‘商薯19’靜置水培營養(yǎng)液的篩選與內(nèi)源激素分析

王永江，王 爽，喬 奇，田雨婷

（河南省農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華北南部作物有害生物綜合治理重點實驗室，鄭州 450002）

0 引言

甘薯(Ipomoea batatasLam.)是中國重要糧食作物和效益型經(jīng)濟作物，中國的甘薯產(chǎn)量和種植面積均居世界首位[1-2]?！淌?9’是以‘SL-01’為母本，‘豫薯7號’為父本雜交選育而成的兼用型品種，在2014年第四屆“天豫杯”全國甘薯高產(chǎn)競賽中獲特等獎，鮮薯產(chǎn)量達5190 kg，干薯產(chǎn)量達1826.88 kg，是目前在中國種植面積最大的甘薯品種[3]。病毒病危害可引起甘薯種性退化、產(chǎn)量降低、嚴重威脅甘薯生產(chǎn)[4-5]，種植脫毒甘薯是防治病毒病的主要措施之一[6-8]。目前脫毒甘薯苗主要采用組培室內(nèi)切段快繁方法，存在成本高、工序繁雜等問題，影響脫毒甘薯的推廣應用[9-10]。研究探索甘薯脫毒苗的水培快繁方法對于構(gòu)建植物工廠、進行工廠化育苗、提高種植效益具有重要參考價值。植物激素不僅調(diào)控植物生長發(fā)育[11]，而且對外界病毒等多種生物[12-13]和非生物[14-15]脅迫具有重要防御調(diào)控作用，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中具有重要的應用價值。水培種植是目前中國推廣越來越廣泛的設施栽培方式之一[16]，適宜的營養(yǎng)液配方是建立水培體系的關(guān)鍵因素[17-19]。甘薯水培最早于20世紀80年代開始，當時美國國家航空航天局為了解決太空航行中密閉環(huán)境下的植物生產(chǎn)進行甘薯水培研究[20]。在營養(yǎng)元素篩選研究方面，李潤根等[21]對‘臺農(nóng)71’菜用甘薯水培營養(yǎng)液配方進行篩選，發(fā)現(xiàn)華南農(nóng)大A配方營養(yǎng)液為最適營養(yǎng)液。覃華勇等[22]對‘湘菜2號’、‘47129’、‘福薯10號’和‘CY-14’等4個菜用甘薯品種進行水培營養(yǎng)液配方研究，發(fā)現(xiàn)日本田園配方為菜用甘薯最適宜的水培營養(yǎng)液配方，霍格蘭營養(yǎng)液配方次之，‘湘菜2號’、‘47129’與‘福薯10號’、‘CY-14’相比更適合水培生產(chǎn)。周雅倩等[23]對4個觀賞甘薯品種進行了水培營養(yǎng)液篩選研究，發(fā)現(xiàn)瑪格瑞特和卡羅琳紫品種的最適營養(yǎng)液為1/2倍循環(huán)水生菜

營養(yǎng)液，卡羅琳銅和三色薯最適營養(yǎng)液為1/2霍格蘭營養(yǎng)液，MS營養(yǎng)液不適合用于上述品種的水培。羅林會等[19]篩選出脫毒甘薯組培苗水培適宜營養(yǎng)液為霍格蘭營養(yǎng)液。周全盧等[10]以‘西成薯007’脫毒苗為材料，建立了流動式水培快繁體系，發(fā)現(xiàn)改良MS營養(yǎng)液(MA)優(yōu)于MS營養(yǎng)液。在水培甘薯與土壤栽培差異研究方面，陳選陽等[24]對葉菜型甘薯莖尖營養(yǎng)品質(zhì)與硝酸鹽含量進行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與土壤栽培相比，水培可增加甘薯Vc、黃酮和硝酸鹽含量，蛋白質(zhì)含量沒有顯著變化；同時發(fā)現(xiàn)，水培營養(yǎng)液中增加硝態(tài)氮會提高葉菜型甘薯硝酸鹽含量，適量銨態(tài)氮可減緩硝酸鹽含量的增加，而酰胺態(tài)氮可以降低硝酸鹽含量。植物激素在甘薯生長發(fā)育中具有重要調(diào)控作用。目前水培甘薯激素的研究還未見報道。由于不同甘薯品種對營養(yǎng)液有不同的要求[10,18]，有必要對中國主栽甘薯品種‘商薯19’適宜的水培營養(yǎng)液進行研究。本研究在前人研究的基礎(chǔ)上，采用靜置水培方式，通過設置不同培養(yǎng)液的不同濃度處理，調(diào)查水培條件下甘薯苗的生長指標，期望篩選出‘商薯19’脫毒苗水培最適營養(yǎng)液。同時擬對水培甘薯植株與土壤栽培甘薯植株葉片中的激素種類及差異進行研究，了解水培條件下甘薯植株激素種類及其變化情況。明確‘商薯19’脫毒苗最適水培營養(yǎng)液以及水培對內(nèi)源激素的影響，為建立植物工廠、‘商薯19’脫毒苗水培快繁體系、降低脫毒苗成本、促進脫毒苗應用、提高甘薯生產(chǎn)效益、利用激素進行生長發(fā)育調(diào)控等生產(chǎn)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料及設備

