不同玉竹種質資源多糖含量檢測及ISSR分析

何海永， 羅蕓芳， 楊雨環(huán)， 王金鳳， 譚清群， 趙玳琳， 李繼業(yè)， 呂 紅， 趙詩燦

(1.貴州省農業(yè)科學院植物保護研究所， 貴陽 550009；2.貴州綠之源農業(yè)技術服務有限公司， 貴陽 550009；3.貴州醫(yī)科大學， 貴陽 550025； 4.遵義師范學院， 貴州 遵義 563006)

玉竹[Polygonatumodoratum(Mill.) Druce]是百合科、黃精屬植物，為根狀莖，近圓柱形，根莖長且節(jié)多，故稱玉竹，最早記載于《神農本草經(jīng)》。是一種藥食兩用的中藥材，在多本醫(yī)書中均有記載，《本草綱目》中用于治療風熱濕毒，《本草便讀》中記載其具有滋陰養(yǎng)肺的功效，現(xiàn)代醫(yī)學研究發(fā)現(xiàn)，玉竹還具有治療糖尿病、抗腫瘤、增強免疫系統(tǒng)等作用[1-5]；玉竹還可以做成藥膳茶飲，如玉竹茶、玉竹粥、玉竹銀耳湯等[6]。我國玉竹種質資源非常豐富，市場上主要將玉竹分為栽培品種和野生品種，栽培品種有湘玉竹[7]、西玉竹、東玉竹和海門玉竹[8]4種，調查發(fā)現(xiàn)，貴州各個地區(qū)均有大量野生玉竹資源分布。玉竹的化學成分主要為甾體皂苷、黃酮、多糖、揮發(fā)油、凝集素等[10-14]，其中多糖為主要的生物活性物質，也是關注最多的方向之一。肖嵐等[2]在玉竹多糖對在體和離體肺癌腫瘤抑制作用中發(fā)現(xiàn)，玉竹多糖具有顯著的抗腫瘤作用。單穎等[15]通過50只小鼠模型發(fā)現(xiàn)，玉竹多糖可以通過提高超氧化物歧化酶活性來清除自由基，減輕機體的損傷以延緩衰老。季峰等[16]研究發(fā)現(xiàn)，玉竹多糖可以提高血清胰島素水平，達到降血糖的效果；Yan等[17]通過老鼠模型發(fā)現(xiàn)玉竹多糖可以降低腸道菌群數(shù)從而減輕肥胖。姜曉坤等[18]探索并明確了玉竹多糖微波超聲提取法最佳提取條件；仇宏偉[19]對超聲波輔酶法提取玉竹多糖進行優(yōu)化；陳銀霞[20]對玉竹水提取醇沉法探索和優(yōu)化；Yong[21]等對玉竹多糖堿提取法進行探索和優(yōu)化。

在玉竹遺傳分析方面，主要采取分子標記技術建立系統(tǒng)發(fā)育樹來進行分類[22]，潘清平等[23]探索發(fā)現(xiàn)，ISSR分子標記法可用于玉竹的品種鑒定和優(yōu)良品種選育研究；周鈺等[24]研究發(fā)現(xiàn)，微衛(wèi)星標記在玉竹遺傳多樣性和遺傳結構評價中具有較高的潛在價值。路放[25]對8個不同品種的玉竹采用ISSR分子標記技術可以從分子水平檢測出玉竹的差異，同時也證明不同產地玉竹具有較豐富的遺傳多樣性；郝久程等[26]研究發(fā)現(xiàn)，海島種群的遺傳多樣性高于大陸種群，說明獨立環(huán)境下的遺傳變異現(xiàn)象比開放環(huán)境下更為明顯；卜靜等[27]利用ISSR法對12個不同地區(qū)野生玉竹種質資源的遺傳結構和親緣性進行分析，發(fā)現(xiàn)不同產地玉竹有較高的遺傳多樣性，各產地個體差異較大可能與氣候環(huán)境相關；周曄等[28]用ISSR法鑒別中藥玉竹和小玉竹，為玉竹種質資源的鑒定與區(qū)別奠定基礎。但關于貴州不同地區(qū)及周邊省份的野生玉竹地方資源多糖含量和遺傳多樣性研究相對較少。 本試驗以來自貴州省不同地區(qū)的13個野生玉竹種質資源和4個其他省份的玉竹種質資源為材料，進行不同玉竹種質資源的多糖含量和群體遺傳結構特點研究，以期為玉竹種質資源的發(fā)掘、保護和利用提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

