)出了PEDAR系統(tǒng)，它可以高效地誘導20～700 bp的片段刪除和長達30 bp的片段插入。Adikusuma等[26]同樣利用野生型SpCas9構(gòu)建了新的PE系統(tǒng)PEA1，并且將蛋白、pegRNA和nicking sgRNA整合在同一個質(zhì)粒中進行表達，該系統(tǒng)在HEK293T細胞中平均編輯效率可達到67%。此外，將此系統(tǒng)注射小鼠胚胎，在新生小鼠中最高可以實現(xiàn)100%的編輯效率。Tao等[27]將逆轉(zhuǎn)錄酶與野生型spCas9融合構(gòu)建了WT-PE系統(tǒng)，通過使用分別靶向基因組上的不同區(qū)域兩條pegRNA來逆轉(zhuǎn)錄出互補的DNA單鏈，WT-PE可以實現(xiàn)高效、多功能的大規(guī)?；蚪M編輯，包括長達16.8 Mb長的大片段刪除和染色體易位，為模擬或治療與大片段異常相關(guān)的疾病的提供了工具。

表2 引導編輯的衍生技術(shù)

3 PE系統(tǒng)的應用

PE系統(tǒng)突破了堿基編輯系統(tǒng)編輯類型和CRISPR/ Cas9系統(tǒng)副產(chǎn)物的限制，極具應用潛力。自其誕生以來，被迅速應用到動物如小鼠()、果蠅()、斑馬魚()、兔子()，植物如小麥(L.)、水稻(L.)、玉米(L.)、番茄(Mill.)、煙草()、小立碗蘚()、馬鈴薯(L.)、擬南芥()，還有大腸桿菌()及各種細胞模型中[9,10,16,31,39～47]；此外，其在基因治療、遺傳突變篩選等方面也多有應用[35,48～50]（圖3）。

3.1 在動物中的應用

建立動物疾病模型是研究人類疾病的發(fā)病機制及開發(fā)相關(guān)藥物的重要手段，基因編輯技術(shù)的發(fā)展為建立人類遺傳疾病的動物模型提供了強大工具。利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)和堿基編輯系統(tǒng)，研究人員已經(jīng)建立一大批動物疾病模型，極大的促進了相關(guān)疾病的研究[51,52]。然而，通過CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導的HDR建立疾病模型效率低下，堿基編輯系統(tǒng)也存在bystander編輯和編輯范圍受限的問題；PE系統(tǒng)的出現(xiàn)，很大程度上彌補了這些弊端。小鼠是最常見的模型動物，基于引導編輯技術(shù)的多種小鼠疾病模型已經(jīng)被成功創(chuàng)制。其中，本課題組通過顯微注射PE2 mRNA、pegRNA和nicking sgRNA編輯小鼠胚胎基因，首次成功利用PE系統(tǒng)在小鼠上誘導人類同源致病突變[10]。Gao等[53]通過顯微注射PE2 mRNA和pegRNA成功地在小鼠基因的啟動子區(qū)域引入C>G堿基顛換，26%的子代小鼠攜帶目標突變同時表現(xiàn)出相應的疾病特征；通過檢測發(fā)現(xiàn)，PE系統(tǒng)在被編輯小鼠中保持高保真性和高特異性。Park等[19]以RNA的形式注射優(yōu)化后PE系統(tǒng)到小鼠胚胎，同時將G>C的單堿基突變和TA兩堿基插入引入小鼠基因，陽性子代小鼠體內(nèi)的編輯效率最高可達47%；獲得的基因突變的后代小鼠成功地表現(xiàn)出矮小的表型。Lin等[9]通過向小鼠胚胎注射質(zhì)粒利用PE系統(tǒng)成功編輯小鼠基因獲得了白內(nèi)障小鼠模型，子代小鼠中最高編輯效率為41%，并且表現(xiàn)出明顯的白內(nèi)障癥狀。Petri等[31]以RNP的形式將PE系統(tǒng)注射到斑馬魚胚胎，成功將人類眼部皮膚白化病致病突變和癌基因突變引入斑馬魚，成功誘導了可遺傳突變，這也證明了利用RNP遞送PE系統(tǒng)的可行性。Qian等[40]同樣使用顯微注射的方法利用PE系統(tǒng)編輯兔的基因，在其第11外顯子插入4個堿基TATC，成功構(gòu)建了人泰薩克斯病(Tay-Sachs disease，TSD)兔模型。除了小鼠外，Bosch等[39]通過構(gòu)建體內(nèi)表達PE2蛋白和pegRNA的轉(zhuǎn)基因果蠅，在果蠅上也成功進行了引導編輯，證明了PE系統(tǒng)其他動物物種中的可行性。

