生防菌盾殼霉對(duì)油菜根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響

楊瀟湘，黃小琴，張 蕾，張重梅，鮮赟曦，周西全，劉 勇

（1四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，成都 610066；2農(nóng)業(yè)農(nóng)村部西南作物有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 610066）

0 引言

由核盤(pán)菌(Sclerotinia sclerotiorum)侵染危害造成的油菜菌核病在中國(guó)油菜種植區(qū)域普遍發(fā)生，常年株發(fā)病率為10%～30%，嚴(yán)重年份達(dá)80%以上，致使油菜減產(chǎn)10%～70%[1-2]。據(jù)國(guó)家油菜產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系調(diào)查，中國(guó)每年僅長(zhǎng)江流域因該病所造成的損失超過(guò)20億元。因此，解決油菜菌核病威脅對(duì)保障油菜生產(chǎn)至關(guān)重要。在農(nóng)作物病害防治策略中，應(yīng)用抗病品種是病害防治最為安全環(huán)保、高效的措施，但目前生產(chǎn)上沒(méi)有菌核病抗病種質(zhì)資源可以利用。當(dāng)前化學(xué)農(nóng)藥防治為油菜菌核病的主流防治措施，然而菌核病危害巨大，防治藥劑多數(shù)成本較高，因化學(xué)農(nóng)藥長(zhǎng)期使用導(dǎo)致抗藥菌株的產(chǎn)生和環(huán)境污染等問(wèn)題也日益嚴(yán)重[3]。為此，發(fā)展環(huán)境友好型的有益微生物防治措施勢(shì)在必行。盾殼霉(Coniothyrium minitans)作為核盤(pán)菌的重寄生真菌，能夠寄生和殺死核盤(pán)菌的菌核和菌絲，降低油菜菌核病的初侵染源和再侵染，在菌核病的生物防治中具有廣闊的應(yīng)用前景[4-6]。然而，大量外源生防微生物被人為添加至土壤環(huán)境中，極有可能導(dǎo)致土壤中原有微生物的群落結(jié)構(gòu)和生態(tài)功能等遭到破壞[7]。因此，有必要研究生防微生物施用后對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響。前人研究結(jié)果表明，生防微生物除了通過(guò)菌株自身直接的作用來(lái)發(fā)揮生物防治功效，還可通過(guò)改善根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)、提高土壤有益菌的豐度和多樣性、降低病蟲(chóng)害的發(fā)生和危害、改善土壤環(huán)境、增加土壤養(yǎng)分、實(shí)現(xiàn)土壤保育，提高作物品質(zhì)等方面，利于農(nóng)作物的可持續(xù)健康發(fā)展[7-10]。前期工作中，本課題組分離獲得1株對(duì)核盤(pán)菌具有強(qiáng)寄生效果的盾殼霉菌株Cm2004，其油菜菌核病生防效果顯著。本研究擬進(jìn)一步評(píng)價(jià)盾殼霉Cm2004菌株對(duì)土壤微生物群落的影響，明確其是否能改善土壤環(huán)境?；诖?，本研究通過(guò)田間試驗(yàn)研究盾殼霉Cm2004對(duì)油菜菌核病的防治效果和高通量測(cè)序分析其對(duì)油菜根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響，為生防微生物的安全使用及評(píng)價(jià)提供重要理論依據(jù)，以期通過(guò)生防微生物的施用改善土壤微生態(tài)環(huán)境，保障油菜可持續(xù)安全生產(chǎn)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

供試生防菌盾殼霉菌株Cm2004，由四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所油菜病害研究室分離獲得。‘川油36’是由四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所選育而成的油菜品種。

1.2 研究區(qū)概況

研究區(qū)位于四川省綿陽(yáng)市安州區(qū)塔水鎮(zhèn)浮萍村，地理坐標(biāo)為 31°27′51.63″N，104°25′13.71″E，海拔為555.20 m。該地屬亞熱帶濕潤(rùn)季風(fēng)氣候，具有氣候溫和、雨量充沛、日照充足、四季分明等特征。多年平均氣溫16.3℃，年平均日照時(shí)數(shù)1058.7 h，年平均降水量1261 mm。

