玉米自交系苗期對低溫脅迫的響應機制研究

丁焓赟， 何序晨， 方 芳， 宋博文,2， 劇佳華,2， 劉家豐，胡 晉,2， 關亞靜,2， 胡偉民,2

(1.浙江大學農(nóng)業(yè)與生物技術學院， 杭州 310058；2.海南浙江大學研究院， 海南 三亞 572025)

玉米是我國三大糧食作物之一，面積和總產(chǎn)均居我國三大糧食作物之首，是人類和畜禽的重要食物來源，也是重要的工業(yè)和醫(yī)藥原料，與人民生活息息相關[1]。作為典型的喜溫C4植物，玉米對冷害比較敏感，且適應能力差[2]。低溫脅迫會影響玉米種子萌發(fā)，延遲出苗時間，降低田間出苗率，抑制幼苗正常的生長發(fā)育，極大地限制玉米栽培范圍和產(chǎn)量潛力[3-4]。

低溫脅迫對玉米生長和發(fā)育期間的生理生化代謝有明顯影響。研究表明，低溫脅迫會導致玉米生物膜系統(tǒng)的損傷，這種損傷與自由基和活性氧引起的膜脂過氧化有關。丙二醛(MDA)是膜脂過氧化的重要產(chǎn)物之一，在低溫脅迫下，MDA的大量積累會使膜透性增加，從而破壞生物膜的完整性。因此，通過測定MDA含量可以大致了解膜脂過氧化程度，以間接推斷膜系統(tǒng)的損傷程度和植物的抗冷性[5-7]。低溫脅迫可導致植物細胞中活性氧(ROS)的產(chǎn)生和清除之間的平衡紊亂，可能導致蛋白質(zhì)降解、膜損傷、酶失活等[8]。為應對ROS的大量積累所造成的損傷，植物在長期的進化過程中形成了一套比較完善的活性氧清除系統(tǒng)，其中由過氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)和抗壞血酸過氧化物酶(APX)等組成的抗氧化酶系統(tǒng)，在清除ROS過程中發(fā)揮了重要的保護作用[9]。滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的積累是植物在受到環(huán)境脅迫時一種普遍的代謝適應現(xiàn)象。其中，可溶性糖可結(jié)合細胞內(nèi)的一些大分子形成氫鍵來穩(wěn)定細胞膜并幫助維持細胞內(nèi)滲透壓，進而提高植物對溫度脅迫的耐受性[10]。脯氨酸(Pro)不僅具有滲透調(diào)節(jié)功能，還有助于穩(wěn)定亞細胞結(jié)構(gòu)，清除活性氧，以及在脅迫條件下緩沖細胞氧化還原電位，同時在緩解脅迫帶來的壓力時通過快速分解可以提供足夠的還原劑，以支持線粒體氧化磷酸化并產(chǎn)生ATP修復脅迫引起的損傷[11]。在多種環(huán)境脅迫下，植物體內(nèi)的Pro合成增加，降解減弱，從而積累Pro來提高植物的脅迫抗性[12]。

苗期是玉米生長發(fā)育的關鍵時期，也是對低溫較為敏感的時期，此時遭遇低溫，會導致田間出苗率和幼苗整齊度下降，降低農(nóng)田經(jīng)濟效益，對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)十分不利。我國長江中下游地區(qū)玉米春播時間一般在3月中下旬，此時氣候不穩(wěn)定，苗期往往會受到連續(xù)幾天的低溫影響，并且這種現(xiàn)象所造成的危害，在甜玉米自交系上表現(xiàn)得尤為明顯。本試驗采用抗冷型和冷敏感型材料各2份，在室內(nèi)培養(yǎng)箱3 ℃條件下進行苗期5 d低溫脅迫處理，測定苗期葉片的生理生化變化和相關基因表達，研究和分析甜玉米自交系對低溫脅迫的響應機制，為抗性品種的鑒定和選育提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

在前期田間和室內(nèi)雙向鑒定的基礎上，選用抗冷型和冷敏感型甜玉米自交系各2份，其中抗冷型為11號(S 29-1-1-2，種質(zhì)來源：溫帶)和18號(S 40-4-3-1-2-3，種質(zhì)來源：溫帶×熱帶)；冷敏感型為56號(T 5-5-1-1-1-3-1，種質(zhì)來源：溫帶×亞熱帶)和69號(T 46-3-5-3，種質(zhì)來源：亞熱帶)，4個自交系均為浙江大學選育。