圖3 PE系統(tǒng)的應用

A：在動物中的應用；B：在基因治療中的應用；C：在植物中的應用；D：在突變篩選中的應用。

基因編輯技術(shù)在動物上的另一項重要應用是進行基因編輯育種。利用基因編輯技術(shù)來修飾影響經(jīng)濟性狀的關(guān)鍵功能基因，從而獲得具備良好生產(chǎn)性能的優(yōu)質(zhì)種質(zhì)資源，突破了傳統(tǒng)家畜育種周期長、遺傳改良效率低的弊端。目前，研究人員已經(jīng)利用CRISPP/ Cas9系統(tǒng)和堿基編輯系統(tǒng)創(chuàng)制了包括山羊、綿羊、豬、兔、奶牛等大批具有優(yōu)異經(jīng)濟性狀的種質(zhì)資源[54～60]。PE系統(tǒng)的出現(xiàn)，為動物基因編輯育種提供了更加強大的工具，可以在動物基因組上有效引入更加多樣的修飾類型。目前，PE系統(tǒng)還未有在大動物上應用的報道。本課題組前期在綿羊上對PE系統(tǒng)在大動物上的有效性進行了相關(guān)探索，利用經(jīng)典版本的PE系統(tǒng)PE3編輯綿羊和兩個基因，雖然在子代羔羊中檢測到了目標突變，但個體中最高編輯頻率僅有14.7%，這說明PE系統(tǒng)的效率還需要進一步優(yōu)化。

3.2 在基因治療中的應用

基因治療是基因編輯工具的一項重要應用，使用基因編輯工具直接修復致病突變有望治愈人類遺傳疾病[61]。CRISPR/Cas9系統(tǒng)和堿基編輯系統(tǒng)出現(xiàn)以后，研究人員已經(jīng)進行了許多基因治療方面的探索，其中進展最快的轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白淀粉樣變性的CRISPR療法已經(jīng)進入臨床試驗階段并取得了優(yōu)異的治療效果[62]。

引導編輯技術(shù)高精準性及高特異性的特點使其在基因治療方面更有潛力。目前研究人員已經(jīng)在細胞及動物個體水平進行了大量的研究。Schene等[63]利用PE3系統(tǒng)成功糾正了來源于患者的腸道類器官基因的3 bp缺失突變(c.629_631delCCT，p.S210del)及肝臟類器官中基因的1 bp重復突變。Chemello等[64]利用PE3系統(tǒng)成功在人誘導性多能干細胞的基因第52外顯子插入AC兩個堿基，恢復細胞中的抗肌萎縮蛋白表達。Kim等[65]將來自遺傳性酪氨酸血癥1型(HT1)小鼠模型中的肝細胞重編程肝臟祖細胞(CdHs)，并利用PE系統(tǒng)成功糾正基因上的致病突變，編輯效率達到2.3%。Geurts等[43]利用PE3系統(tǒng)成功修復了腸道類器官基因的F508del和R785*突變，但編輯效率較低。在動物成體治療方面，Jang等[33]采用流體動力學注射的方式遞送質(zhì)粒編碼的PE3系統(tǒng)到1型遺傳性酪氨酸血癥的小鼠模型體內(nèi)，通過修復基因上G>A致病突變，改善了小鼠的疾病表型[11]。Liu等[33]采用流體動力學注射的方式以質(zhì)粒的形式遞送改進后的PE系統(tǒng)到成體小鼠的肝細胞來修復基因上G>A的致病突變，平均編輯效率達到6.7%。B?ckd等[50]使用人腺病毒5(AdV5)載體遞送PE系統(tǒng)到苯丙酮尿癥(PKU)小鼠模型的肝臟細胞，在新生小鼠體內(nèi)修復致病突變的效率可達5.6%，在成年小鼠體內(nèi)可達2%。Jiang等[29]基于雙pegRNA策略開發(fā)了PEDAR，并采用流體動力學注射的方法遞送表達PEDAR系統(tǒng)的質(zhì)粒到1型遺傳性酪氨酸血癥小鼠模型體內(nèi)來修復其基因的1.38 kb插入突變，修復率為0.76±0.25%。Liu等[34]通過分割PE蛋白開發(fā)了sPE系統(tǒng)，通過流體動力學注射腺相關(guān)病毒(AAV)載體遞送sPE系統(tǒng)到I型酪氨酸血癥小鼠模型體內(nèi)，糾正其基因上的G>A致病突變。