1.3 油菜菌核病調(diào)查和根際土壤采集

試驗(yàn)設(shè)置噴施盾殼霉區(qū)和清水對(duì)照區(qū)2個(gè)試驗(yàn)區(qū)域。用清水將本課題組制備的盾殼霉Cm2004分生孢子制劑稀釋成106個(gè)/mL，在油菜苗期間隔10天噴施2次(450 L/hm2)，以清水噴施為對(duì)照。在最后一次噴施30天后進(jìn)行土壤樣品采集。在每個(gè)區(qū)域選取距離10 m以上的3個(gè)呈三角形的采樣點(diǎn)，根據(jù)5點(diǎn)取樣法將油菜挖出并抖落根部附著的疏松土壤，收集與油菜根系緊密結(jié)合的土壤并混勻成一個(gè)土壤樣品，經(jīng)2 mm篩后于-80℃冰箱冷凍暫存[11]。

在油菜成熟期進(jìn)行菌核病病害調(diào)查，每個(gè)處理按土壤采集方式選擇3個(gè)調(diào)查點(diǎn)，每個(gè)調(diào)查點(diǎn)以5點(diǎn)取樣法隨機(jī)選取50株，分別調(diào)查油菜菌核病病株數(shù)，并進(jìn)行發(fā)病情況定級(jí)。根據(jù)調(diào)查結(jié)果計(jì)算油菜菌核病的病情指數(shù)和防效[1]。

1.4 土壤總DNA提取、PCR擴(kuò)增及高通量測(cè)序

土壤DNA提取采用試劑盒E.Z.N.A?.Mag-Bind?Stool DNA Kit(OMEGA)進(jìn)行，DNA定量和提取質(zhì)量分別采用Nanodrop 2000(Thermo Scientific)和瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

細(xì)菌的16SrDNA的V4區(qū)域采用引物515F(5'-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3')和 806R(5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3')[12]進(jìn)行擴(kuò)增，真菌rDNA的ITS1區(qū)域采用引物ITS1-1737F(5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3')和ITS2-2043R(5'-GCTGCGTTCTTCAT CGATGC-3')[13]進(jìn)行擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物經(jīng)過(guò)純化回收、質(zhì)量檢測(cè)合格后委托北京諾和致源科技有限公司執(zhí)行建庫(kù)及測(cè)序工作。

1.5 高通量測(cè)序數(shù)據(jù)分析

原始測(cè)序序列經(jīng)Trimmomatic軟件質(zhì)控后，根據(jù)97%的相似度采用Uparse軟件將其聚類(lèi)成為OTUs[14]。OTUs物種注釋分析采用Qiime軟件與數(shù)據(jù)庫(kù)Unit進(jìn)行，并統(tǒng)計(jì)在各分類(lèi)水平上的群落組成[15-16]；Rarefaction分析采用Mothur方法進(jìn)行[17]；稀釋曲線利用R軟件制作并評(píng)估各樣品在測(cè)序強(qiáng)度間的差異；α-多樣性指數(shù)，包括Chao1、ACE、Shannon和Simpson指數(shù)通過(guò)Qiime軟件計(jì)算，并評(píng)估序列文庫(kù)的多樣性。

2 結(jié)果與分析

2.1 生防菌盾殼霉Cm2004對(duì)油菜菌核病的防治效果

由表1數(shù)據(jù)可知，清水對(duì)照區(qū)域(CK)的油菜菌核病發(fā)病較嚴(yán)重，病株率和病情指數(shù)分別高達(dá)74.64%和46.13；而噴施盾殼霉區(qū)域(CM)的菌核病發(fā)病較輕，病株率和病情指數(shù)分別降低至23.33%和9.37，防治效果明顯，病指防效達(dá)79.70%。說(shuō)明盾殼霉Cm2004可以有效防控油菜菌核病，生防效果顯著。

表1 盾殼霉對(duì)油菜菌核病的防治效果

2.2 高通量測(cè)序數(shù)據(jù)預(yù)處理結(jié)果

稀釋曲線一般用于評(píng)估微生物組測(cè)序量或樣本量的飽和情況，由圖1可知，隨著測(cè)序數(shù)據(jù)的增加，細(xì)菌和真菌的稀釋曲線斜率平滑、變化較小、趨于平緩，說(shuō)明測(cè)序量已充足。覆蓋度(Coverage)用于評(píng)估結(jié)果是否符合真實(shí)情況。盾殼霉處理(CM)和對(duì)照組(CK)的細(xì)菌和真菌覆蓋度分別為98.8%和99.7%、98.7%和99.7%（表2），說(shuō)明本研究的測(cè)序結(jié)果較符合油菜根際土壤真實(shí)的細(xì)菌和真菌群落。CM和CK產(chǎn)生的細(xì)菌和真菌OUT數(shù)分別為2176和653、2194和544，表明噴施盾殼霉對(duì)真菌OUT數(shù)影響較大。此外，CM土壤真菌的ACE指數(shù)、Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)均大于CK（表2），表明盾殼霉的施用增加了土壤真菌群落豐富度和多樣性比例。

