白頭翁種子休眠機制及破眠技術(shù)研究

董燕婧， 鐘國躍， 秦 倩， 牛藝鳴， 陳咪咪， 張壽文

(江西中醫(yī)藥大學中藥資源與民族藥研究中心， 南昌 330004)

白頭翁毛茛科植物白頭翁(Pulsatillachinensis(Bge.)Regei)的干燥根，其活性成分總皂苷及單體具有廣泛的抗癌活性，臨床和獸用中醫(yī)藥領(lǐng)域應用廣泛[1-2]。目前，關(guān)于白頭翁的相關(guān)研究多集中在化學成分、藥理活性等方面，藥用資源混亂，正品白頭翁資源量少且價格高，野生資源急劇減少，商品白頭翁摻假嚴重，質(zhì)量不穩(wěn)定、不均一現(xiàn)象嚴重，還未形成成熟的資源再生繁殖利用技術(shù)體系。

種子休眠是一種復雜的植物適應性特性，能夠使種子長期貯存并保持一定的生活力，從而保證物種的繁殖與生存[3-4]。作為一種保護機制，植物種子在自我保護的同時也為農(nóng)業(yè)、林業(yè)生產(chǎn)甚至是瀕危野生物種的保存方面帶來一定的挑戰(zhàn)[5]。大量研究表明，種子成熟時仍處于休眠狀態(tài)，延遲萌發(fā)的種子存在多種先天調(diào)控機制，即休眠類型不同[6-10]。形態(tài)生理休眠(MPD)種子較為常見，此類型種子沒有完整的胚結(jié)構(gòu)，還有一定的萌發(fā)抑制物，常見于百合科、五加科以及部分毛茛科植物，如重樓[11]、細辛[12]、五加[11]、黃連[13]等藥用植物。白頭翁種子細小，紡錘形，表面被絨毛，成熟時胚發(fā)育不完全，存在生理后熟的現(xiàn)象，自然狀態(tài)下萌發(fā)率低，且易霉爛[14-15]。目前主要通過GA3、低溫、超聲波、PEG-6000等處理方法打破白頭翁種子休眠，未見關(guān)于其休眠特性、休眠類型、休眠機制等方面的研究。

基于此，本試驗以野外采集的白頭翁種子為材料，對種子吸水特性、種皮透性、種胚成熟度、種子萌發(fā)抑制物以及種子破眠方法進行研究，分析白頭翁種子休眠機制，確定種子休眠類型，尋找有效打破白頭翁種子休眠的方法，為白頭翁種子播種育苗技術(shù)的完善提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)支持。

1 材料、儀器和試劑

野外采集白頭翁種子，經(jīng)江西中醫(yī)藥大學鐘國躍教授鑒定為毛茛科植物白頭翁(Pulsatillachinensis(Bge.)Regei)的種子。

主要儀器和試劑：數(shù)顯游標卡尺150 mm(德國美耐特)，電子天平FA 2004 G(上海菁還儀器有限公司)，光照培養(yǎng)箱LRZ-260 A(杭州綠博儀器有限公司)，過氧化氫(西隴科學股份有限公司)，TKY-BMB型石蠟包埋機(湖北泰康醫(yī)療設(shè)備有限公司)，RM 2245型切片機(德國徠卡)，生物顯微鏡(麥克奧迪實業(yè)有限公司)，SMZ 745體視變焦顯微鏡(尼康儀器(上海)有限公司)，赤霉素(上海藍季科技發(fā)展有限公司)。

2 方 法

2.1 種子吸水特性研究

隨機選取種子100粒，室溫條件下浸泡在水中，分別于0，2，4，6，8，10，12，24，48 h后取出，濾紙吸干表面水分，稱重，測量種子橫徑(mm)、縱徑(mm)，重復3次，取平均值。

2.2 種皮透性研究

隨機選取種子100粒，分別浸泡在質(zhì)量分數(shù)為0.00%，1.00%，2.00%，3.00%，4.00%的過氧化氫溶液中1 h后取出，流水下洗凈表面殘留過氧化氫后浸泡在水中，每隔2 h后測定其重量，每個處理3次重復，取平均值。

2.3 種子種胚成熟度研究

取外觀飽滿堅實、無蟲洞的白頭翁種子進行解剖，觀察并對種子胚發(fā)育結(jié)構(gòu)進行動態(tài)監(jiān)測。成熟種子石蠟切片制作方法如下：

1) 固定。隨機選取白頭翁種子若干，剪去羽毛，F(xiàn)AA固定液中固定24 h以上。

2) 脫水。將固定好的種子進行抽氣處理，把組織里氣泡排出，然后放在流水中沖洗一晝夜。最后將種子按次序放進不同梯度濃度的乙醇中逐步脫水。如果一天不能完成全部脫水，可進行到70%乙醇中過夜保存。