盡管引導編輯技術(shù)在基因治療上展現(xiàn)出了明顯的優(yōu)勢，如精準性高、PAM限制小和可以實現(xiàn)片段的插入刪除等，但其編輯效率仍然需要進一步提高。此外，其體積過大的特點也影響了它的遞送效率，限制了其在基因治療中的應用，亟待解決。

3.3 在植物中的應用

對于作物育種，傳統(tǒng)的誘變育種耗時耗力且突變率低，而基因編輯技術(shù)的出現(xiàn)大大改善了這一狀況。CRISPR/Cas9系統(tǒng)及堿基編輯系統(tǒng)已經(jīng)在作物育種方面得到了廣泛應用，一系列的具有優(yōu)良性狀(如抗病性和除草劑抗性)的種質(zhì)材料被創(chuàng)制[66～70]。PE系統(tǒng)的出現(xiàn)為快速精準地創(chuàng)制具有優(yōu)良性狀的突變體提供了更有力的工具[71]。

自2019年引導編輯技術(shù)出現(xiàn)以來，國內(nèi)外許多研究團隊將引導編輯技術(shù)應用于作物性狀的改良。其中，Lin等[8]首先將引導編輯技術(shù)應用到植物領(lǐng)域，他們建立了植物引導編輯系統(tǒng)PPE，在水稻和小麥中成功進行了點突變、插入和刪除編輯，最高效率可達21.8%；在水稻中，Tang等[72]開發(fā)了3個版本的植物PE系統(tǒng)，獲得最高1.55%的編輯效率；而Xu等[73]使用PE系統(tǒng)編輯水稻原生質(zhì)體獲得突變體頻率最高達到31.3%。Xu等[74]利用PE系統(tǒng)編輯水稻除草劑抗性相關(guān)的基因，獲得被編輯植株的效率最高達到26%。Li等[44]利用PE系統(tǒng)編輯水稻和基因，編輯效率最高達到9.38%，并獲得的純合突變體植株。Butt等[42]使用PE系統(tǒng)編輯水稻、、基因，最高編輯效率達到2%。Xu等[21]使用優(yōu)化后的PE系統(tǒng)在水稻的13個內(nèi)源性靶點處實現(xiàn)了平均達到24.3%的編輯效率。

除水稻和小麥外，Lu等[45]將PE系統(tǒng)應用到番茄基因組的編輯，最多在6.7%的植株上檢測到了目標編輯，最高編輯效率為1.66%；Jiang等[16]通過增強pegRNA的表達在玉米上實現(xiàn)了更高效率的引導編輯，最高達到了53.2%；Xu等[21]采用在Cas9的N-末端融合逆轉(zhuǎn)錄酶及在逆轉(zhuǎn)錄酶模板中引入多核苷酸突變的方式來優(yōu)化PE系統(tǒng)，在玉米原生質(zhì)體四個靶位點的平均編輯效率達到了6.2%。Perroud等[47]在小立碗蘚中測試了PE系統(tǒng)，但最高0.06%的編輯效率明顯低于CRISPR/Cas9介導的編輯效率；此外，他們還利用PE系統(tǒng)編輯馬鈴薯基因，但編輯效率同樣較低。Wang等[46]開發(fā)了更易于使用的載體來將引導編輯應用于雙子葉植物煙草和擬南芥及單子葉植物水稻，驗證了其有效性。

PE系統(tǒng)在多種植物中得到廣泛應用，彰顯了PE系統(tǒng)在植物上巨大的應用價值，但還應注意到的是其在植物中的編輯效率仍明顯低于在動物細胞中的效率。因此，仍然需要結(jié)合植物的特點對其編輯效率進行有針對性的優(yōu)化。

3.4 在突變篩選中的應用

基于CRISPR/Cas的基因編輯技術(shù)的發(fā)展為高通量的遺傳變異篩選提供了可能。從最初的全基因組敲除篩選，到HDR介導的飽和突變篩選，再到堿基編輯系統(tǒng)介導的突變篩選，大規(guī)模的基因功能研究擁有了更多工具選擇[75～78]。引導編輯技術(shù)出現(xiàn)后，同樣也被應用于遺傳篩選研究。Xu等[48]首先在植物上建立基于pegRNA文庫的飽和誘變方法PLSM，對于水稻基因中的6個保守殘基，分別針對每個殘基建立pegRNA文庫，最終鑒定到16種類型的賦予水稻除草劑抗性的突變，其中大部分突變尚未在水稻育種中報告或應用，表明PLSM方法在作物改良與農(nóng)藝重要性狀相關(guān)基因的直接進化中具有巨大潛力。Derwood等[49]將PE系統(tǒng)與基因位點單倍體化策略相結(jié)合，在人類細胞中建立了基于引導編輯的飽和突變系統(tǒng)，他們成功地將此系統(tǒng)應用于和基因變異的功能注釋。