1.1.1 水培材料及設備 植物材料為‘商薯19’脫毒苗，株高5 cm。水培設置為塑料托盤和泡沫漂浮板，塑料托盤長36 cm，寬6 cm，厚0.3 cm；漂浮板為厚1 cm的泡沫板，自行剪切成30 cm的方形定植板，每隔3 cm打一個定植孔，參考羅林會等[18]已報道的設備。試驗于2016年3月—2018年9月在河南省農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所完成。

1.1.2 植物激素檢測材料及設備 植物材料為常規(guī)培養(yǎng)的‘商薯19’脫毒苗和水培培養(yǎng)的‘商薯19’脫毒苗。試劑有：超純水、乙腈、甲醇、甲酸、相應的色譜純試劑、Waters固相萃取小柱等。所需的標準物質(zhì)：水楊酸(SA)、吲哚乙酸(IAA)、茉莉酸(JA)、吲哚丙酸(IPA)、脫落酸(ABA)、4-氯-吲哚乙酸(4-Cl-IAA)、赤霉素 3(GA3)、利波腺苷(2-iPA)、赤霉素7(GA7)、玉米素(cZ)、赤霉素4(GA4)、6-糠氨基嘌呤(6-KT)、反玉米素(tZ)、吲哚丁酸(IBA)、反玉米素核苷(tZR)、N6-異戊烯基腺嘌呤(2-iP)等。所需儀器設備有：分析天平、超聲波清洗器、0.45μm微膜過濾器、震蕩混勻器、超高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(AB公司QTrap6500)等。

1.2 水培營養(yǎng)液及處理設置

參考前人研究結(jié)果[10,22-23]，以循環(huán)水生菜營養(yǎng)液配方(Ⅰ)、霍格蘭營養(yǎng)液配方(Ⅱ)和MS營養(yǎng)液配方(Ⅲ)營養(yǎng)液中大量元素劑量設置1/4、1/2、1倍劑量共9種處理（表1），設清水培養(yǎng)為對照處理。所有溶液配制均用靜置1天后的清水配制。每種營養(yǎng)元素先配成母液，隨后稀釋成最終工作濃度。用梅特勒pH計(Mettler-FE20)測量pH，用NaCl或NaOH的0.5 M溶液調(diào)節(jié)pH至6.5。每個培養(yǎng)盤放4 L培養(yǎng)液。每個處理重復3次，每次種植甘薯10株，共30株。培養(yǎng)條件溫度(26±2)℃，光照16 h，黑暗8 h。

表1 營養(yǎng)液大量元素用量

各種營養(yǎng)液微量元素為通用配方[18]：H3BO33 mg/L，MnSO4·4H2O 1.5 mg/L，ZnSO4·7H2O 0.2 mg/L，CuSO4·5H2O 0.1 mg/L，(NH4)6Mo7O24·4H2O 0.03 mg/L，Na2Fe-EDTA20 mg/L。

1.3 生長指標測定及方法

1.3.1 生根情況調(diào)查 在水培5天和20天時，用直尺測量每株甘薯最大根長。

1.3.2 鮮根重測量 水培20天時，摘取每株所有根，用衛(wèi)生紙吸干鮮根水分，放置電子稱上，稱取每株鮮根重。

1.3.3 鮮根體積測量 水培20天時，把稱量后的每株鮮根迅速放入盛有一定量清水中的量筒中，讀取溶液差，計算出每株根的體積。

1.3.4 莖長情況調(diào)查 在水培養(yǎng)第20天時，用直尺測量每株莖長，統(tǒng)計每株平均莖長。

1.3.5 葉綠素含量調(diào)查 采用葉綠素測量儀器(Chlorophyll mete SPAD-502 Plus)分別在第 1、5、10、15、20天測定水培苗葉綠素相對含量(SPAD)，每株測定全部葉片葉綠素含量，計算每株平均葉綠素含量相對值。

