枸杞多糖通過調(diào)控α-MSH蛋白的表達(dá)抑制UVA誘導(dǎo)的細(xì)胞黑色素生成

肖常青, 陳教全, 唐奕, 歐珊珊, 李華平, 彭麗倩, 李振潔, 朱慧蘭

廣州市皮膚病防治所，廣東 廣州 510095

黑色素是由皮膚黑素細(xì)胞生成，具有保護(hù)皮膚免受紫外線輻射、避免細(xì)胞DNA損傷的作用，但其過速增長或分布不均會導(dǎo)致皮膚局部黑色素沉積過度，將導(dǎo)致老年斑、雀斑和黃褐斑甚至皮膚癌，對患者的生活造成極大的困擾[1-3]。目前臨床上使用較多的美白藥物，如苯二酚、氫醌、曲酸等均具有較好的抑制黑色素生成能力，但這些物質(zhì)具有刺激性和細(xì)胞毒性，會造成色素脫失、過敏甚至皮膚癌等不良反應(yīng)，因此追求高效且安全的黑色素抑制劑是美白目前的研究方向[4-5]。有研究報道，部分的中草藥及天然抗氧化劑具有抑制細(xì)胞黑色素生成的作用[6-8]。枸杞多糖(lycium barbarum polysaccharide，LBP)是從枸杞子中提取的多糖類化合物，是一種天然抗氧化劑，有廣泛的藥理學(xué)作用，包括抗氧化、抗腫瘤、保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)、降血脂等[6-8]。明枸杞子水提物對酪氨酸酶(tyrosinase)有抑制作用[11]，但關(guān)于LBP調(diào)控UVA誘導(dǎo)黑素細(xì)胞生成的作用及分子機(jī)制尚不明確。本研究通過體外建立UVA誘導(dǎo)的黑素細(xì)胞黑色素生成，探討LBP抑制黑色素生成的作用及機(jī)制，旨在為LBP治療色素性疾病提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑、儀器

HaCaT細(xì)胞(中科院細(xì)胞庫)，HEM細(xì)胞(中科院細(xì)胞庫)。LBP(西安天豐生物科技有限公司，棕黃色粉末，用PBS配置50 mg/mL母液，分裝后于-20 ℃避光保存)，DMEM-高糖細(xì)胞培養(yǎng)液(美國Gibco)，Nonapeptide-1acetatesalt(N-1A，MedChemExpress)，0.25%胰蛋白酶(美國Gibco)，RPMI 1640培養(yǎng)液、PBS(杭州吉諾)，GAPDH一抗(生工生物)，MITF一抗(成都正能)，tyrosinase一抗、TRP1一抗、TRP2一抗(Affinity)，α-MSH ELISA檢測試劑盒(武漢華美)。UVA-TL/10燈管(荷蘭PHILIPS)，電熱恒溫水浴鍋(上海精宏)，分光光度計(ThermoScientific)，JS多功能水平電泳槽、全自動凝膠成像分析儀(上海培清)。

1.2 方法

1.2.1 HaCaT和HEM細(xì)胞培養(yǎng) 在37 ℃、5% CO2條件下用DMEM-高糖培養(yǎng)基孵育HaCaT、HEM細(xì)胞。用0.25%胰蛋白酶消化后行傳代培養(yǎng)。選生長良好的對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實驗。

1.2.2 CCK8法檢測細(xì)胞的增殖 根據(jù)本課題組前期實驗成果[12]，采用30 J/cm2UVA劑量處理細(xì)胞。UVA燈每次照射前測試UVA強(qiáng)度，照射距離固定為15 cm, 依據(jù)UVA劑量/UVA強(qiáng)度確定照射時間。CCK8試劑盒檢測LBP對細(xì)胞增殖的影響：將HaCaT、HEM細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板，細(xì)胞的密度控制在1×104個/孔，細(xì)胞貼壁后吸去上清液，加入LBP濃度為0、20、50、100、200、300、400、500 μg/mL的培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h后，棄原培養(yǎng)液，每孔加入CCK8試劑100 μL/孔，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育3 h后，在酶標(biāo)儀上，檢測波長450 nm，測量吸光度(A值)。細(xì)胞相對生長率=實驗組A值/對照組A值×100%。選擇同時對HEM細(xì)胞和HaCaT細(xì)胞生長均無明顯抑制的LBP濃度為實驗濃度。