熒光定量PCR試驗所用RNA提取試劑盒購自北京華越洋生物科技有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScriptTMRT reagent Kit)購自北京Takara公司；熒光定量試劑盒(AceQ qPCR SYBR Green Master Mix)購自南京諾唯贊生物科技有限公司。

1.2 方 法

1.2.1低溫處理及取樣

實驗采用基質(zhì)培養(yǎng)。挑選健康、大小均勻的甜玉米種子，0.5%的次氯酸鈉溶液消毒5 min，清水洗凈后播于培養(yǎng)盒內(nèi)，每盒30粒，合并3盒為1個重復。將其分為低溫組和正常生長組，每組3次重復，并置于25 ℃培養(yǎng)箱中發(fā)芽。低溫處理參照石云素[13]的方法并略作修改。待玉米幼苗長到2葉1心時，置于3 ℃培養(yǎng)箱中處理5 d，再置于25 ℃、12 h光照培養(yǎng)箱中恢復生長3 d。分別于低溫處理0 d、1 d、5 d及恢復生長1 d、3 d 時取樣進行生理生化指標測定；分別于低溫處理0 d、1 d、3 d、5 d及恢復生長3 d時取樣，液氮速凍后保存于-80 ℃冰箱用于后續(xù)基因表達量的測定。取樣時均取幼苗同一部位葉片，所有指標測量重復3次。

1.2.2生理生化指標測定

采用蒽酮比色法[14]測定Pro含量；采用茚三酮顯色法[14]測定可溶性糖含量。

取0.2 g葉片在pH值為7.8的磷酸緩沖液(PBS)中冰浴研磨成勻漿，4 ℃，10 000 r/min離心15 min，棄沉淀，上清液即為待測酶液。SOD活性測定采用氮藍四唑(NBT)光化還原法[15]；POD活性測定參照趙文賽[16]的方法并略作修改；CAT活性測定采用過氧化氫比色法[17]；APX活性測定采用抗壞血酸比色法[18]；谷胱甘肽還原酶(GR)活性測定參照Knorzer等[19]的方法并略作修改。

1.2.3熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測

以經(jīng)過低溫脅迫處理及正常生長的玉米幼苗葉片為試驗材料，提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，并以此為模板，以ZmActin為內(nèi)參基因，用LightCycler?96熒光定量儀進行擴增。反應總體積20 μL，包含100 ng cDNA(1 μL)，7.4 μL ddH2O，上、下游引物各0.8 μL，10 μL SYBR?Green Master Mix。qPCR反應程序為：95 ℃ 5 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，95 ℃ 15 s，共45個循環(huán)。

采用Primer 5.0設計特異性引物(表1)，引物由杭州擎科梓熙生物技術公司合成。數(shù)據(jù)分析采用LightCycler?96 system軟件和2-ΔΔCT法。

表1 實時定量PCR引物Table 1 Real-time quantitative PCR primers

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫脅迫對甜玉米自交系苗期生長的影響

由圖1可知，低溫處理前，4個甜玉米自交系幼苗均為2葉1心，長勢良好，葉色濃綠。3 ℃低溫處理1 d后，各自交系幼苗均未發(fā)生顯著變化。低溫處理5 d后，11號自交系幼苗仍未發(fā)生明顯變化；18號自交系少部分幼苗葉片邊緣失水萎蔫皺縮，并伴有青黑色；而56號自交系部分幼苗葉片開始萎蔫下垂，胚芽鞘變?yōu)楹稚?9號自交系幼苗也出現(xiàn)葉片失水萎蔫的現(xiàn)象?；謴蜕L1 d后的自交系相較于低溫處理第5天無明顯變化?；謴蜕L3 d后，11號和18號自交系雖有部分幼苗葉色發(fā)黃，但植株已恢復正常生長，葉片伸展，植株增長；而56號和69號自交系葉片萎蔫失水嚴重，已全部枯死。由此可見，11號與18號自交系抗冷性較強，而56號與69號自交系抗冷性差。兩個敏感型材料相比，56號自交系對低溫脅迫更敏感，在恢復生長3 d后基本干枯倒伏；69號自交系主要表現(xiàn)為葉片枯萎但莖稈大部分完好，只有部分幼苗出現(xiàn)倒伏情況。在后續(xù)生理生化指標和基因表達分析取樣時，56號與69號自交系恢復生長3 d后的樣品選取尚未完全死亡的幼苗葉片進行分析。