1.4 水培苗移栽成活率調(diào)查

在水培苗水培20天后，隨機剪切攜帶3～4葉片的莖段進行基質(zhì)中扦插移栽，混合基質(zhì)配方（珍珠巖:蛭石:草炭土=1:1:1），溫度和光照同1.2。移栽扦插15天后調(diào)查成活株數(shù)，統(tǒng)計成活率。

1.5 激素含量檢測

根據(jù)已報導甘薯激素檢測的采樣方法[25-27]采樣。以常規(guī)種植為對照，分別取對照和水培培養(yǎng)甘薯3株頂部第4片葉，以混合樣作為檢測樣品。隨后利用超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜技術(shù)（AB公司QTrap6500）進行16種激素檢測，參考已報到的方法[28-29]進行激素檢測。液相色譜條件為：色譜柱：BEH C18色譜柱(2.1×100 mm，1.8μm)流動相：0.1%甲酸水溶液（溶劑A），乙腈（溶劑B），梯度洗脫，流速0.25 mL/min，進樣量：5μL，柱溫：40℃。質(zhì)譜條件為：電噴霧電離源(ESI)，正負離子電離模式。離子源溫度500℃，離子源電壓5500～4500 V，氣簾氣30 psi，霧化氣和輔助氣均為50 psi。樣品中激素含量計算見式(1)。

1.6 數(shù)據(jù)處理及分析

借助Excel進行數(shù)據(jù)整理及圖表繪制，并采用DPS 7.05(SPSS 20.0)統(tǒng)計分析軟件進行方差分析及Ducan新復極差法多重比較分析。激素數(shù)據(jù)通過AB Analyst化學工作站和Excel軟件進行處理分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同營養(yǎng)液對‘商薯19’脫毒苗生根莖的影響

調(diào)查結(jié)果顯示（表2），水培5天時1/2Ⅱ處理營養(yǎng)液中最大根長達11 cm，平均根長7.93 cm，最大根長和平均根長均為最高值。Ⅱ處理營養(yǎng)液中最大根長10.3 cm，平均根長6.83 cm；Ⅰ處理營養(yǎng)液中最大根長8.5 cm，平均根長6.28 cm；1/2Ⅰ處理營養(yǎng)液中最大根長9.5 cm，平均根長為7.38 cm；1/2Ⅲ處理營養(yǎng)液中最大根長9.5 cm，平均根長7 cm；1/4Ⅰ處理營養(yǎng)液中最大根長9 cm，平均根長6.48 cm；1/4Ⅱ處理營養(yǎng)液中最大根長9 cm，平均根長6.28 cm。1/2Ⅱ、Ⅱ、1/2Ⅰ、Ⅰ、1/2Ⅲ、1/4Ⅰ、1/4Ⅱ處理之間平均根長差異不顯著，但與清水對照差異顯著。水培20天時，最大根長為Ⅱ和1/2Ⅱ處理營養(yǎng)液，均為35.5 cm，其次1/2Ⅲ處理為34.3 cm。Ⅱ處理營養(yǎng)液平均根長為31.44 cm，1/2Ⅱ處理平均根長31.39 cm；Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、1/2Ⅰ、1/2Ⅱ、1/2Ⅲ處理之間平均根長差異不顯著。

表2 不同營養(yǎng)液中‘商薯19’的生長情況比較

鮮根重調(diào)查結(jié)果表明（表2），平均鮮根重最大的為1/2Ⅱ處理營養(yǎng)液為7.32 g，其次是1/2Ⅰ處理為6.91 g/株，2個營養(yǎng)液的差異不顯著。Ⅱ處理的為6.03 g、Ⅰ處理為5.43 g、Ⅲ處理為5.11 g、1/2Ⅲ處理為5.5 g、1/4 Ⅰ處理為5.10 g、1/4Ⅱ處理為5.67 g，該6個處理之間的平均鮮根重差異不顯著。

鮮根體積調(diào)查結(jié)果顯示（表2），水培20天，平均鮮根體積最大為1/2Ⅱ處理營養(yǎng)液為6.83 mL，其次為1/2Ⅰ處理營養(yǎng)液為6.5 mL，2個處理平均鮮根體積數(shù)值之間差異不顯著。清水對照平均鮮根體積為4.33 mL，數(shù)值最小。

