三氯生對峨眉林蛙蝌蚪的毒性效應(yīng)研究

李馨雨，魏順鑫，張雨娟，鐘櫟，夏雪梅，馮俊寧，劉琦，袁潔，陳鳳儀，唐家興，陳貴英

（四川師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，成都610101）

據(jù)不完全統(tǒng)計，三氯生（TCS）作為一種廣譜抗菌劑，全球年產(chǎn)量約1 500 t，被大量添加于個人護理品（香皂、牙膏、除臭劑等）、紡織纖維（玩具、內(nèi)衣等）中（Daughton，1999），因具有較強的疏水性和脂溶性，在環(huán)境中難以揮發(fā)降解（梁麗萍等，2021）。TCS 主要通過生活污水排放進入環(huán)境，現(xiàn)有污水處理工藝不能將其完全去除（Chenet al.，2014），近年來在湖底沉積物（Wuet al.，2015）、地表水（Yavuzet al.，2015）、污水（Zhouet al.，2015）中被頻繁檢測到，如表層水體中的質(zhì)量濃度高達478 ng·L?1，沉積物中的高達 2 723 ng·L?1（Zhaoet al.，2013）。早在 2011 年我國 TCS 排放量就達到了66.1 （t張芊芊，2015）。水生生物是TCS 的主要作用對象（楊雅淇等，2019），TCS 對水生生物的毒性比其對細菌的毒性大100~1 000 倍（Chalew &Halden，2009），對水生生物個體以及在分子水平上都有毒害作用（鄭欣等，2016）。南美牛蛙Leptodac?tylus pentadactylus蝌蚪在 0.15 μg·L?1TCS 中飼養(yǎng)18 d 后，T3 調(diào)控的發(fā)育變形過程受到干擾（Binelliet al.，2009）；斑馬魚Danio rerio胚胎在0.5 mg·L?1TCS中培養(yǎng)6 d 后的孵化時間顯著延遲（Oliveiraet al.，2009）；太平洋樹蛙Pseudacris regilla幼體在30 μg·L?1TCS 中飼養(yǎng)7 d 后，體長和體質(zhì)量發(fā)育均受到抑制（Marlattet al.，2013）。據(jù)統(tǒng)計，全球約有60%以上的兩棲動物正遭受滅絕的威脅（麥春蘭，2021）。

兩棲動物幼體在水中發(fā)育至完全變態(tài)，期間主要攝食浮游動植物，依靠皮膚和鰓呼吸，對水環(huán)境變化十分敏感，能夠在短時間內(nèi)通過其形態(tài)、行為等對水環(huán)境變化做出響應(yīng)，從而成為研究水污染的重要模式生物。峨眉山地處四川盆地西南部，為亞熱帶季風(fēng)氣候，是中國重要的生物資源庫，動物資源豐富，兩棲動物種類繁多（孫子健，2021）。峨眉林蛙Rana omeimontis屬兩棲綱Am?phibian 無尾目 Anura 蛙科 Ranidae 林蛙屬Rana，廣泛分布于峨眉山報國寺、清音閣農(nóng)家附近的淺水域中，其蝌蚪在水中發(fā)育至完全變態(tài)需要8個月左右，易受到農(nóng)家排出的含有TCS 生活污水的影響。目前TCS影響峨眉林蛙蝌蚪的研究鮮見報道，本研究以峨眉林蛙蝌蚪（G22 期）為實驗對象，研究了TCS對蝌蚪的急性毒性和慢性毒性效應(yīng)，以期為當(dāng)?shù)厮Y源的治理及保護提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 受試生物與材料

峨眉林蛙受精卵于2020 年10 月17 日采自峨眉山報國寺旁的溪流中。TCS 購自Sigma 公司，純度99.99%。無水乙醇購自成都市科隆化學(xué)品有限公司。

1.2 方法

峨眉林蛙受精卵于室溫（20 ℃±1 ℃）下在曝氣3 d 的自來水中培育至孵出。待卵黃吸收完全之后，利用雞蛋黃喂食3 d，然后以0.05 g/10只蝌蚪的比例喂食螺旋藻，期間晝夜交替光照12 h。