3) 透明。將上述種子放在不同濃度梯度透明劑中透明。

4) 浸蠟。將完全透明的材料放在不同濃度梯度的石蠟中進行浸蠟。

5) 包埋。待包埋機里石蠟完全溶化后，將要包埋的材料放進包埋機理兩側(cè)的任意一個蠟室中，把模具放在載物臺正對出蠟口處，先往模具滴1～2滴蠟，把組織迅速夾到模具中間，橫切面朝上，蓋上包埋蓋子，再往模具上慢慢滴蠟直至沒出蓋子底0.2 cm時將模具移到冷卻臺冷卻。全凝固后，將蠟塊取出保存等待切片。

6) 切片。

7) 展片、粘片、烘片。先把蠟片分片置于42 ℃水浴鍋中展開，再用涂有蛋清的載玻片撈起，注意材料要與玻片上下邊緣平行，最后置于35 ℃烘箱中烘干。

8) 脫蠟與染色制片。二甲苯與乙醇梯度脫蠟，番紅、固綠染色，乙醇沖洗，加拿大樹膠封片。

9) 顯微鏡下觀察種胚結(jié)構(gòu)。使用1.0% TTC對不同萌發(fā)階段的種子進行染色，解剖后在體式顯微鏡下觀察種胚發(fā)育情況。

2.4 萌發(fā)抑制物研究

稱取白頭翁種子1.0 g，研磨，加入一定量的蒸餾水，超聲提取30 min，冷卻至室溫后過濾，最后定容至25 mL，制備獲得白頭翁種子抑制物粗提液。粗提液設(shè)置20%、40%、60%、80%、100%等5個濃度梯度，以純水為對照。隨機選取白菜種子100粒，光照培養(yǎng)，并分別加入5 mL不同濃度的白頭翁種子抑制物粗提液，分別于12 h、24 h、36 h、48 h、60 h記錄白菜種子發(fā)芽情況，計算發(fā)芽率。

2.5 破眠方法研究

2.5.1層積處理

取河沙，篩去大顆粒雜質(zhì)后置于高溫高壓滅菌鍋中滅菌30 min(103.4 kPa(1.05 kg/cm2)，121 ℃)。河沙滅菌后取出，加入一定量的無菌水至手握成團，捏之即散的狀態(tài)后，備用。隨機取白頭翁種子100粒，100 mg/L的GA3浸泡12 h(置于4 ℃冰箱中)后取出，再用1 000倍的多菌靈浸泡30 min，流水下沖洗干凈，濾紙吸干表面水分，剪去羽毛，于河沙中層積處理。層積方法如下：

1) 暖層積3 d；

2) 暖層積3 d+較低溫暖層積3 d；

3) 暖層積3 d+較低溫暖層積3 d+冷層積3 d；

4) 冷層積3 d；

5) 暖層積3 d+冷層積3 d；

6) 冷層積3 d+暖層積3 d+冷層積3 d。

層積溫度[16]為：暖層積30 ℃/15 ℃、較低溫暖層積20 ℃/10 ℃，冷層積15 ℃/6 ℃。

層積處理后去除明顯干癟、發(fā)霉、蟲洞的種子，進行萌發(fā)培養(yǎng)，每天觀察種子萌發(fā)情況，并補足水分。保持濾紙為濕潤狀態(tài)，以胚根沖破種殼視為萌發(fā)，重復3次，取平均值。

2.5.2種子GA3處理

隨機選取100粒種子，分別用50、100、150、200 mg/L GA3浸泡12 h，以蒸餾水浸泡12 h為對照。處理后取出，1 000倍的多菌靈浸泡種子30 min，流水下沖洗干凈，濾紙吸干種子表面水分，剪去羽毛，在智能光照培養(yǎng)箱中萌發(fā)培養(yǎng)，每天觀察種子萌發(fā)情況，并補足水分。保持濾紙為濕潤狀態(tài)，以胚根沖破種殼視為萌發(fā)，重復3次，取平均值。

3 結(jié)果與分析

3.1 種子吸水特性研究

通過測定不同浸泡時間下種子百粒重、橫徑、縱徑變化，研究種子吸水規(guī)律。方差分析結(jié)果(表1)顯示，不同浸泡時間下種子百粒重存在顯著性差異(p<0.05)。