1.2.3 細(xì)胞分組 將HEM細(xì)胞、HaCaT細(xì)胞隨機(jī)分為5組：空白組，UVA組，UVA+LBP組，UVA+N-1A組，UVA+LBP+N-1A組。空白組：僅正常培養(yǎng)，不做任何處理；UVA組：直接進(jìn)行UVA照射(照射方法同1.2.2所述)；UVA+LBP組：HEM/HaCaT細(xì)胞與上述得到的實驗濃度LBP在37 ℃共培養(yǎng)24 h后, 進(jìn)行UVA照射；UVA+N-1A組：HEM/HaCaT細(xì)胞與20 μM N-1A在37 ℃共培養(yǎng)24 h后, 進(jìn)行UVA照射；UVA+LBP+N-1A組：HEM/HaCaT細(xì)胞、上述得到的實驗濃度LBP與20 μM N-1A在37 ℃共培養(yǎng)24 h后, 進(jìn)行UVA照射。

1.2.4 HEM細(xì)胞中tyrosinase活性測定 將5組細(xì)胞每個濃度設(shè)置3個復(fù)孔，培養(yǎng)72 h。棄去上清液，DPBS清洗2次，每孔加入含1% TritonX-100的DPBS緩沖液80 μL，迅速置于-80 ℃低溫冰箱2 h。取出置于常溫融化，37 ℃孵育5 min，加入20 μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%的L-dopa，37 ℃反應(yīng)2 h，于酶標(biāo)儀測定490 nm的吸光度值。按如下公式計算酶活力：tyrosinase活性=實驗組OD值/對照組OD值×100%。

1.2.5 HEM細(xì)胞中黑色素含量的測定 上述5組細(xì)胞處理后，每組設(shè)置3個復(fù)孔，培養(yǎng)72 h后，用DPBS清洗2次，消化并收集細(xì)胞于離心管中(共2 mL，其中取20 μL稀釋一定倍數(shù)用于細(xì)胞計數(shù))，于1 500 r/min的條件下離心10 min，棄去上清液。加入2 mL的DPBS用移液器輕輕吹打制成細(xì)胞懸液，加入500 μL乙醇乙醚混合液(體積比1 ∶1)，在室溫下放置30 min，于3 000 r/min的條件下離心5 min，棄去上清液，加入1 mL含10%DMSO的1 mol/L NaOH溶液，混勻，于80 ℃水浴孵育45 min，測定490 nm吸光度值。黑色素合成總量=實驗組OD值/對照組OD×100%。

1.2.6 HaCaT和HEM細(xì)胞中α-MSH含量的測定 將5組HaCaT細(xì)胞、5組HEM細(xì)胞按上述處理后，每個濃度設(shè)置3個復(fù)孔，培養(yǎng)72 h。用α-MSH ELISA試劑盒檢測HaCaT、HEM細(xì)胞中的α-MSH的水平，操作步驟按說明書進(jìn)行。

1.2.7 Western blot檢測HEM細(xì)胞中黑色素合成相關(guān)蛋白表達(dá)量 5組HaCaT細(xì)胞、5組HEM細(xì)胞分別按上述處理后，提取蛋白，BCA法測定總蛋白含量，SDS-PAGE電泳(低壓80 V，30 min；高壓120 V，60 min)，轉(zhuǎn)膜，在含5%脫脂奶粉的TBST中封閉1 h，孵育一抗(抗體比例tyrosinase為1 ∶ 1 000、MITF為1 ∶1 000、TRP1為1 ∶1 000、TRP2為1 ∶1 000)，置于4 ℃冰箱過夜，洗膜，孵育二抗，洗膜，顯影。采用Image J圖像分析軟件分析條帶灰度值，以目的蛋白條帶與相應(yīng)的內(nèi)參GAPDH條帶的灰度值比值作為其蛋白表達(dá)相對表達(dá)水平。

1.2.8 統(tǒng)計學(xué)處理 使用GraphPad Prism 5軟件對實驗所得的數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計分析，兩組間的差異采用獨(dú)立樣本t檢驗，多組間的差異比較則選用one-way ANOVA檢驗，兩兩比較用LSD-t法，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LBP對HaCaT、HEM細(xì)胞增殖的影響