圖1 低溫處理期間及恢復生長后甜玉米自交系幼苗的生長情況 Fig.1 Growth of sweet corn inbred line seedlings during low temperature treatment and after recovery

2.2 生理生化指標

2.2.1低溫脅迫對玉米幼苗可溶性糖含量的影響

可溶性糖是植物抵抗低溫的重要保護性物質(zhì)，能降低冰點，提高原生質(zhì)保護能力，保護蛋白質(zhì)膠體不致遇冷變性凝聚。由圖2 A可以看出，11號和18號自交系在低溫處理早期可溶性糖含量基本不變，69號自交系幼苗可溶性糖含量略有下降。11號、18號自交系在低溫處理5 d后可溶性糖含量迅速上升，與處理前相比，分別上升88.1%和302.5%；69號自交系可溶性糖含量也有所升高，但僅上升30.8%?；謴蜕L期間，11號、18號和69號自交系可溶性糖含量均有所下降，恢復生長3 d比低溫處理5 d時分別下降了24.0%、61.5%、78.3%，但11號和18號自交系可溶性糖含量仍高于處理前的水平，而69號則顯著低于處理前的含量。56號自交系在整個低溫處理和恢復生長階段可溶性糖含量均維持在較低水平，未出現(xiàn)較大幅度的變化。

注：圖中小寫字母表示同一自交系不同處理間數(shù)據(jù)的差異顯著性(p<0.05)。下同。 圖2 不同甜玉米自交系在低溫脅迫及恢復生長期間可溶性糖(A)和Pro(B)含量的變化 Fig.2 Changes of soluble sugar(A)and proline(B)contents of different sweet corn inbred lines during low temperature stress and recovery of growth

2.2.2低溫脅迫對玉米幼苗Pro含量的影響

如圖2 B所示，11號自交系Pro含量在低溫處理期間表現(xiàn)為先迅速下降而后上升，至恢復生長階段再次降低，總體來看，整個處理過程中Pro含量始終低于處理前的水平，恢復生長第3天降幅為81.8%。18號、56號自交系在低溫處理期間Pro含量都逐漸上升，處理5 d后含量達到最高，與處理前相比分別上升了212.0%和208.0%；在恢復期18號和56號自交系的表現(xiàn)存在差異，18號自交系Pro含量持續(xù)下降，而56號自交系呈先降低后升高的趨勢。69號自交系Pro含量在低溫處理階段基本不變，恢復正常溫度后Pro含量迅速降低，其表現(xiàn)與冷敏感型56號自交系完全不同。

2.2.3低溫脅迫對玉米幼苗POD活性的影響

由圖3 A可以看出，11號自交系在低溫處理期和恢復生長早期POD活性未發(fā)生顯著變化，在恢復生長第3天則顯著升高，上升幅度為59.7%。18號自交系POD活性一直處于上升趨勢，恢復生長第1天上升幅度達110.4%，恢復生長第3天有所下降，但POD活性仍高于低溫處理前水平。56號自交系在低溫處理期間POD活性也持續(xù)上升，比處理前上升了65.2%，但在恢復生長階段顯著降低，與低溫處理5 d時相比，恢復生長第3天POD活性下降了43.0%，低于處理前水平。69號自交系POD活性在整個處理時期表現(xiàn)為持續(xù)下降的趨勢，恢復生長第3天降幅達到82.1%。

圖3 不同甜玉米自交系在低溫脅迫及恢復生長期間抗氧化酶活性的變化 Fig.3 Changes of antioxidant enzyme activities of different sweet corn inbred lines during low temperature stress and recovery of growth

2.2.4低溫脅迫對玉米幼苗SOD活性的影響

抗性不同的甜玉米自交系在低溫脅迫下SOD活性變化基本一致(圖3 B)。在低溫脅迫早期，SOD活性變化較小，而低溫脅迫5 d后4個甜玉米自交系SOD活性均顯著升高，與處理前相比分別上升153.2%、57.8%、116.7%和55.4%；但在恢復生長階段，抗冷性不同的自交系之間表現(xiàn)出顯著差異，11號自交系SOD活性變化不顯著，18號自交系SOD活性略微下降，比低溫脅迫5 d時僅下降27.2%，而冷敏感型自交系56號和69號在恢復期SOD活性驟然下降，降幅分別達到71.1%和81.8%。