實驗用水采用曝氣3 d 的自來水。實驗期間利用螺旋藻懸液喂食蝌蚪。實驗前將TCS 用無水乙醇配置成 5 mg·mL?1TCS 母液，4 ℃保存?zhèn)溆谩Ｊ褂脮r按照目標(biāo)濃度將TCS 母液加入500 mL 自來水中。

1.2.1 急性毒性實驗室溫（20 ℃±1 ℃）下，采用半靜態(tài)換水法進行預(yù)實驗，根據(jù)致死濃度和零死亡濃度，結(jié)合等間距原則將TCS 設(shè)置為13個濃度處理組（150 μg·L?1、200 μg·L?1、250 μg·L?1、300 μg·L?1、350 μg·L?1、400 μg·L?1、450 μg·L?1、500 μg·L?1、550 μg·L?1、600 μg·L?1、650 μg·L?1、700 μg·L?1和750 μg·L?1），另設(shè)空白對照組與乙醇對照組，乙醇對照組的乙醇濃度與750 μg·L?1相當(dāng)，每組3 個平行。實驗開始時隨機投入15 只大小一致的蝌蚪（G22期）于500 mL 實驗液中，實驗期間晝夜交替光照12 h，每隔24 h 換水投毒投料，記錄蝌蚪的死亡狀況，并清除死亡個體。

1.2.2 慢性毒性實驗根據(jù)急性毒性實驗結(jié)果，在死亡率最低濃度下設(shè)置慢性毒性實驗TCS 濃度（10 μg·L?1、30 μg·L?1、60 μg·L?1、90 μg·L?1、120 μg·L?1），另設(shè)空白對照組，每組3個平行。實驗前每組隨機投入18只大小一致的蝌蚪（G22期）于500 mL實驗液中，實驗期間晝夜交替光照12 h，每24 h 換水投毒投料。分別于0 d、7 d、14 d、21 d 測量蝌蚪生長發(fā)育的主要形態(tài)量度指標(biāo)，包括體質(zhì)量、全長、頭體長、尾長、吻長、眼間距（費梁等，2012），并利用體視鏡觀察組織器官發(fā)育（肝臟、心臟、鰓等）的情況。

1.2.3 統(tǒng)計分析急性毒性實驗數(shù)據(jù)使用Excel 2019 和Probit 分別進行數(shù)據(jù)整理和回歸分析，建立“劑量-效應(yīng)”線性方程，得到24 h、48 h、72 h、96 h 的半致死濃度（LC50）。蝌蚪存活安全濃度（SC）=48 h LC50×0.3（/24 h LC50/48h LC50）（2程劍等，2020）。

慢性毒性實驗數(shù)據(jù)使用Excel 2019 進行統(tǒng)計整理，并用SPSS 19.0 處理。采用單因素方差分析（One-Way ANOVA）比較0 d、7 d、14 d、21 d 空白對照組與實驗組蝌蚪的體質(zhì)量、全長、頭體長、尾長、吻長、眼間距。為了減小初始形態(tài)量度指標(biāo)對結(jié)果造成誤差，進一步分析了以上形態(tài)量度指標(biāo)每周增長量間的差異。顯著性水平設(shè)為α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 急性毒性實驗結(jié)果

空白對照組與乙醇對照組的死亡率為0，因此排除乙醇溶劑對蝌蚪死亡率的影響。蝌蚪暴露24 h時，150 μg·L?1、400 μg·L?1、450 μg·L?1、600 μg·L?1、650 μg·L?1、700 μg·L?1、750 μg·L?1濃度組出現(xiàn)死亡，750 μg·L?1濃度組全部死亡，表現(xiàn)為腹部發(fā)白、尾部卷曲、下沉；48 h 時，300 μg·L?1、350 μg·L?1、500 μg·L?1、550 μg·L?1濃度組出現(xiàn)死亡，600 μg·L?1和 700 μg·L?1濃度組全部死亡；72 h時，200 μg·L?1、250 μg·L?1濃度組出現(xiàn)死亡，400 μg·L?1、450 μg·L?1、500 μg·L?1、550 μg·L?1、650 μg·L?1濃度組全部死亡 ；96 h 后 ，150 μg·L?1濃 度 組 的 死 亡 率 最 低（2.2%）（表1）。