結(jié)果顯示(圖1A、1B)，HaCaT細(xì)胞經(jīng)不同濃度LBP(0、20、50、100、200、300、400、500 μg/mL)處理24 h后，與空白組對比，400 μg/mL LBP處理HaCaT細(xì)胞后，HaCaT細(xì)胞的增殖受到抑制(t=5.57,P=0.011),而300 μg/mL LBP對HaCaT細(xì)胞和HEM細(xì)胞的增殖均無影響(t=1.89、0.07，P=0.107、0.947)。提示后續(xù)試驗選擇同時對HEM細(xì)胞和HaCaT細(xì)胞的增殖均無影響的300 μg/mL LBP進(jìn)行實驗。

圖1 LBP對HaCaT細(xì)胞(1A)和HEM細(xì)胞(1B)增殖的影響

2.2 LBP對HEM細(xì)胞內(nèi)黑色素生成的影響

由圖2A可知，HEM細(xì)胞經(jīng)UVA照射后，細(xì)胞黑色素的生成量較空白組明顯增加(t=-7.82，P=0.016)，提示UVA誘導(dǎo)的黑色素生成增高的細(xì)胞模型構(gòu)建成功。與UVA組相比較，添加LBP、α-MSH拮抗劑N-1A(α-MSH類似物)后均對黑色素生成有抑制效果(t=7.13、7.95，P=0.019、0.015)，LBP組的抑制率為33.81%，略低于陽性對照組N-1A(35.13%)，但兩組間無顯著性差異(t=0.16，P=0.885)。顯示LBP有顯著的抑制黑色素合成的能力。

2.3 LBP對HEM細(xì)胞內(nèi)tyrosinase活性的影響

由圖2B可知，HEM細(xì)胞經(jīng)UVA照射后，與空白組對比，tyrosinase活性顯著增加(t=-53.51，P<0.01)。LBP和陽性對照N-1A對HEM細(xì)胞內(nèi)tyrosinase活性均呈現(xiàn)出明顯的抑制作用(t=33.19、47.46，均P<0.001)，表明LBP在一定程度上通過抑制細(xì)胞內(nèi)tyrosinase的活性，但其作用稍弱于N-1A。

圖2 LBP對HEM細(xì)胞內(nèi)黑色素生成(2A)和tyrosinase活性(2B)的影響

2.4 LBP對HaCaT、HEM細(xì)胞α-MSH水平的影響

為探究LBP是否通過調(diào)控α-MSH蛋白水平抑制黑色素生成，采用ELISA法檢測HaCaT、HEM細(xì)胞內(nèi)α-MSH的含量，結(jié)果顯示(圖3A、3B)，UVA照射后，HaCaT、HEM細(xì)胞的α-MSH分泌較空白組明顯增多(t=-3.79、-3.41，P=0.043、0.046)。與UVA組對比，當(dāng)加入LBP處理被UVA照射的細(xì)胞后，HaCaT和HEM細(xì)胞中的α-MSH含量均出現(xiàn)明顯下降(t=3.75、3.41，P=0.044、0.048)，而加入N-1A處理后α-MSH含量無明顯變化(t=0.21、0.18,P=0.495、0.872)。聯(lián)合使用LBP和N-1A處理HaCaT和HEM細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)α-MSH的表達(dá)均出現(xiàn)下調(diào)(t=4.90、3.66，P=0.039、0.047),與單獨(dú)使用LBP處理細(xì)胞無明顯差異(t=1.69、-0.66，P=0.232、0.578)。說明LBP可以抑制HaCaT和HEM細(xì)胞分泌α-MSH。

圖3 LBP對HaCaT(3A)、HEM細(xì)胞(3B)α-MSH蛋白水平的影響

2.5 LBP對HEM細(xì)胞黑色素生成相關(guān)蛋白的水平影響

Western blot結(jié)果(圖4)顯示，HEM細(xì)胞經(jīng)UVA誘導(dǎo)后，細(xì)胞內(nèi)tyrosinase、TRP-1、TRP-2和MITF蛋白的表達(dá)明顯增加。LBP處理后均能顯著抑制UVA或α-MSH誘導(dǎo)HEM細(xì)胞中tyrosinase、TRP1、TRP2和MITF等蛋白水平的上調(diào)，表明LBP能夠通過調(diào)控α-MSH水平以抑制細(xì)胞內(nèi)黑色素生成相關(guān)蛋白的表達(dá)。