表1 白頭翁種子吸水曲線測定指標方差分析Table 1 Analysis results of variance analysis of water absorption curve of Pulsatilla chinensis seeds

從圖1可以看出，白頭翁種子吸水過程中呈現(xiàn)出3個階段：快速吸水期、緩慢吸水期、吸水飽和期。種子浸泡處理6 h內(nèi)為快速吸水期，吸水率從0.00%急劇上升到95.41%；6～10 h逐漸變?yōu)榫徛冢窟_107.10%；10 h后種子重量幾乎無變化，吸水率趨緩，吸水飽和，進入吸水飽和期。

圖1 白頭翁種子吸水曲線Fig.1 Water absorption curve of Pulsatilla chinensis seeds

3.2 種皮透性研究

白頭翁種子在浸泡10 h后吸水飽和，繼續(xù)浸泡，種子百粒重變化差異不顯著，基于此，測量過氧化氫處理下10 h白頭翁種子重量變化數(shù)據(jù)。

重復測量方差分析[17]：Mauchly’s 球形度檢驗中p<0.05(表3)，數(shù)據(jù)非對稱，多變量檢測結(jié)果(表4)表明，不同浸泡時間對種子百粒重具有顯著影響(p<0.05)，隨著浸泡時間的推進，種子百粒重發(fā)生顯著性變化。浸泡時間與不同濃度之間存在一定的交互作用(p<0.05)，隨著時間的推進，不同組別百粒重變化情況不一致。成對比較結(jié)果顯示，同一浸泡時間下與0.00%過氧化氫組對比，其余組別白頭翁種子百粒重差異不顯著(表2，圖2)，白頭翁種皮透性良好。

表2 過氧化氫處理白頭翁種子百粒重成對比較結(jié)果Table 2 Pairwise comparison results of 100-seed weight of Pulsatilla chinensis treated with hydrogen peroxide

表3 莫奇來球形度檢驗Table 3 Moqilai sphericity test

圖2 不同濃度過氧化氫處理下種子百粒重變化Fig.2 Changes in 100-grain weight of seeds treated with different concentrations of hydrogen peroxide

3.3 種胚成熟度研究

圖3結(jié)果顯示，種子處理前，胚乳豐富，充斥著種子的絕大部分體積，不同程度地包裹了胚結(jié)構(gòu)；種胚則發(fā)育不完全，部分種胚處于球形胚階段(圖3 A、圖3 C、圖3 E，圖4 a)，部分處于心形胚階段(圖3 B)，有些種子甚至未出現(xiàn)胚結(jié)構(gòu)，種子內(nèi)部完全被胚乳占據(jù)(圖3 D、圖3 E)。

表4 多變量檢驗Table 4 Multivariate test

圖3 白頭翁成熟種子解剖觀察 Fig.3 Anatomical observation of the mature seeds of Pulsatilla chinensis

通過TTC染色，手工解剖種子跟蹤觀察其發(fā)育過程發(fā)現(xiàn)，成熟種子胚結(jié)構(gòu)較小，胚乳占據(jù)絕大部分空間(圖4 a)；層積處理后，種胚開始發(fā)育，胚結(jié)構(gòu)由心形期逐漸發(fā)育成魚雷型胚結(jié)構(gòu)(圖4 b)；進一步培養(yǎng)白頭翁種子，胚分化，形成了明顯的2片子葉結(jié)構(gòu)(圖4 f)。下一階段，胚根開始形成，并逐步?jīng)_破種殼，種子萌發(fā)(圖4 d～圖4 f)。

圖4 白頭翁種子種胚發(fā)育情況 Fig.4 Embryo development of Pulsatilla chinensis seeds

3.4 種子萌發(fā)抑制物研究

由表5可知，不同濃度的白頭翁種子浸提液處理白菜種子，隨著處理時間的延長，白菜種子發(fā)芽率結(jié)果不同。萌發(fā)處理12 h、24 h時后，浸提液濃度對白菜種子發(fā)芽率無顯著性影響，當萌發(fā)時間為36 h、48 h、60 h時，白菜種子萌發(fā)率差異顯著。萌發(fā)處理36 h時，與ck組相比，濃度為80%、100%的浸提液處理下，白菜種子發(fā)芽率顯著降低。48 h處理下，浸提液對白菜種子萌發(fā)均具有抑制作用，與ck組相比，白菜種子發(fā)芽率顯著降低。60 h處理下，浸提液濃度對白菜種子抑制程度減弱，與ck組相比，除濃度為80%、100%處理對白菜種子萌發(fā)抑制明顯外，其余組發(fā)芽情況與ck組差異不顯著。