表1 不同三氯生濃度下峨眉林蛙蝌蚪的死亡率Table 1 Mortality of Rana omeimontis tadpoles by different concentrations of triclosan

利用Probit 建立線性方程，結(jié)果顯示，LC50分 別 為 613 μg·L?1（24 h）、482 μg·L?1（48 h）、289 μg·L?1（72 h）和 266 μg·L?1（96 h），96 h-SC為 89 μg·L?1（表 2）。

表2 急性毒性實驗線性方程Table 2 Linear equation of acute toxicity test

2.2 慢性毒性實驗結(jié)果

2.2.1 峨眉林蛙蝌蚪組織器官發(fā)育（肝臟、心臟、鰓）比較觀察暴露21 d，空白對照組、10 μg·L?1、30 μg·L?1、60 μg·L?1濃度組進入 G25 期，鰓蓋褶生長發(fā)育至全部遮蓋外鰓，心臟為暗紅色、形狀清晰，皮膚顏色逐漸加深（圖 1）。90 μg·L?1、120 μg·L?1濃度組進入G24 期，與同期空白對照組相比，鰓泛紅充血，心臟較小且泛紅充血，肝臟未見異常。

圖1 空白對照組峨眉林蛙蝌蚪（G25期）背面、腹面Fig. 1 Dorsal and ventral views of Rana omeimontis tadpoles（G25 stage）

2.2.2 峨眉林蛙蝌蚪形態(tài)量度指標(biāo)每周結(jié)果比較暴露前，30 μg·L?1濃度組的體質(zhì)量極顯著大于空白對照組（P<0.01）；暴露7 d，10 μg·L?1濃度組的體質(zhì)量、眼間距，30 μg·L?1濃度組的體質(zhì)量，90μg·L?1和120 μg·L?1濃度組的吻長均顯著（P<0.05）或極顯著（P<0.01）大于空白對照組；14 d 時，10 μg·L?1濃度組的體質(zhì)量、吻長均顯著（P<0.05）大于空白對照組，60 μg·L?1、90 μg·L?1、120 μg·L?1濃度組的頭體長顯著（P<0.05）或極顯著（P<0.01）小于空白對照組；21 d 時，60 μg·L?1濃度 組的 吻長 ，90 μg·L?1濃度組的體質(zhì)量、頭體長，120 μg·L?1濃度組的體質(zhì)量、全長、頭體長、吻長均顯著（P<0.05）或極顯著（P<0.01）小于空白對照組（圖2）。

圖2 TCS對峨眉林蛙蝌蚪形態(tài)量度指標(biāo)的影響Fig. 2 Effects of TCS on the morphological indicators of Rana omeimontis tadpoles

2.2.3 峨眉林蛙蝌蚪形態(tài)量度指標(biāo)每周增長量比較暴露7 d，10μg·L?1濃度組的眼間距，60 μg·L?1、90 μg·L?1、120 μg·L?1濃度組的吻長均被顯著（P<0.05）或極顯著（P<0.01）地促進發(fā)育；14 d 時，10 μg·L?1濃度組的眼間距，60 μg·L?1濃度組的頭體長、吻長，90 μg·L?1濃度組的體質(zhì)量、頭體長、吻長、眼間距，120 μg·L?1濃度組的體質(zhì)量、頭體長、吻長、眼間距均被顯著（P<0.05）或極顯著（P<0.01）地抑制發(fā)育；21 d 時，30 μg·L?1濃度組的體質(zhì)量，60 μg·L?1濃度組的體質(zhì)量、吻長，90 μg·L?1濃度組的體質(zhì)量、吻長、眼間距，120 μg·L?1濃度組的體質(zhì)量、全長、頭體長、尾長、吻長、眼間距均被顯著（P<0.05）或極顯著（P<0.01）地抑制發(fā)育，且60 μg·L?1、90 μg·L?1、120 μg·L?1濃度組的吻長發(fā)育幾乎停滯（圖3）。