2.2.5低溫脅迫對玉米幼苗CAT活性的影響

抗冷型11號和18號自交系CAT活性變化與其POD活性變化相似(圖3 C)，11號自交系總體呈平緩上升的趨勢，18號自交系則表現(xiàn)為先升后降，最高上升95.3%。56號自交系CAT的初始活性較高，在低溫處理期間略微上升，而后在恢復生長期迅速下降，最高降低了74.8%；69號自交系也存在相似的變化，恢復生長期最高降低了80.3%，但與其他自交系相比，其CAT活性始終保持在較低水平。

2.2.6低溫脅迫對玉米幼苗APX活性的影響

如圖3 D所示，11號自交系在整個低溫處理及恢復生長階段均呈現(xiàn)穩(wěn)步上升的趨勢，在恢復生長第3天，其APX活性達到最高，比處理前上升了42.2%。18號自交系APX活性在低溫處理第5天出現(xiàn)大幅度上升，與處理前相比上升了177.6%，隨后在恢復期開始下降，至恢復第3天回落至處理前活性水平。56號自交系的變化趨勢與18號自交系類似，在低溫處理第5天APX活性上升幅度為90.6%，但是在恢復期活性迅速下降且顯著低于處理前水平。69號自交系APX活性與其他3個自交系相比，低溫處理期變化幅度不大，而恢復期表現(xiàn)與冷敏感型56號自交系相同，活性迅速下降。

2.2.7低溫脅迫對玉米幼苗GR活性的影響

由圖3 E可以看出，11號、18號和56號自交系在低溫處理階段GR活性持續(xù)上升，變化趨勢相似，而69號自交系則未發(fā)生顯著變化。在恢復期，56號和69號自交系GR活性大幅下降，恢復生長第1天與低溫處理5 d時相比，降幅分別達到77.1%和84.2%，并顯著低于處理前水平；18號自交系在恢復生長第3天回落至處理前水平；11號自交系在恢復期未發(fā)生顯著變化，與處理第5天相比，仍保持較高的GR活性。

2.3 相關基因表達

2.3.1低溫脅迫對玉米幼苗Pro合成和降解相關基因表達的影響

已有研究表明，Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶(Δ1-pyrroline-5-carboxylate synthetase，P 5 CS)是谷氨酸途徑合成Pro的關鍵酶，而脯氨酸脫氫酶(Proline dehydrogenase，ProDH)是Pro降解的主要限速酶[20]。如圖4所示，18號自交系ZmP5CS表達量在低溫處理第1天小幅度上升，隨后略微下降，至恢復生長第3天則顯著升高，比處理前增加102.6%；而56號自交系ZmP5CS表達量在低溫處理第1天小幅度降低，恢復生長期沒有顯著變化，總體來看56號自交系ZmP5CS表達量在整個處理及恢復生長階段變化趨勢較平穩(wěn)。18號和56號自交系ZmProDH表達量均呈先升后降的趨勢，不同的是18號、56號自交系ZmProDH表達量分別在低溫處理第3天和第5天達到峰值，與處理前相比增幅分別為280.3%和270.5%，隨后在恢復生長第3天均迅速下降，顯著低于處理前水平，與峰值相比分別下降了92.4%和98%。

圖4 低溫脅迫下不同甜玉米自交系Pro合成和降解基因的表達Fig.4 Expression of proline synthesis and degradation genes in different sweet corn inbred lines under low temperature stress

2.3.2低溫脅迫對玉米幼苗抗氧化酶相關基因表達的影響

由圖5可以看出，抗冷型18號自交系SOD相關基因ZmSOD3表達量在低溫處理第1天顯著上升，隨后迅速回落至處理前的水平，低溫處理5 d又顯著升高，至恢復生長第3天其表達量達到峰值，比處理前增加119.6%；而ZmSOD4表達趨勢完全不同，在低溫處理第1天其表達量顯著上升，隨后迅速下降，至低溫處理結(jié)束前一直保持較低水平，恢復期略有上升但仍顯著低于處理前水平；ZmSOD9表達趨勢與ZmSOD3相似，但表達量的首個峰值出現(xiàn)在低溫處理第3天，隨后開始回落，至恢復生長第3天又顯著上升，比處理前增加411.0%。18號自交系CAT相關基因ZmCAT1和ZmCAT2表達趨勢相同，均在低溫處理第3天表達量達到峰值，與處理前相比增幅分別為279.8%和239.3%；而ZmCAT3隨著低溫處理時間增加，表達量顯著下降，但在恢復生長第3天后大幅升高，并顯著高于處理前。APX相關基因ZmAPX2在低溫處理階段表達量未發(fā)生顯著變化，在恢復生長第3天略有下降，比處理前降低35.4%。GR相關基因ZmGR表達趨勢與ZmCAT1和ZmCAT2相似，但其表達量在低溫處理第1天顯著升高，增幅為246.8%，之后迅速回落，至恢復生長第3天又恢復到處理前的水平。