莖長調(diào)查結(jié)果顯示（表2），1/2Ⅱ處理的最大莖長16.5 cm，莖長最長。Ⅱ處理最大莖長16.2 cm，Ⅲ處理最大莖長15 cm，Ⅰ處理最大莖長13.5 cm，1/2Ⅰ處理最大莖長為14.7 cm，1/2Ⅲ處理最大莖長為15.2 cm。平均最大莖長中，1/2Ⅱ處理為13.93 cm，數(shù)值最大，其次Ⅱ處理為13.5 cm，1/2Ⅰ處理為13.1 cm，1/2Ⅲ處理為13.06 cm，Ⅲ處理為12.41 cm，該5個處理間平均莖長差異不顯著。

2.2 不同營養(yǎng)液對‘商薯19’脫毒苗葉綠素的影響

葉綠素調(diào)查結(jié)果表明（表3），‘商薯19’脫毒苗水培1天時葉綠素含量值在39左右，各個處理之間差異不顯著。水培5天，葉綠素相對含量平均值最大為1/2Ⅰ處理營養(yǎng)液，為37.97，其次1/2Ⅱ處理營養(yǎng)液的為37.36，另外1/2Ⅲ處理營養(yǎng)液的為37.25，3個配方處理之間葉綠素含量平均值差異不顯著。水培10天，1/2Ⅱ處理營養(yǎng)液平均葉綠素相對含量值最高為46.53，Ⅰ處理為45.3、Ⅱ處理為45.53、1/2Ⅰ處理45.74，該4個處理之間葉綠素相對含量平均值差異不顯著。水培15天時，Ⅱ處理中平均葉綠素含量值最高為48.24，其次1/2Ⅱ為48.08；其中1/2Ⅰ、1/2Ⅱ、Ⅰ、Ⅱ這4個處理的平均葉綠素含量值之間差異不顯著。水培20天，Ⅱ處理中平均葉綠素含量值最大為48.41，其次1/2Ⅱ的為47.75，Ⅰ處理的為47.45，這3個配方營養(yǎng)液處理的葉綠素含量平均值之間差異不顯著。表3結(jié)果顯示，葉綠素含量平均值除清水對照外，隨著培養(yǎng)時間的增加，呈現(xiàn)先降低后升高再降低現(xiàn)象，即第5天調(diào)查時降低，10、15天調(diào)查時升高，第20天調(diào)查時又降低。SPAD值為葉綠素含量的相對比較值，SPAD值高表明葉片葉綠素含量高，有利于提高光合作用強度和養(yǎng)分積累，甘薯的生長速度較快。

表3 不同營養(yǎng)液中‘商薯19’葉片綠素含量及方差分析平均值 SPAD

2.3 激素檢測結(jié)果

檢測結(jié)果顯示，在甘薯植株中檢測到11種激素，其中含量較多的有5種激素，分別為ABA、4-Cl-IAA、SA、JA、IAA。與對照植株相比，ABA、SA、IAA和2-iPA激素含量降低，其中ABA對照甘薯植株葉片含量131.868 ng/g，水培植株葉片為37.756 ng/g；IAA對照植株葉片含量16.251 ng/g，水培植株葉片中含量7.859 ng/g，這2種激素含量分別降低了71.37%和51.64%。另外，4-Cl-IAA、JA等含量增加，其中JA對照植株葉片含量12.044 ng/g，水培植株葉片含量為39.948 ng/g，增加了231.68%。詳細見表4。

表4 植物激素檢測結(jié)果

2.4 水培甘薯移栽成活情況調(diào)查

15天后，調(diào)查結(jié)果表明，移栽50棵，成活48棵，移栽成活率為96%。

3 結(jié)論與討論

本研究對栽培面積最大的甘薯品種‘商薯19’進行水培培養(yǎng)基的篩選優(yōu)化，并首次研究了甘薯水培與常規(guī)栽培相比甘薯葉片激素種類和含量的變化，為進一步研究奠定基礎(chǔ)。

試驗結(jié)果表明‘商薯19’脫毒苗，水培20天時，1倍霍格蘭培養(yǎng)液中植株平均葉綠素含量值最大為48.41，1/2霍格蘭營養(yǎng)液配方葉綠素相對含量為47.75，2個處理間葉綠素相對含量平均值差異不顯著。培養(yǎng)20天，1/2霍格蘭營養(yǎng)液中平均每株莖長13.93 cm，霍格蘭營養(yǎng)液平均每株莖長13.50 cm，2個處理的平均莖長數(shù)據(jù)之間差異不顯著。在1/2霍格蘭營養(yǎng)液中，植株的根長、根體積、平均鮮根重、平均莖長均最好，‘商薯19’脫毒苗水培最適營養(yǎng)液配方為1/2霍格蘭營養(yǎng)液配方。