圖1 油菜根際土壤細(xì)菌和真菌的稀釋曲線

表2 土壤細(xì)菌和真菌豐度和微生物多樣性

2.3 施用盾殼霉對(duì)土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響

細(xì)菌門(mén)水平群落結(jié)構(gòu)分析結(jié)果顯示（圖2）：相對(duì)豐度大于1%的優(yōu)勢(shì)菌門(mén)從多到少依次為變形菌門(mén)(Proteobacteria)、擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)、放線菌門(mén)(Actinobacteria)、芽單胞菌門(mén)(Gemmatimonadetes)和酸桿菌門(mén)(Acidobacteria)。施用盾殼霉會(huì)使變形菌門(mén)和芽單胞菌門(mén)相對(duì)豐度比例增加，但會(huì)降低放線菌門(mén)的相對(duì)豐度。

圖2 細(xì)菌門(mén)水平的物種相對(duì)豐度

在細(xì)菌屬水平上（圖3），含量最多的前10種依次是鞘脂單胞菌屬(Sphingomonas)、unidentified_Chitinophagace-ae、寡養(yǎng)單胞菌 (Stenotrophomonas)、羅河桿菌屬(Rhodanobacter)、 溶桿菌屬 (Lysobacter)、Stenotrophobacter、Paeniglutamicibacter、獨(dú)島菌屬(Dokdonella)、假單胞菌(Pseudomonas)和地桿菌屬(Geobacter)。施加盾殼霉能顯著增加鞘脂單胞菌屬、溶桿菌屬和獨(dú)島菌屬等的相對(duì)豐度，會(huì)顯著降低unidentified_Chitinophagaceae、寡養(yǎng)單胞菌和地桿菌屬等的相對(duì)豐度。

2.4 施用盾殼霉對(duì)土壤真菌群落結(jié)構(gòu)的影響

在門(mén)水平上（圖4），相對(duì)豐度大于1%的優(yōu)勢(shì)菌門(mén)依次是油壺菌門(mén)(Olpidiomycota)、子囊菌門(mén)(Ascomycota)、被孢霉門(mén)(Mortierellomycota)和擔(dān)子菌門(mén)(Basidiomycota)。施用盾殼霉后會(huì)子囊菌門(mén)、被孢霉門(mén)、擔(dān)子菌門(mén)等豐富度比例均增加。

圖3 細(xì)菌屬水平的物種相對(duì)豐度

圖4 真菌門(mén)水平的物種相對(duì)豐度

在真菌屬水平上（圖5），含量最多的前10種依次是油壺菌屬(Olpidium)、梭孢殼屬(Thielavia)、短梗蠕孢屬(Trichocladium)、鐮刀菌屬 (Fusarium)、耐干霉菌(Xeromyces)、Cutaneotrichosporon、Apiotrichum、曲霉屬(Aspergillus)、Plectosphaerella和被孢霉屬(Mortierella)。施加盾殼霉可增加短梗蠕孢屬、鐮刀菌屬、曲霉屬、Plectosphaerella等屬的豐富度，會(huì)顯著降低梭孢殼屬和Cutaneotrichosporon的相對(duì)豐度。

圖5 真菌屬水平的物種相對(duì)豐度

3 討論與結(jié)論

盾殼霉作為植物病原真菌核盤(pán)菌的重寄生真菌，在油菜菌核病的生物防治中具有較好的應(yīng)用前景。然而，生防菌盾殼霉的施用必然會(huì)導(dǎo)致大量外源真菌被添加到土壤環(huán)境中，對(duì)油菜根際土壤原有微生物群落結(jié)構(gòu)的影響尚不明確。本研究憑借高通量測(cè)序技術(shù)分析盾殼霉Cm2004施用后土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的變化。結(jié)果表明：噴施盾殼霉Cm2004不僅可以有效防控油菜菌核病，還可改善油菜根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)。