表5 同一時間下白頭翁種子浸提液處理白菜種子發(fā)芽率成對比較結(jié)果Table 5 The pairwise comparison results of the germination rate of Chinese cabbage seeds treated with different Pulsatilla chinensis seed extracts at the same time point

表5(續(xù))

數(shù)據(jù)服從莫奇來球形度檢驗(p>0.05)，故以主體內(nèi)效應檢驗為最終的檢驗結(jié)果(p<0.001)，不同時間點發(fā)芽情況具有顯著性差異。成對比較結(jié)果顯示，12 h、24 h下，與ck相比，各組別處理下白菜種子發(fā)芽率無顯著變化。36 h時，與ck相比，60%、80%浸提液處理白菜種子發(fā)芽率差異顯著。48 h下，處理組與ck白菜種子發(fā)芽率差異顯著。60 h下，100%濃度浸提液處理白菜種子，與ck相比，種子發(fā)芽率差異顯著。不同濃度的白頭翁種子浸提液處理白菜種子，各處理時間下的白菜種子發(fā)芽率均低于ck(圖5)。不同濃度的浸提液對白菜種子發(fā)芽有抑制作用，表明白頭翁種子內(nèi)存在萌發(fā)抑制物。

圖5 不同濃度白頭翁種子浸提液處理下白菜種子萌發(fā)情況 Fig.5 Germination of Chinese cabbage seeds treated with different concentrations of Pulsatilla chinensis seed extract

3.5 種子破眠方法研究

3.5.1層積處理

對白頭翁種子進行層積處理，對比不同條件下種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)等指標，結(jié)果見表8、表9、圖6。單因素方差結(jié)果顯示，不同層積方法處理下白頭翁種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)存在顯著性差異(p<0.05)。與ck組相比，暖層積、冷層積、暖層積+冷層積、冷層積+暖層積+冷層積發(fā)芽率降低，存在顯著性差異；暖層積+較低溫暖層積、暖層積+較低溫暖層積+冷層積處理條件下白頭翁種子發(fā)芽率有所下降，但與ck組相比，差異不顯著。從發(fā)芽勢角度分析，ck組的發(fā)芽勢顯著高于其他處理組，為(0.78±0.04)。對比不同組的發(fā)芽指數(shù)發(fā)現(xiàn)，暖層積+較低溫暖層積、暖層積+較低溫暖層積+冷層積處理條件下種子發(fā)芽起始萌發(fā)時間縮短，發(fā)芽較集中，顯著高于ck組，與其他層積處理組相比差異顯著。

表6 莫奇來球形度檢驗Table 6 Moqilai sphericity test

表7 主體內(nèi)效應檢驗Table 7 Intra-subject effect test

表8 不同層積處理條件下白頭翁種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)方差分析Table 8 Variance analysis of germination rate,germination potential and germination index of Pulsatilla chinensis seeds under different stratification conditions

單因素方差結(jié)果(表9，圖6)顯示，不同層積方法處理下白頭翁種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)存在顯著性差異(p<0.05)。與ck組相比，暖層積、冷層積、暖層積+冷層積、冷層積+暖層積+冷層積發(fā)芽率降低，存在顯著性差異；暖層積+較低溫暖層積、暖層積+較低溫暖層積+冷層積處理條件下白頭翁種子發(fā)芽率有所下降，但與ck組相比，差異不顯著。從發(fā)芽勢角度分析，ck組的發(fā)芽勢顯著高于其他處理組，為(0.78±0.04)。對比不同組的發(fā)芽指數(shù)發(fā)現(xiàn)，暖層積+較低溫暖層積、暖層積+較低溫暖層積+冷層積處理條件種子發(fā)芽起始萌發(fā)時間縮短，發(fā)芽較集中，顯著高于ck組，與其他層積處理組相比差異顯著。

圖6 不同層積處理條件下白頭翁種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)情況Fig.6 The germination rate, germination potential and germination index of Pulsatilla chinensis seeds under different stratification conditions

圖7 不同濃度GA3處理下白頭翁種子發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)情況 Fig.7 Seed germination rate and germination index of Pulsatilla chinensis under different concentrations of GA3

表9 層積處理對白頭翁種子發(fā)芽的影響Table 9 Seed germination rate, germination potential and germination index of Pulsatilla chinensis under different stratification conditions