圖5 低溫脅迫下不同甜玉米自交系抗氧化酶相關基因的表達 Fig.5 Expression of antioxidant enzymes related genes in different sweet corn inbred lines under low temperature stress

對于冷敏感型56號自交系，其ZmSOD3、ZmSOD9、ZmCAT1和ZmCAT2在低溫處理及恢復生長階段整體表現(xiàn)為下降的趨勢，且表達量保持在較低水平；ZmSOD4表達量在低溫處理第1天顯著升高，上升幅度為182.0%，隨后顯著降低，但仍然高于處理前水平，到恢復生長第3天卻急劇下降，基本檢測不到其表達量。ZmCAT3在低溫處理第1天表達量顯著下降，第3天又迅速回升，之后持續(xù)下降，至恢復生長第3天表達量顯著低于處理前水平。而ZmAPX2表達量表現(xiàn)為先升高后降低的趨勢，低溫處理第3天達到峰值，與處理前相比上升了78.2%，恢復生長第3天又迅速下降，與處理前相比總降幅為80.2%。ZmGR表達量在整個低溫處理及恢復生長階段都很低，基本檢測不到。

3 結(jié)論與討論

3.1 低溫脅迫對玉米幼苗生長的影響

低溫是典型的環(huán)境脅迫因素之一，對植物生長發(fā)育有重要的影響。一般認為，低溫脅迫會使植物能量產(chǎn)生和物質(zhì)合成受阻，消耗增強，當植物長期處于低溫下就會造成饑餓狀態(tài)，嚴重影響植物的正常生長發(fā)育甚至導致死亡。本試驗通過對4個不同抗性的甜玉米自交系進行苗期3 ℃、5 d低溫處理發(fā)現(xiàn)，在低溫處理早期其生長狀態(tài)均未發(fā)生顯著變化，但在低溫處理末期，抗冷型自交系仍保持正常生長狀態(tài)，而冷敏感型自交系出現(xiàn)較為明顯的葉片萎蔫甚至下垂的現(xiàn)象；恢復生長后抗冷型自交系幼苗已開始正常生長僅有少部分葉色發(fā)黃，而56號和69號自交系絕大多數(shù)失水死亡。由此說明，低溫對植物體造成的傷害程度不僅取決于低溫的程度，還取決于低溫持續(xù)時間。低溫脅迫時間較短、程度較輕，會使細胞的生活力降低、植物的生長停滯，如果低溫脅迫時間過長或溫度過低，則可能延緩植物的生長發(fā)育，嚴重時甚至會導致植物死亡。

3.2 低溫脅迫對可溶性糖含量的影響

可溶性糖作為細胞主要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)之一，在植物遭受低溫脅迫時可通過其含量的增加來提高細胞滲透勢，從而減緩細胞失水，提高植物的抗冷性。通過糖的代謝，可溶性糖產(chǎn)生其他代謝產(chǎn)物，保護細胞膜系統(tǒng)免受逆境傷害[21]。研究表明，可溶性糖的含量是冷馴化完成程度的標志性指標，與植物抗冷性呈正相關[22]。在本試驗中，抗冷性不同的4個甜玉米自交系幼苗在低溫脅迫早期可溶性糖含量均未發(fā)生顯著變化，而隨著低溫脅迫時間延長，抗冷性強的11號和18號自交系可溶性糖含量顯著升高，而抗冷性弱的69號自交系可溶性糖含量僅升高30.8%。由此可見，一般情況下，低溫會誘導玉米幼苗可溶性糖含量的升高，其積累的程度與抗冷性存在較強的相關性，這也與自交系幼苗在低溫脅迫下的生長表現(xiàn)相一致?？估湫妥越幌翟诨謴推诳扇苄蕴呛肯陆稻徛?，恢復生長第3天可溶性糖含量仍高于處理前的水平；但冷敏感型自交系在恢復正常生長溫度第1天，其可溶性糖含量急劇下降，并顯著低于處理前的水平，無法維持細胞滲透勢，從而導致細胞嚴重失水，形態(tài)上表現(xiàn)為失水萎蔫甚至枯死。

