microRNA在糖尿病腎病中的作用機(jī)制與研究進(jìn)展

鄒夢(mèng)林，羅來敏，張桂玲，鄢 艷

(南昌大學(xué) a.第一附屬醫(yī)院高新醫(yī)院腎內(nèi)科,南昌 330096； b.第一附屬醫(yī)院腎內(nèi)科，南昌 330006)

microRNA(miRNA)是在真核生物中發(fā)現(xiàn)的一類內(nèi)源性的具有調(diào)控功能的非編碼RNA，其大小長(zhǎng)20～25個(gè)核苷酸。通過堿基互補(bǔ)配對(duì)的方式識(shí)別靶mRNA，并根據(jù)互補(bǔ)程度的不同指導(dǎo)沉默復(fù)合體降解靶mRNA或者阻遏靶mRNA的翻譯，從而抑制其靶基因的表達(dá)，參與機(jī)體各種生理與病理過程的調(diào)節(jié)，對(duì)機(jī)體免疫反應(yīng)及疾病的發(fā)生發(fā)展與轉(zhuǎn)歸起重要的調(diào)控作用，包括糖尿病腎病(DN)[1-2]。DN是糖尿病最常見最嚴(yán)重的慢性微血管并發(fā)癥之一，在西方國(guó)家已成為導(dǎo)致終末期腎病的主要原因[3]，有文獻(xiàn)[4]報(bào)道,在我國(guó)住院患者中，糖尿病腎病超腎小球腎炎是導(dǎo)致慢性腎臟病的首要原因。李潔等[5]對(duì)miR-192介導(dǎo)的β信號(hào)通路進(jìn)行研究，結(jié)果顯示miRNA調(diào)控作用可能成為DN一個(gè)新的診斷標(biāo)志及治療靶點(diǎn)。此后，miRNA在DN發(fā)病機(jī)制中的作用日益受到關(guān)注。有研究[6]發(fā)現(xiàn)，miRNA對(duì)腎小球基底膜和系膜細(xì)胞的損傷、足細(xì)胞的損傷及腎小管間質(zhì)纖維化的調(diào)控起到了關(guān)鍵作用。本文就miRNA在DN中的作用機(jī)制及研究進(jìn)展作一綜述。

1 miRNA的特點(diǎn)及功能

miRNA廣泛存在于真核生物中，是一組不編碼蛋白質(zhì)的短序列RNA，本身不具有開放閱讀框架(open reading frame,ORF)；成熟的miRNA 5′端有一磷酸基團(tuán)，3′端為羥基,3′端可以有1～2個(gè)堿基的長(zhǎng)度變化，這一特點(diǎn)使它與大多數(shù)寡核苷酸和功能RNA的降解片段區(qū)別開來；多數(shù)miRNA還具有高度保守性、時(shí)序性和組織特異性。1993年LEE等[7]在秀麗新小桿線蟲中首次發(fā)現(xiàn)miRNA，它在不同生物體的發(fā)育、分化、細(xì)胞增殖和凋亡途徑中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。目前已知的抑制靶基因表達(dá)有兩種方式：1)與靶mRNA不完全互補(bǔ)的miRNA在蛋白質(zhì)翻譯水平上抑制其表達(dá)(哺乳動(dòng)物中比較普遍)，有可能影響mRNA的穩(wěn)定性；2)與靶mRNA互補(bǔ)，這些miRNA的結(jié)合往往引起靶mRNA的降解(在植物中比較常見)[8]。這些結(jié)合位點(diǎn)通常都在mRNA的編碼區(qū)或開放閱讀框中。每個(gè)miRNA可以有多個(gè)靶基因，而幾個(gè)miRNA也可以調(diào)節(jié)同一個(gè)基因。這種復(fù)雜的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)既可以通過一個(gè)miRNA來調(diào)控多個(gè)基因的表達(dá)，也可以通過幾個(gè)miRNA的組合來精細(xì)調(diào)控某個(gè)基因的表達(dá)。隨著miRNA調(diào)控基因表達(dá)研究的逐步深入，miRNA作為疾病的診斷標(biāo)志及治療靶點(diǎn)的潛在價(jià)值也受到人們的日益關(guān)注。

2 miRNA參與DN的機(jī)制

有研究[9]證實(shí)，長(zhǎng)期高血糖刺激會(huì)導(dǎo)致腎小球肥大、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、基底膜增厚、腎小球硬化和腎小管萎縮，最終導(dǎo)致腎衰竭。在早期的一項(xiàng)研究中，SUN等[10]通過生信分析及蛋白質(zhì)印跡法，發(fā)現(xiàn)5種miRNA(miR-192、miR-194、miR-204、miR-215和miR-216a)在人體腎臟中較其他器官中高表達(dá)，表明它們?cè)谀I臟疾病發(fā)生發(fā)展中有著潛在作用。隨著基因芯片、生信分析、高通量測(cè)序等技術(shù)的進(jìn)展，表明miRNA表觀遺傳調(diào)節(jié)、轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)在DN發(fā)病相關(guān)機(jī)制中起重要作用[11]。