霍格蘭營養(yǎng)液配方作為水培營養(yǎng)液中經(jīng)典配方，已廣泛應用于不同植物的營養(yǎng)液的的篩選研究中[30-32]。如戚冰潔等[32]水培條件下利用1/4倍霍格蘭營養(yǎng)液生根，1/2倍霍格蘭營養(yǎng)液進行甘薯苗復壯培養(yǎng)研究外源氯元素對甘薯苗脅迫影響。Grant等[33]利用1/2倍霍格蘭營養(yǎng)液研究塊根養(yǎng)分成分與溶液營養(yǎng)成分的關(guān)系。周雅倩等[23]研究發(fā)現(xiàn)‘卡羅琳銅’和‘三色薯’2種觀賞甘薯最適營養(yǎng)液為1/2霍格蘭營養(yǎng)液。另外，覃華勇等[22]篩選出日本田園配方為菜用甘薯最適水培配方。周雅倩等[23]研究發(fā)現(xiàn)‘瑪格瑞特’和‘卡羅琳紫’觀賞甘薯最適營養(yǎng)液為1/2倍循環(huán)水生菜營養(yǎng)液。因此，不同甘薯品種，水培的適宜培養(yǎng)基差異比較大，應根據(jù)不同品種篩選適宜的培養(yǎng)基。

本研究采用水培法避免了常規(guī)超凈工作臺上無菌操作組培的復雜程序[10]，所用營養(yǎng)液無需高溫滅菌、添加凝固物等，降低了培養(yǎng)苗的成本。通過研究首次確立了‘商薯19’水培適宜營養(yǎng)液，為進一步研究提供參考。本研究初步確立了營養(yǎng)液配方，而有關(guān)‘商薯19’水培甘薯快繁研究，如最佳快繁莖段、培養(yǎng)時間、移栽最適環(huán)境等問題有待進一步研究確認。

本研究首次利用超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜技術(shù)對常規(guī)栽培和水培栽培的‘商薯19’植株葉片進行16種激素檢測，結(jié)果檢測出11種激素。11種激素中茉莉酸、吲哚乙酸和脫落酸含量變化比較大。與對照相比，水培植株葉片中茉莉酸含量增加了231.68%，ABA含量降低了71.37%，IAA降低了51.64%，結(jié)果可能與水培有關(guān)。有關(guān)研究表明，茉莉酸和脫落酸可參與植物的抗病和抗旱信號傳導[12]。在甘薯激素研究中，目前主要集中在激素對地上部和地下部塊根生長發(fā)育的影響方面[27,33]，但同一激素在不同條件下對甘薯的影響存在差異，如張海燕等[33]研究發(fā)現(xiàn)在干旱脅迫下地上部干重與葉片IAA、GA、ZR含量呈正相關(guān)，與ABA呈負相關(guān)，地下部干重與塊根中IAA、GA、ZR含量呈正相關(guān)，與ABA含量呈負相關(guān)。王慶美等[27]研究發(fā)現(xiàn)塊根干重與塊根ABA、ZR等激素含量呈正相關(guān)，與IAA、GA4、iPA無明顯的相關(guān)性。由于激素作用含量影響因素較多，本研究只是初步研究水培條件下植株葉片激素含量的種類和變化，而水培條件下植物激素的分布規(guī)律、調(diào)控途徑以及內(nèi)源激素和外源植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)對植株的作用影響等需要進一步研究。

隨著植物工廠在農(nóng)業(yè)研究中的廣泛應用，植物的水培將會對農(nóng)業(yè)帶來革命性變化。如楊其長等[34]研究

出在植物工廠下，60天成熟的水稻，把大田環(huán)境120天成熟的水稻生長周期縮短了一半，為作物育種提供參考。本研究初步篩選了最大甘薯品種‘商薯19’的水培營養(yǎng)液和甘薯葉片內(nèi)源激素種類及變化情況，其結(jié)果可為甘薯設施農(nóng)業(yè)、建立甘薯植物工廠[33]、降低脫毒苗成本[10]、提高甘薯營養(yǎng)物質(zhì)含量[16-17,24]和利用激素調(diào)控甘薯生長發(fā)育[9,35]、抗病抗逆[11]等進一步研究提供參考。