17個供試玉竹種質資源中，有13個樣品來自貴州；2個來在四川??；1個來自湖北??；1個來自河南省，樣品具體來源詳見表1。2020年3月采集各地玉竹種質資源的根莖，帶土進行包裝，用冰袋保存運回實驗室，再去除樣品的須根、莖桿后，將根莖洗凈后保存于-80 ℃超低溫冰箱中備用，記錄采集地點。

表1 玉竹種質資源的來源Table 1 Source of Polygonatum odoratum germplasm resources

試驗材料包括植物基因組DNA提取試劑盒(離心柱形)、2×TaqPCR Master Mix、核酸染料，均購自天根生化科技(北京)有限公司、6×Loading buffer(藍色)購自北京擎科新業(yè)生物技術有限公司、瓊脂糖(Agarose)和核酸提取液(24∶1)分別購自BioWest和Solarbio公司、無水乙醇購自重慶川東化工(集團)有限公司。

1.2 試驗器材

試驗器材包括TGrinder第三代變速組織研磨器套裝(天根生化科技(北京)有限公司)、thermo scientific/micro 17離心機(Denmark)、100-024 VAC PCR儀(新加坡BIO-RAD公司)、DYY-6 C型電泳儀(北京六一儀器廠)、凝膠成像系統(tǒng)BIO-RAD(美國BIO-RAD公司)、XK-1200型手掌式醫(yī)用離心機(江蘇新康醫(yī)療器械有限公司)、RADWAG天平(上海精密儀器儀表有限公司)、立式壓力滅菌鍋(上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠)、制冰機IMS-30(常熟市圣海電器有限公司)、電熱恒溫鼓風干燥箱(寧波江南儀器廠)、超純水機(四川沃特爾水處理設備有限公司)、MiniT-H 2 C三聯(lián)多用途金屬浴(成都浩康科技有限公司)、電子天平(奧豪斯儀器(上海)有限公司)。

1.3 試驗方法

1.3.1玉竹多糖含量檢測

將2020年3月保存?zhèn)溆玫挠裰窀o在恒溫干燥鼓風箱內60 ℃烘干3 d后送往遵義市精科信檢測有限公司，根據(jù)《中華人民共和國藥典》2020年第四版規(guī)定的相關檢測方法，在溫度為15 ℃、濕度為45%的條件下，采用紫外-分光光度法進行多糖含量的檢測。

1.3.2玉竹DNA提取

取玉竹新鮮組織約100 mg，加入液氮充分研磨，將研磨好的粉末迅速轉移到預先裝有700 μL 65 ℃預熱緩沖液GP 1的離心管中(實驗前在預熱的GP 1中加入巰基乙醇)，迅速顛倒混勻后，將離心管放在65 ℃水浴鍋中水浴20 min，水浴過程中顛倒離心管數(shù)次以混合樣品；再加入700 μL氯仿，充分混勻，12 000 r/min離心5 min；將所得上層水相溶液轉入一個新的離心管中，加入700 μL緩沖液GP 2，充分混勻；將混勻的液體轉入吸附柱CB 3中，12 000 r/min離心30 s，棄掉廢液；向吸附柱CB 3中加入500 μL緩沖液GD(使用前先加入無水乙醇)，12 000 r/min離30 s，倒掉廢液，將吸附柱CB 3放入收集管中；再向吸附柱CB 3中加入600 μL漂洗液PW(使用前先加入無水乙醇)，12 000 r/min離心30 s，倒掉廢液，將吸附柱CB 3放入收集管中(重復操作一次)；將吸附柱CB 3放回收集管中12 000 r/min離心2 min，倒掉廢液。將吸附柱CB 3置于室溫放置數(shù)分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液；將吸附柱CB 3轉入一個干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加100 μL洗脫緩沖液TE，室溫放置2～5 min，12 000 r/min離心2 min，將溶液收集到離心管中。

1.3.3引物篩選

試驗所用引物選用哥倫比亞大學公布的100條通用引物序列中的41條，由擎科生物公司合成。選用4個凝膠條帶清晰的DNA樣品對引物進行篩選，共篩選出11條較清晰的引物(表2)。

表2 ISSR擴增引物序列Table 2 ISSR amplification primer sequence

1.3.4ISSR-PCR擴增

根據(jù)所選用的2×TaqPCR Master Mix確定PCR反應體系和擴增程序，反應體系為25 μL：mix 12.5 μL，模板1 μL，引物1 μL，雙蒸水10.5 μL。反應程序的退火溫度根據(jù)引物的Tm值設定，94 ℃預變性3 min；94 ℃變性15 s，50 ℃退火20 s，72 ℃延伸60 s，變性到延伸進行34個循環(huán)，72 ℃再延伸7 min，最后4 ℃保持。