3.3 低溫脅迫對Pro代謝的影響

在逆境下Pro的積累主要包括三方面原因：一是Pro合成加強，二是Pro氧化作用受抑制，三是低溫抑制了蛋白質(zhì)合成，蛋白質(zhì)的分解大于合成，也就抑制了Pro滲入蛋白質(zhì)的過程[23]。已有研究表明，玉米游離Pro含量與抗冷性呈正相關[24]。在本試驗中，除11號自交系外，其他3個自交系在低溫脅迫期間Pro含量均顯著上升，這與前人研究基本相符。雖然在多種非生物逆境脅迫下Pro的降解減弱或被抑制，但Pro降解過程在維持細胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)的平衡，以及提供脅迫恢復后植物恢復正常生長的能量源方面有著重要作用[25]。因此，這可能是4個自交系在恢復生長后Pro含量降低的主要原因，但56號自交系在恢復正常生長第3天，Pro含量的異常升高可能與Pro降解途徑受阻等有關，而69號自交系在恢復生長后幼苗失水萎蔫嚴重可能導致了Pro含量的急劇下降。

脅迫條件下Pro合成酶基因P5CS的表達量增加，降解酶基因ProDH的表達量降低[26]；而且脅迫條件下P 5 CS酶活性增加，ProDH酶活性降低，游離Pro的積累增加[27]。因此，目前比較一致的結(jié)論為：在多種非生物脅迫下，植物體內(nèi)的Pro合成增強，降解減弱，從而引起Pro的積累，提高植物對脅迫的抗性。本試驗通過對甜玉米自交系幼苗葉片中ZmP5CS和ZmProDH的表達量分析發(fā)現(xiàn)，在低溫脅迫下，抗冷性強的18號自交系ZmP5CS的表達量略有上升，并且在恢復期顯著升高，而抗冷性弱的56號自交系ZmP5CS的表達量未發(fā)生較為明顯的變化；ZmProDH在18號和56號自交系中的表現(xiàn)則基本相似，均在低溫脅迫期間出現(xiàn)表達高峰，這一現(xiàn)象與前人研究不相符。不僅如此，對比測得的葉片Pro含量可以看出，Pro代謝基因的表達模式與實際Pro含量的變化趨勢并不一致，這可能與低溫脅迫影響Pro代謝途徑中關鍵酶的活性有關。此外，干旱和低溫均能活化Pro合成的2條途徑，且干旱脅迫下Pro的積累更依賴于鳥氨酸途徑[26-27]。因此，低溫對鳥氨酸途徑造成的影響或許也會導致這一現(xiàn)象發(fā)生。

3.4 低溫脅迫對抗氧化酶系統(tǒng)的影響

POD作為內(nèi)源活性氧清除劑，能夠在低溫逆境中清除體內(nèi)過量的H2O2，維持活性氧代謝的平衡，保持膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，從而減輕或消除傷害。本試驗結(jié)果表明，抗冷性強的自交系在低溫脅迫期POD活性持續(xù)上升，尤其是18號自交系上升幅度達到了110.4%；抗冷性弱的56號自交系上升幅度只有65.2%。說明抗冷型自交系的POD活性更容易受到低溫誘導。在恢復期POD活性同樣處于較高的水平，這與馮玉磊等[28]、王曉楠等[29]的結(jié)論基本相同。