4 PE系統(tǒng)的遞送方式

將基因編輯工具高效地遞送到作用位置是其發(fā)揮功能的關(guān)鍵。PE系統(tǒng)出現(xiàn)以來，研究人員已經(jīng)通過多種方式將其遞送到細胞、胚胎及組織中，實現(xiàn)靶位點的高效編輯。其中，最常見的遞送方式是質(zhì)粒DNA的遞送。通過轉(zhuǎn)染可以將質(zhì)粒DNA高效地遞送到動物或植物細胞中，還可以通過流體動力學注射質(zhì)粒到小鼠體內(nèi)，從而在細胞中大量表達PE系統(tǒng)組分來編輯目標位點[6,11,29,33]。此外，也有研究通過顯微注射將質(zhì)粒DNA導入小鼠胚胎中，實現(xiàn)小鼠胚胎基因組的靶向編輯[9]。mRNA與gRNA的組合也常用來遞送基因編輯系統(tǒng)。本課題組通過顯微注射PE2 mRNA、pegRNA和nicking sgRNA到小鼠胚胎中，實現(xiàn)了小鼠位點的編輯[10]；Nelson等[15]通過核轉(zhuǎn)染將PE2 mRNA、pegRNA和nicking sgRNA遞送到HEK293T細胞中來編輯細胞基因組。RNP(ribonucleoprotein)是另一種常見的基因編輯系統(tǒng)遞送手段，其優(yōu)勢在于較短的活性持續(xù)時間從而誘導較少的脫靶編輯。Petri等[31]以RNA的形式遞送PE系統(tǒng)到斑馬魚胚胎和人類細胞中，成功誘導了目標突變；Liu等[34]也以RNP的形式將PE系統(tǒng)遞送人類細胞中來編輯靶位點，兩項研究都證明了利用RNP來遞送PE系統(tǒng)的有效性。AAV是一種的常見病毒載體，一般用于基因編輯系統(tǒng)的體內(nèi)遞送。對于PE系統(tǒng)來說，因為AAV包裝容量的限制，所以需要將PE2蛋白拆分成兩部分置于兩個AAV上。目前，在多項研究中，研究人員通過雙AAV策略成功地將PE系統(tǒng)遞送到小鼠體內(nèi)，實現(xiàn)了靶位點的引導編輯[33,35,50,79]。慢病毒(LVs)是另一種用于基因編輯工具遞送的病毒載體，與AAV載體相比，具有更大的包裝容量，可以包裝完整PE2蛋白編碼基因，已經(jīng)在多項研究中得到應用[13,15]。

除了上述遞送方法外，還有脂質(zhì)納米顆粒、金納米顆粒、病毒樣顆粒等遞送手段還未應用在PE系統(tǒng)上[80～82]。這些方法都有各自的優(yōu)缺點，使用時應該考慮每種基因編輯應用的需要來選擇合適的遞送方法。

5 引導編輯的生物信息學工具研究

生物信息學工具可以給研究人員提供很大的便利。自PE系統(tǒng)出現(xiàn)以來，已經(jīng)有多種相關(guān)的生物信息學工具被開發(fā)出來，主要集中在pegRNA的設計和編輯效率的預測與評估（表3）。

界面友好、方便快捷的pegRNA設計工具有助于研究人員快速得到高效的pegRNA序列用于后續(xù)研究。Hsu等[83]開發(fā)了PrimeDesign用于pegRNA的設計，并且他們基于PrimeDesign構(gòu)建了PrimeVar數(shù)據(jù)庫，其中包括用于誘導或糾正來自ClinVar數(shù)據(jù)庫的68500個致病性人類遺傳變異的pegRNA和nicking sgRNA的組合。Hwang等[84]開發(fā)了PE- Designer，其提供了識別不同PAM的Cas9變體的pegRNA的設計，并且支持包括脊椎動物，植物，昆蟲和細菌在內(nèi)的543種生物。Li等[85]開發(fā)了基于深度學習的Easy-Prime pegRNA 設計工具，Easy- Prime可以自動搜索和優(yōu)化pegRNA 的設計。Lin等[32]開發(fā)了應用于植物的PlantPegDesigner，為植物中的pegRNA設計尤其是雙pegRNA策略的使用提供了便利。此外，還有pegFinder、PnB Designer、pegIT和PINE-CONE等pegRNA設計工具可供選擇[86～89]。