1.3.5凝膠電泳

取PCR產物與2.0%的瓊脂糖凝膠于120 V電泳85 min，制膠時加入TS-GelRed核酸凝膠染料用于對電泳條帶染色。電泳結束后，用凝膠成像儀在紫外條件觀察、拍照。

1.3.6ISSR分析

將有條帶出現(xiàn)的顯性位點用“1”表示，無條帶出現(xiàn)的隱形位點用“0”表示，建立“1”和“0”的數(shù)據(jù)矩陣，采用NTSYS 2.10聚類軟件計算遺傳相似系數(shù)，再根據(jù)遺傳相似系數(shù)利用UPGMA法建立系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結果與分析

2.1 不同來源玉竹多糖含量

檢測結果(表3)顯示，17份玉竹多糖含量分別為9.33%、9.31%、9.18%、9.05%、8.37%、8.35%、8.33%、8.28%、7.74%、7.67%、6.43%、6.41%、6.38%、6.31%、6.25%、6.24%和6.12%。參試材料的多糖含量均高于《中華人民共和國藥典》2020版四部所規(guī)定的藥用玉竹多糖含量(不得低于6%)。玉竹多糖含量最高的是來自四川省瀘州市敘永縣的13號(9.33%)；最低的是來自貴州省遵義市湄潭縣茅坪鎮(zhèn)的15號(6.12%)。17份玉竹多糖含量平均值為7.63%，其中2號、3號、4號、6號、7號、8號、11號、12號、13號和14號均高于平均值，表明這幾份玉竹種質資源的品質相對較好。

表3 不同玉竹種質資源的多糖含量Table 3 Polysaccharide content of different germplasm resources of Polygonatum odoratum

對不同玉竹種質資源多糖含量進行Duncan新復極差分析，結果表明，在5%顯著水平下，不同玉竹種質資源之間的多糖含量均呈顯著性差異。在1%顯著水平下，5號貴州遵義綏陽玉竹和1號貴州畢節(jié)七星關玉竹，多糖含量相差不大，二者之間差異不顯著，其余各個品種差異顯著。

2.2 多態(tài)位點分析

將初篩的11條引物分別與17個樣品模板進行PCR擴增，篩選出條帶多且清晰的2條引物(表4)，將篩選出來的2條引物再次與17個模板進行PCR擴增。對篩選出的2個ISSR引物的PCR產物用2%的瓊脂糖凝膠進行85 min的電泳，并用凝膠電泳成像系統(tǒng)在紫外條件下觀察并拍照保存。如圖1所示，2條引物共擴增出27組條帶，其中27組為多態(tài)性條帶，多態(tài)性條帶比例為100%，擴增片段均在200～3 000 bp之間。同一引物對不同來源的玉竹樣品的擴增條帶不完全相同，說明這兩條引物能較好地反映17個樣品的多態(tài)性。

表4 ISSR引物擴增條帶數(shù)Table 4 Number of bands amplified by ISSR primers

將引物單獨使用時，能將一些玉竹樣本與其他玉竹樣本區(qū)分開，如圖1B所示，4號玉竹在1 200 bp處與其他玉竹有區(qū)別；8號玉竹在500 bp處與其他玉竹有區(qū)別。將擴增出的條帶放在一起對比時，也能看出玉竹之間的相似和區(qū)別，如圖1 A，7號玉竹與5號、11號、12號在250 bp處都有條帶，與5號、6號、11號、12號、15號、17號玉竹在500 bp處都有條帶，與1號、2號、4號、5號、6號、7號、8號、9號、11號、12號、13號、15號玉竹在1 200 bp處都有條帶，這些條帶顯示7號玉竹與其他玉竹在多態(tài)性上存在差異。同樣，在圖1 B中6號玉竹和7號玉竹在條帶的多態(tài)位點上相同，推測6號玉竹和7號玉竹的遺傳背景可能相同。

圖1 引物UBC 844(A)和引物UBC 845(B)電泳圖 Fig.1 The electrophoresis diagram of primer UBC 844(A), the electrophoresis diagram of primer UBC 845(B)