玉米中SOD同工酶主要是銅鋅超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD)、錳超氧化物歧化酶(Mn-SOD)和鐵超氧化物歧化酶(Fe-SOD)。其中SOD 3編碼線粒體Mn-SOD，SOD 4、SOD 9編碼細胞質(zhì)型Cu/Zn-SOD[30]。本試驗發(fā)現(xiàn)，4個甜玉米自交系中SOD活性在低溫脅迫初期均未發(fā)生顯著變化，但是隨著低溫脅迫時間的延長，第5天的SOD活性均顯著升高，說明低溫脅迫5 d后玉米幼苗內(nèi)氧自由基含量有了較多的積累，植株開始通過增加SOD活性應對低溫損傷產(chǎn)生的應激反應以清除多余的氧自由基。而在恢復期抗冷型和冷敏感型自交系表現(xiàn)出極大差異，抗冷性強的11號和18號自交系仍保持較高的SOD活性，但冷敏感型的56號和69號自交系SOD活性驟然下降，顯著低于處理前的水平，說明低溫脅迫所積累的傷害已經(jīng)對幼苗的正常生長及生理代謝造成了嚴重影響，從而使SOD活性降低；相反，抗冷性強的自交系幼苗為了防止受到進一步傷害而保持著較高的酶活性。從qPCR分析中可以看出，18號自交系ZmSOD3、ZmSOD4以及56號自交系ZmSOD4表達量在低溫脅迫初期顯著升高，說明在低溫脅迫初期幼苗就開始響應低溫危害；而且ZmSOD3、ZmSOD4和ZmSOD9表達量出現(xiàn)峰值的時間為第1天至第3天，這與酶活性的趨勢略有不同，可能是因為從基因轉(zhuǎn)錄至翻譯成蛋白質(zhì)這一過程需要其他的酶參與，而低溫對這些酶的活性存在一定影響，從而使得基因表達與酶活性表現(xiàn)之間存在一種滯后現(xiàn)象。在恢復生長期SOD合成相關基因的表達量與酶活性的表現(xiàn)較為一致，尤其是冷敏感型56號自交系在恢復生長末期基本檢測不到SOD合成相關基因的表達量，說明低溫已經(jīng)對幼苗造成不可逆的損傷。

CAT、APX、GR活性在各個自交系之間的表現(xiàn)趨勢大致相同，其中11號自交系酶活性水平持續(xù)上升，在恢復期依然保持較高的酶活性；18號自交系表現(xiàn)為先升后降，但在恢復期只有APX和GR活性回落到處理前水平，說明抗壞血酸-谷胱甘肽循環(huán)在低溫脅迫階段參與了活性氧的清除。56號自交系的3種酶活性雖然在低溫處理期也顯著上升且酶活性水平較高，而在恢復期有明顯的驟然下降趨勢，這可能與恢復正常溫度后植株葉片萎蔫、細胞正常生理代謝活動受阻等有關，相應的酶活性也隨之驟降；同理，69號自交系在恢復階段酶活性降低的原因可能也是如此。從基因表達水平上看，18號自交系在低溫處理期CAT活性升高是ZmCAT1、ZmCAT2和ZmCAT3共同作用的結(jié)果，而在脅迫后的恢復期ZmCAT3表達量顯著上升，對后期酶活性的維持可能起著主導作用；ZmAPX2和ZmGR的表達趨勢與酶活性的變化大致相同。而56號自交系ZmCAT1一直保持較低的表達水平，ZmCAT2在低溫處理第1天顯著上升，ZmCAT3在低溫處理早期卻顯著下降，低溫處理第3天又顯著上升，隨后顯著下降，因此CAT活性升高可能先后與ZmCAT2和ZmCAT3有較為密切的關系；ZmAPX2在56號自交系中的表達與酶活性表現(xiàn)基本一致，而ZmGR則基本檢測不到其表達，與酶活性表現(xiàn)存在較大出入，可能與轉(zhuǎn)錄和翻譯后的一系列調(diào)控有關。除此之外，基因表達與酶活性峰值出現(xiàn)差異的原因可能與SOD類似。

總的來說，在低溫脅迫1 d后玉米自交系的部分抗氧化酶活性開始產(chǎn)生變化，在處理5 d時變化最為顯著，與Burnett等[31]的研究基本相符。同時，結(jié)合抗氧化酶活性變化以及基因表達水平變化可以發(fā)現(xiàn)，抗冷型自交系在低溫脅迫下抗氧化酶基因的表達量整體高于冷敏感型自交系，表明抗冷型自交系在低溫逆境時能建立更強的抗氧化防御機制來清除活性氧，從而保護植物細胞免受毒害。

自交系幼苗為了應對低溫脅迫，通過提高細胞可溶性糖及Pro含量，以維持正常滲透勢及氧化還原狀態(tài)的平衡，并提供脅迫解除后植株正常生長所需的能量源，同時也需要多種抗氧化酶共同參與清除活性氧。因此，從響應機制來看，可溶性糖與Pro的積累以及多種抗氧化酶的共同參與可能是玉米幼苗抗冷性形成的重要途徑，同時恢復期也是其響應機制的關鍵時期。