土壤微生物群落豐度和微生物多樣性常采用ACE指數(shù)、Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)等來(lái)表征，其數(shù)值的高低可以揭示土壤微生物種類(lèi)和功能的差異[18-19]。一般來(lái)講，指數(shù)越高，微生物種類(lèi)或數(shù)量越豐富。本研究噴施盾殼霉菌株Cm2004后，油菜根際土壤真菌的ACE指數(shù)、Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)均高于對(duì)照組，表明施加盾殼霉提高了油菜根際土壤真菌群落的豐富度和多樣性比例，使油菜田土壤真菌群落向穩(wěn)定和多樣化方向發(fā)展，這與祝靜等[10]添加木霉菌肥對(duì)土壤真菌微生物群落結(jié)構(gòu)的影響一致。而土壤細(xì)菌的這些指數(shù)變化不明顯，說(shuō)明外源盾殼霉施用后對(duì)土壤原有細(xì)菌沒(méi)有脅迫作用，不會(huì)造成原有土壤細(xì)菌微生物群落結(jié)構(gòu)的改變。

土壤微生物種群數(shù)量和群落組成與植物病害的發(fā)生密切相關(guān)。生防微生物的應(yīng)用一方面可通過(guò)菌株自身的直接作用發(fā)揮生防效果，另一方面還可通過(guò)改變土壤微生物群落結(jié)構(gòu)影響植物病害的發(fā)生[7]。本研究發(fā)現(xiàn)，盾殼霉的施用可以增加一些有益微生物的種群豐度。在門(mén)水平上，噴施盾殼霉使得土壤中變形菌門(mén)和子囊菌門(mén)的相對(duì)豐度比例增加。這與PANG等[20]和祝靜等[10]在番茄和玉米根部噴施生防真菌得到的結(jié)果相似。很多變形菌門(mén)的細(xì)菌在平衡周邊環(huán)境和有效促進(jìn)植株對(duì)土壤養(yǎng)分的吸收利用方面起著至關(guān)重要的作用。子囊菌門(mén)的真菌多為腐生真菌，起著降解有機(jī)質(zhì)的重要作用。此外，施加盾殼霉還會(huì)促進(jìn)擔(dān)子菌門(mén)相對(duì)豐度的增加，土壤中擔(dān)子菌門(mén)真菌可促進(jìn)土壤物質(zhì)分解、循環(huán)，大多為土壤有益微生物[10]。在屬水平上，施加盾殼霉可增加鞘氨醇單胞菌屬、溶桿菌屬、曲霉屬等屬的豐富度。鞘氨醇單胞菌屬菌大都具有生物降解的能力，可以產(chǎn)生被利用的高分子聚合物，除了常用于秸稈腐熟、改良土壤結(jié)構(gòu)和增加土壤養(yǎng)分外[21-23]，還可以用于植物病害的生物防治[24]。溶桿菌屬細(xì)菌是一類(lèi)重要的微生物資源，大都具有典型的溶菌活性，可以抑制多種病原真菌、細(xì)菌的生長(zhǎng)，殺滅病原線蟲(chóng)，還能誘導(dǎo)植物抗性，增強(qiáng)抗病能力[25]。曲霉屬真菌在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中用處廣泛，可以用于秸稈腐熟，利于土壤中營(yíng)養(yǎng)成分含量的提高，還可以降磷，具有開(kāi)發(fā)成溶磷生物菌劑的潛力。曲霉屬真菌的代謝產(chǎn)物還可以防治植物線蟲(chóng)和水稻白葉枯病等，在生物防治領(lǐng)域的應(yīng)用潛力巨大[26-28]。因此，筆者推測(cè)盾殼霉菌株Cm2004可以有效防治油菜菌核病的原因也包含有兩方面。盾殼霉的施用一方面可以寄生腐爛土壤里的核盤(pán)菌菌核，大大減少菌核病的初侵染源；另一方面噴施盾殼霉可以改善土壤微生物結(jié)構(gòu)，增加土壤有益微生物的豐度，從而減輕病原菌的侵染與危害。此外，筆者發(fā)現(xiàn)盾殼霉處理和對(duì)照土壤中均存在大量油壺菌屬真菌（根腫菌按照舊版的分類(lèi)系統(tǒng)，屬于油壺菌屬真菌）[29]，這與我們田間調(diào)查發(fā)現(xiàn)油菜根腫病較為嚴(yán)重的結(jié)果一致。

綜上，施用盾殼霉Cm2004可以增加土壤真菌種群豐度和多樣性比例，改善土壤微生物群落結(jié)構(gòu)，提高有益菌含量，對(duì)油菜菌核病的防效高達(dá)79.70%。研究結(jié)果明確了生防菌盾殼霉施用后對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響，為該生防菌的田間大面積推廣應(yīng)用提供了重要理論依據(jù)。