3.5.2GA3處理研究

表10結(jié)果表明，不同濃度的GA3處理種子后，種子發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)存在顯著差異。

表10 不同濃度GA3處理白頭翁種子發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)方差分析Table 10 Variance analysis of germination rate and germination index of Pulsatilla chinensis seeds treated with different concentrations of GA3

單因素方差分析結(jié)果顯示，不同濃度GA3處理白頭翁種子發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)差異顯著，發(fā)芽率、發(fā)芽勢呈先上升后下降的趨勢，150 mg/L GA3處理下白頭翁種子發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)達到最大值，分別為(36.67±8.82)%和(2.03±0.56)，與ck組相比差異顯著。

4 小結(jié)與討論

研究表明，種子成熟時仍處于休眠狀態(tài)，延遲萌發(fā)的種子存在多種先天調(diào)控機制，即休眠類型不同[6-10]。然而，大多數(shù)研究都未指出正在調(diào)查的休眠類型，或者最終屬于哪種休眠。一方面，種子處于休眠狀態(tài)還是非休眠狀態(tài)因物種和個體而異；另一方面，同一批次的種子可能含有休眠、非休眠以及條件選擇型休眠等多種類型。

在文獻研究的基礎(chǔ)上設(shè)計實驗，研究白頭翁種子種皮透性、種胚類型、萌發(fā)抑制物以及層積處理、GA3處理條件下種子萌發(fā)情況，從而綜合判斷白頭翁種子休眠類型。結(jié)果顯示，種子浸泡10 h左右吸水飽和，種子百粒重達到峰值。不同濃度過氧化氫處理種子，與ck組相比，種子吸水曲線趨勢一致；同一時間下，種子百粒重差異不顯著。白頭翁種子種殼透性較好，不會阻止種子吸收水分。顯微切片觀察白頭翁種胚類型發(fā)現(xiàn)，胚多處于球形胚、心形胚階段，發(fā)育不完全。白頭翁種子浸提液對白菜種子有一定的抑制作用，白菜種子發(fā)芽初期(12 h、24 h)，不同濃度的浸提液抑制作用不明顯；36 h下，高濃度浸提液(80%、100%)處理白菜種子發(fā)芽率顯著低于ck。隨著時間的推移，48 h下白菜種子萌發(fā)受到嚴重抑制，不同濃度浸提液的萌發(fā)抑制作用顯著。繼續(xù)延長處理時間，浸提液對白菜種子萌發(fā)抑制作用減弱，僅高濃度(80%、100%)作用下,白菜種子發(fā)芽率降低。繪制不同時間、不同浸提液濃度處理下，白菜種子發(fā)芽率變化趨勢曲線發(fā)現(xiàn)，浸提液處理組發(fā)芽率顯著低于ck組，不同濃度的浸提液對白菜種子發(fā)芽有抑制作用，白頭翁種子內(nèi)有一定的萌發(fā)抑制物。層積處理、GA3處理對白頭翁種子萌發(fā)潛力具有一定的影響。GA3處理下，種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢變化趨勢一致，先升后降，150 mg/L GA3處理下白頭翁種子發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)達到最大值。不同層積處理白頭翁種子時發(fā)現(xiàn)，暖層積+較低溫暖層積、暖層積+較低溫暖層積+冷層積處理條件下種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)表現(xiàn)均較好，且與ck組相比種子發(fā)芽時間提前，發(fā)芽時滯較短，發(fā)芽相對較集中，縮短萌發(fā)周期，但實驗過程中也發(fā)現(xiàn)，層積處理下，白頭翁種子更易發(fā)霉，種子霉變情況明顯。

綜上，白頭翁種子種皮透性良好，種子成熟時，胚發(fā)育不完全，多處于球形、心形階段，有的種子甚至沒有胚。不同濃度的白頭翁浸提液可以抑制白菜種子萌發(fā)，白頭翁種子內(nèi)有一定的萌發(fā)抑制物。一定濃度的GA3處理白頭翁種子，種子發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)顯著提高，GA3可以促進白頭翁種子萌發(fā)。暖層積+較低溫暖層積的處理方法可以縮短種子萌發(fā)時間，種子萌發(fā)相對較集中，萌發(fā)周期縮短。故白頭翁種子成熟時胚發(fā)育不完全，存在萌發(fā)抑制物是導致其休眠的主要原因，GA3可以促進白頭翁種子萌發(fā)，變溫層積可以促進種子萌發(fā)。初步判斷白頭翁種子休眠類型為中度簡單形態(tài)生理休眠。