2.3 遺傳相似性分析

使用NTSYSps 2.10 e軟件對17份玉竹種質資源進行聚類分析，在0.56至0.63處分為三大類。結果(圖2)表明，第Ⅰ類群含有10個品種，為1號、2號、3號、9號、10號、13號、15號、16號、17號，占總數(shù)的58.82%，7個品種來自貴州，其余3個分別來自四川和湖北。其中親緣性最近的1號和15號分別來自貴州省畢節(jié)市七星關區(qū)、貴州省畢節(jié)市納雍縣；2號和13號分別來自四川省雅安市石棉縣、四川省瀘州市敘永縣；9號和17號分別來自貴州省畢節(jié)市大方縣、貴州省貴陽市花溪區(qū)。第Ⅱ類群含5個品種，為5號、6號、7號、11號、12號、14號，占總數(shù)的29.41%，均來自貴州。親緣性最近的11號、12號分別來自貴州省貴陽市白云區(qū)和貴州省黔西南州興義市萬峰林鎮(zhèn)。第Ⅲ類群只有1個品種為4號，占總數(shù)的5.88%，來自河南省洛陽市蒿縣。

圖2 引物UBC 845系統(tǒng)發(fā)育樹 Fig.2 The phylogenetic tree of primer UBC 845

用NTSYS 2.10軟件分析ISSR標記的0，1數(shù)據(jù)矩陣，計算出17份玉竹的遺傳相似系數(shù)在0.163 8～0.923 0之間(表6)，平均遺傳相似系數(shù)為0.639 6，說明17份玉竹之間存在遺傳分化。其中1號與15號，2號與13、15號，10號與17號，11號與12號，13號與16號，15號與16號遺傳相似系數(shù)最大為0.923 0，說明親緣性最近。6號與8號的遺傳相似系數(shù)最小，為0.163 8，說明親緣性最遠。

表6 不同玉竹種質資源遺傳相似系數(shù)Table 6 Genetic similarity coefficients of different Polygonatum odoratum germplasm resources

3 討論與結論

參試的17份玉竹的多糖含量范圍為6.12%～9.33%，玉竹多糖含量極差分析表明，不同來源的玉竹多糖含量之間絕大多數(shù)都存在顯著差異，其中在1%的顯著水平下只有1號和5號玉竹的多糖含量沒有顯著差異。不同的玉竹多糖提取方法所檢測的多糖含量不同，本次玉竹檢測所用方法為水提醇法，并非玉竹多糖提取最高效的方法；同一種方法對不同產地的玉竹的提取效率也不同。檢測結果表明，不同地區(qū)的玉竹多糖含量有所區(qū)別，貴州省畢節(jié)市大方縣的6號玉竹、四川省瀘州市敘永縣的13號玉竹、湖北省宜昌市五峰土家族自治縣的3號玉竹、河南省洛陽市蒿縣的4號玉竹的多糖含量分別為9.31%、9.33%、8.28%、9.05%，具有明顯的差異。同一省份不同地區(qū)的玉竹多糖含量也有一定的差異，貴州省畢節(jié)市大方縣的6號玉竹、貴陽市的12號玉竹、安順市的14號玉竹的多糖含量分別為9.31%、8.37%、9.18%，也具有顯著的差異。同一省份同一地區(qū)的玉竹多糖含量也有區(qū)別，貴州省畢節(jié)市大方縣的6號、8號和9號玉竹的多糖含量分別為9.31%、8.35%和6.41%，差異也同樣明顯。總之，來自不同省份、同一省份的不同地區(qū)或同一地區(qū)的不同玉竹種質資源之間的多糖含量都有顯著差異，這與劉玉鳳等[29]的研究結果相一致。

參試玉竹的平均遺傳相似系數(shù)為0.636 9，多態(tài)性條帶占比為100%，表明不同玉竹種質資源具有較高的遺傳相似性，同時具有較豐富的遺傳多樣性。來自同一地區(qū)的玉竹大多數(shù)會聚為一類，1號與15號、10號與17號、11號與12號、15號與16號都來自貴州省、2號和13來自四川省，其遺傳相似系數(shù)均為0.923 0，親緣性最近。但也有例外，四川省13號與貴州省的16號，遺傳相似系數(shù)為0.923 0，親緣性也為最近。系統(tǒng)發(fā)育樹將玉竹種質資源在遺傳相似系數(shù)0.56處分為三類，除了第Ⅰ類群中的有省份混雜外，其余兩類都是來在同一省份。就系統(tǒng)發(fā)育樹而言，親緣性最近的都是來自同一省份的玉竹種質資源。這與卜靜等[27]在不同產地野生玉竹種質資源多樣性與親緣關系的ISSR分析中所得的結果相似。因此，玉竹的遺傳親緣性與生長地區(qū)之間有一定的相關性，也可能與人類活動導致玉竹種質資源的遷移有一定的關系。