圖3 TCS對峨眉林蛙蝌蚪形態(tài)量度指標(biāo)每周增長量的影響Fig. 3 Effects of TCS on the changes of morphological indicators of Rana omeimontis tadpoles

3 討論

3.1 峨眉林蛙蝌蚪的急性毒性實驗

峨眉林蛙蝌蚪的急性毒性實驗96 h-LC50為266 μg·L?1，96 h-SC 為 89 μg·L?1。根 據(jù)《化 學(xué) 農(nóng)藥環(huán)境安全評價試驗準(zhǔn)則GB/T 31270.18-2014》：急性毒性實驗中，LC50<100 μg·L?1為劇毒、100~1 000 μg·L?1為高毒、1 000~10 000 μg·L?1為中毒、>10 000 μg·L?1為低毒?？芍琓CS 對于峨眉林蛙蝌蚪為高毒化合物。TCS 對黑斑蛙Pelophylax nigromaculatus蝌蚪、非洲爪蟾Xenopus laevis蝌蚪（高昆等，2016）、伍德豪斯蟾蜍Bufo woodhousii woodhousii蝌 蚪 、南 方 豹 蛙Rana sphenocephala蝌蚪、板球青蛙Acris crepitans blanchardii蝌蚪（Palen?skeet al.，2010）均為高毒化合物。

3.2 峨眉林蛙蝌蚪的慢性毒性實驗

峨眉林蛙蝌蚪的慢性毒性實驗結(jié)果顯示，90 μg·L?1、120 μg·L?1濃度的 TCS 使其發(fā)育速度減 慢 ，變 態(tài) 發(fā) 育 減 緩 ；60 μg·L?1、90 μg·L?1、120 μg·L?1濃度的 TCS 對蝌蚪吻長的發(fā)育呈現(xiàn)前期促進、后期抑制的效應(yīng)。非洲爪蟾蝌蚪經(jīng)32.3 μg·L?1TCS 飼養(yǎng) 21 d 后，生長發(fā)育受到抑制（Fortet al.，2010），與本研究結(jié)果一致。許杰（2017）指出，中華大蟾蜍Bufo gargarizans蝌蚪（G3 期）在150 μg·L?1TCS 中暴露 40 d 后的體質(zhì)量與全長發(fā)育被促進。這可能是因為不同物種對TCS 的應(yīng)激不同。

TCS 能干擾水生動物的甲狀腺激素、雌激素、雄激素分泌而影響其生長發(fā)育（左超等，2020），如非洲爪蟾蝌蚪經(jīng)TCS慢性暴露21 d后，甲狀腺受體TR-β 的表達受到影響（Fortet al.，2010）；非洲爪蟾（G46 期）飼養(yǎng)在TCS 中一段時間后，甲狀腺發(fā)育被抑制（高昆，2016）。由此推測，本研究中TCS 對峨眉林蛙蝌蚪生長發(fā)育的影響可能是通過影響其相關(guān)激素水平或其受體表達，具體原因有待進一步深入研究。

TCS的危害研究集中在急性致死、慢性影響甲狀腺激素和生殖激素，以及體外細胞毒性效應(yīng)：高濃度（一般300~800 μg·L?1）對魚類、兩棲類等均有致死、致畸效應(yīng)（Binelliet al.，2009；Nassefet al.，2010；高昆等，2016）。低濃度（一般10~150 μg·L?1）對魚類（Kimet al.，2015；閆亮等，2018；張靈等，2019）、兩 棲 類（Fortet al.，2010；Palenskeet al.，2010；Marlattet al.，2013；許杰，2017）表現(xiàn)出一定的毒性，影響其相關(guān)激素水平。甚至人類血漿和母乳中均有較高的檢出率，具有較高的潛在生態(tài)風(fēng)險（Adolfsson-Ericiet al.，2002；高海萍等，2012；Chenet al.，2014；楊雅淇等，2019）?？茖W(xué)使用TCS對保障動物的正常生長繁殖、生態(tài)安全、人類健康都具有重要意義。