PE系統(tǒng)在基因組不同位點上的編輯效率具有較大的差異，Kim等[90]通過建立pegRNA文庫對PE2效率進行高通量分析，系統(tǒng)地評估了PBS和RTT長度及其他因素對PE2效率的影響，基于機器學習建立了預測PE2效率的計算模型，并基于此開發(fā)了PE2編輯效率預測工具DeepPE，可輔助pegRNA的設計。

高通量測序在基因編輯領(lǐng)域得到廣泛應用，常常被用來對基因編輯效率進行評估。為了便于對PE系統(tǒng)相關(guān)的高通量測序數(shù)據(jù)進行分析，Hwang等[84]開發(fā)了PE-Analyzer，其可以快速分析測序數(shù)據(jù)來評估引導編輯結(jié)果。此外，Clement等[91]在原有的CRISPResso2軟件基礎上增加了其用于分析引導編輯相關(guān)的高通量測序數(shù)據(jù)的模塊，極大地促進了PE系統(tǒng)的應用。

6 PE系統(tǒng)的安全風險

基因編輯工具的安全性是其廣泛應用尤其是疾病治療方面應用的前提，且其安全性主要體現(xiàn)在其脫靶風險的大小，但PE系統(tǒng)相比其他基因編輯系統(tǒng)還需要對其逆轉(zhuǎn)錄酶的安全性進行評估。對于逆轉(zhuǎn)錄酶的安全性，多項研究表明，逆轉(zhuǎn)錄酶不會帶來安全風險，更多的研究主要是針對其脫靶風險[6,92]。

表3 pegRNA設計軟件

PE系統(tǒng)在作用過程中的3種核酸雜交決定了PE系統(tǒng)在理論上很難脫靶，這也解釋了PE系統(tǒng)的精準性[6]。David R. Liu課題組在開發(fā)PE系統(tǒng)過程中對其脫靶效應進行了表征。他們選擇已經(jīng)被報道的具有明確Cas9脫靶的4個基因位點(、、、)及每個位點對應的4個脫靶位點進行測試；結(jié)果顯示，在16個脫靶位點中，PE系統(tǒng)在其中3個位點發(fā)生脫靶編輯，并且只有一個位點脫靶編輯效率大于1%，這說明PE系統(tǒng)具有很高的特異性，其安全性遠高于CRISPR/Cas9系統(tǒng)[6]。為了評估PE系統(tǒng)在全基因組水平的特異性，Kim等[93]開發(fā)了基于nCas9(H840A) 的nDigenome-seq；nDigenome-seq可以有效地在全基因組范圍內(nèi)分析nCas9(H840A)誘導的DNA單鏈斷裂(SSB)位點，利用靶向深度測序?qū)SB位點進行分析可以確定引導編輯在這些位點上的脫靶編輯情況；借助nDigenome-seq，Kim等[93]在部分脫靶位點檢測到了0.1%～1.9%的PE脫靶編輯，這表明PE在全基因組水平上具有高度特異性；另外，他們還發(fā)現(xiàn)利用具有更高特異性的Cas9變體如eSpCas9和Sniper Cas9來構(gòu)建PE系統(tǒng)，可以進一步提高PE系統(tǒng)在人類細胞中的特異性，這說明在以往研究中降低Cas9脫靶編輯的方法可能同樣適用于PE系統(tǒng)特異性的優(yōu)化，從而為PE系統(tǒng)特異性的優(yōu)化提供了一個方向。在植物上，Jin等[92]通過靶向深度測序和全基因組測序?qū)λ驹|(zhì)體和再生水稻植物中的pegRNA依賴性和pegRNA非依賴性脫靶效應進行了全面分析，他們發(fā)現(xiàn)PE系統(tǒng)會產(chǎn)生了極低水平的pegRNA依賴性脫靶(0.00%～0.23%)，但不會產(chǎn)生pegRNA非依賴性脫靶。Gao等[94]通過全基因組測序和全轉(zhuǎn)錄組測序證明了PE不會產(chǎn)生gRNA非依賴性DNA脫靶和RNA脫靶，進一步證明了PE系統(tǒng)的特異性。