圖4 LBP對HEM細(xì)胞的黑色素生成相關(guān)蛋白的水平影響

3 討論

枸杞子化學(xué)成分主要包括多糖、黃酮類、色素類、生物堿等，具有抑制細(xì)胞中黑色素生成的作用[11, 13-14]。天然抗氧化劑LBP是枸杞子的主要化學(xué)成分，具有提高免疫力、抗氧化、抗腫瘤、調(diào)節(jié)血糖、降血脂等藥理作用，但關(guān)于其對皮膚細(xì)胞中黑色素的影響仍不明確[15]。在細(xì)胞黑色素的形成過程中, tyrosinase起著關(guān)鍵性的催化和調(diào)控作用, 是主要的限速酶, 可以決定黑色素合成的速率, 也能阻斷酪氨酸轉(zhuǎn)化成為多巴進(jìn)而形成多巴醌，是治療皮膚黑色素增生疾病的關(guān)鍵[16-17]。枸杞子水提物對tyrosinase具有顯著的抑制能力，而且對tyrosinase的抑制效率隨提取物濃度升高而增強(qiáng)[11]。枸杞子中2-O-β-D-葡萄糖基-L-抗壞血酸(AA-2βG)具有顯著的抑制黑素細(xì)胞的生長、 降低細(xì)胞黑色素合成的作用, 在抑制tyrosinase活性方面較抗壞血酸更佳。本研究結(jié)果表明，LBP可以抑制UVA誘導(dǎo)的HEM細(xì)胞中黑色素水平增加，提示LBP在改善皮膚色素沉著方面發(fā)揮一定的作用。進(jìn)一步檢測黑色素合成關(guān)鍵酶tyrosinase的表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)LBP抑制UVA誘導(dǎo)的tyrosinase表達(dá)增加，提示LBP通過調(diào)控HEM細(xì)胞中tyrosinase表達(dá)影響UVA作用后的黑色素生成。

紫外線可以刺激皮膚中的角質(zhì)形成細(xì)胞和黑素細(xì)胞分泌α-MSH與黑皮質(zhì)素受體1結(jié)合，并激活下游的小眼轉(zhuǎn)錄因子(microphthalmia transcription factor, MITF)表達(dá)，MITF通過誘導(dǎo)tyrosinase mRNA的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)tyrosinase相關(guān)蛋白酶(tyrosinase-related protein，TRP)1和2的合成，導(dǎo)致皮膚黑色素形成[3, 18]。天然抗氧化劑(金邊瑞香、橄欖苦苷、人參提取物、桑白皮多酚等)能夠降低α-MSH刺激的細(xì)胞內(nèi)黑色素含量，抑制tyrosinase活性及黑色素生成蛋白的表達(dá)[19-21]。N-1A 是一種具有與α-MSH競爭作用的新型肽，可以通過與黑皮質(zhì)素受體1結(jié)合與α-MSH產(chǎn)生競爭作用進(jìn)而起到抑制黑色素生成的作用。本研究應(yīng)用α-MSH的拮抗劑(N-1A)進(jìn)行實驗，發(fā)現(xiàn)LBP可以明顯下調(diào)UVA誘導(dǎo)的HEM細(xì)胞和HaCaT細(xì)胞中的α-MSH表達(dá)水平，而N-1A不能抑制HaCaT細(xì)胞以及HEM細(xì)胞中α-MSH的產(chǎn)生，這表明LBP抑制UVA生成黑色素的作用機(jī)制與N-1A不同，LBP可能是通過直接調(diào)控α-MSH發(fā)揮作用。Western blot結(jié)果進(jìn)一步明確LBP可以抑制由α-MSH誘導(dǎo)的黑色素生成相關(guān)蛋白MITF、tyrosinase、TRP1和TRP2的表達(dá)，提示LBP對HaCaT和HEM細(xì)胞分泌的α-MSH具有直接的調(diào)控作用。

綜上所述，本研究揭示LBP能夠明顯抑制UVA誘導(dǎo)細(xì)胞黑色素的生成，其機(jī)制可能是通過調(diào)控α-MSH蛋白的表達(dá)，發(fā)揮減少色素沉著的積極作用。LBP是一種有效的黑色素合成抑制劑，但關(guān)于其治療黑色素性疾病的安全性和療效仍需進(jìn)行大量動物以及臨床研究證實。