總之，PE系統(tǒng)相比CRIPSR/Cas9系統(tǒng)和堿基編輯系統(tǒng)具有更高的特異性，也更加安全，但仍需進一步降低其脫靶風險，為其后續(xù)在基因治療中的應用奠定基礎。

7 結(jié)語與展望

引導編輯技術(shù)的出現(xiàn)為基因組的精準編輯提供了更加強大的工具，堿基顛換和小片段的插入刪除得以高效地實現(xiàn)，在遺傳疾病的模擬與治療和動植物新品種的培育等方面具有極高的應用價值，然而PE系統(tǒng)仍然存在一定的不足之處，最為明顯的是引導編輯的效率問題。相比CRISPR/Cas9系統(tǒng)和堿基編輯系統(tǒng)，引導編輯的編輯效率仍然較低；利用PE系統(tǒng)編輯小鼠胚胎獲得的基因編輯小鼠多為嵌合小鼠且嵌合比例較低[10,19,53]。雖然已經(jīng)有大量的研究從不同途徑對引導編輯的效率進行了優(yōu)化，但其仍有一定的提升空間。此外，PE系統(tǒng)的indels也是一個不容忽視的問題。PE2系統(tǒng)由于只在基因組上引入一個切口，其indels頻率保持在很低的水平，但PE2的低效性限制了其應用。而對于PE3來說，另一條sgRNA雖然提升了編輯效率，但同時也造成了更多的indels[6]；最近有研究表明，在小鼠胚胎中，PE3系統(tǒng)會造成高頻率的片段刪除等副產(chǎn)物[95]，這說明了降低PE系統(tǒng)的indels頻率是亟需解決的問題。有研究發(fā)現(xiàn)，DNA錯配修復機制在indels形成過程中起到了關(guān)鍵作用，通過抑制錯配修復機制，可以減少引導編輯介導的indels的產(chǎn)生[20]。相信隨著研究的深入，PE系統(tǒng)的作用機制會將被更加清晰地闡釋，通過對相關(guān)通路的調(diào)控，可以將indels降低到更加安全的水平?；蛑委熡型稳祟愡z傳病，基于CRISPP/Cas9的基因編輯療法已經(jīng)在臨床上取得優(yōu)異效果，同時基于堿基編輯系統(tǒng)的基因治療在鼠和猴疾病模型上也成效顯著[62,96,97]。PE系統(tǒng)在基因治療上也表現(xiàn)出了極大的優(yōu)勢，但目前已有的在小鼠成體治療上效果仍不盡如人意，還停留在初期階段。未來隨著更加高效的PE系統(tǒng)和遞送方式的開發(fā)，相信PE系統(tǒng)也將會有更加優(yōu)異的治療效果。

綜上所述，引導編輯技術(shù)高效、精準、安全，隨著更深入的優(yōu)化和改造，其必將推動生物醫(yī)學、動植物遺傳育種等領(lǐng)域研究和應用的快速發(fā)展。

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Prime editing: a search and replace tool with versatile base changes

Yao Liu, Xianhui Zhou, Shuhong Huang, Xiaolong Wang

Prime editing is a newly developed CRISPR/Cas system-based genome editing technique. The effector of prime editor (PE) is termed PE2, which is generated by fusing a reverse transcriptase (RT) with a Cas9 H840A nickase. The guide RNA of PE is termed prime editing guide RNA (pegRNA), which consists of a single guide RNA (sgRNA) with a 3′ extension containing the RT template (RTT) and primer binding site (PBS). PE can install all 12 types of point mutations, small insertions and deletions and combinations thereof. Since its emergence in 2019, with the high versatility and specificity, PE has been applied to many living organisms, including animals, plants and bacteria. This led to many explorations of PE on gene therapy and genetic improvement in agriculture. In this review, we systematically describe the development, characteristics, optimizations, applications and security of PE. In addition, we discuss the future applications of PE. We expect that this review will help researchers to grasp and better use PE.

prime editor; CRISPR/Cas9; optimization; application

2022-07-23;

2022-09-01;

2022-09-16

國家自然科學基金項目(編號：31972526, 32161143010)資助[Supported by the National Natural Science Foundation of China (Nos. 31972526, 32161143010)]

劉堯，在讀博士研究生，專業(yè)方向：動物遺傳育種。E-mail: yaoliu@nwafu.edu.cn

王小龍，博士，教授，研究方向：動物生物育種。E-mail: xiaolongwang@nwafu.edu.cn

10.16288/j.yczz.22-156

(責任編委: 李大力)