2.1 參與腎小球基底膜和系膜細(xì)胞的損傷

糖尿病腎病主要病理學(xué)特點(diǎn)有基底膜增厚、細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)積聚、系膜擴(kuò)張、腎小管間質(zhì)纖維化、足細(xì)胞足突融合及消失等[12]。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(transforming growth factor-beta1,TGF-β)在糖尿病腎病腎小球系膜細(xì)胞肥大和纖維化過程中起重要作用。Smad蛋白家族是最早被證實(shí)為TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的下游蛋白，它存在細(xì)胞質(zhì)中，可將信號(hào)由細(xì)胞膜傳至細(xì)胞核中。Smad蛋白根據(jù)功能不同分為受體激活型(receptor-regulated Smads，R-Smads)、通用介導(dǎo)型(common-partner Smads，Co-Smads)及抑制型(inhibitory Smads，I-Smads)三大類。Smad2與Smad3均屬受體激活型蛋白，它們被TGF-β的Ⅰ型受體磷酸化后可與Smad4形成異源性三聚體復(fù)合物，并轉(zhuǎn)入核內(nèi)與DNA結(jié)合激活DNA轉(zhuǎn)錄，調(diào)節(jié)靶蛋白的表達(dá)[13]。ZHONG等[14]發(fā)現(xiàn)，20周齡2型糖尿病模型db/db小鼠腎小球系膜細(xì)胞miR-21表達(dá)比同齡小鼠增加了1倍，同時(shí)，檢測(cè)到其靶基因磷酸酶及張力蛋白同源物(phosphatase and tensin homologue,PTEN)、Smad7表達(dá)減少，TGF-β1、Smad3和NF-κB 水平升高并伴有系膜細(xì)胞纖維化和肥大。然而，通過基因敲除或予以反miR-21寡核苷酸后PTEN及Smad7表達(dá)增加，TGF-β1、Smad3和NF-κB水平均下降，提示miR-21可能通過抑制PTEN及Smad7表達(dá)激活TGF-β/Smad3和NF-κB信號(hào)通路進(jìn)而導(dǎo)致腎小球系膜細(xì)胞增殖、纖維化。這與MCCLELLAND等[15]研究一致。

DESHPANDE等[16]研究發(fā)現(xiàn)，miR-192在鏈脲菌素(streptozocin,STZ)誘導(dǎo)的1型和2型糖尿病小鼠腎小球中的表達(dá)均高于對(duì)照組，且TGF-β或高糖(high glucose,HG)刺激也能增加miR-192在小鼠系膜細(xì)胞(mouse mesangial cells，MMC)和人MC中的表達(dá)。有文獻(xiàn)[17]報(bào)道，miR-192通過抑制鋅指E盒結(jié)合蛋白1(zinc finger E-box binding homeobox 1，ZEB1)及鋅指E盒結(jié)合蛋白2(zinc finger E-box binding homeobox 2，ZEB2)的表達(dá)，繼而導(dǎo)致下游Ⅰ型膠原蛋白α2(type 1 collagen α2，Col1α2)和Ⅳ型膠原蛋白α1(type 4 collagen α1，Col4α1)沉積。KATO等[6]還證實(shí)miR-192通過抑制ZEB1和ZEB2的表達(dá)，增加腎小球系膜細(xì)胞中其他miRNA的表達(dá)，例如miR-216a、miR-217和 miR-200b/c增加產(chǎn)生放大電路，進(jìn)一步促進(jìn)膠原蛋白的沉積。DESHPANDE等[18]發(fā)現(xiàn)與野生型小鼠相比，miR-192基因敲除小鼠和miR-192抑制劑治療的小鼠腎小球肥大、纖維化都較輕。有報(bào)道[19]顯示，抗癌藥物小劑量紫杉醇，通過下調(diào)miR-192，可以預(yù)防殘腎模型的腎纖維化。另，在腎缺血再灌注模型中，使用基因敲除手段，發(fā)現(xiàn)小鼠miR-192水平較低，而miR-192水平較低的小鼠存活率較高[20]。表明抑制miR-192的水平對(duì)治療腎臟疾病是有益的，這也為治療DN提供新的方向。KATO等[21]研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)TGF-β誘導(dǎo)的小鼠系膜細(xì)胞中miR-216a和miR-217表達(dá)上調(diào)，它們都是通過抑制靶向基因PTEN的表達(dá)來激活PI3K/AKT信號(hào)通路，導(dǎo)致系膜細(xì)胞肥大、增生。miR-200家族成員根據(jù)基因組結(jié)構(gòu)被分成miR-200a、miR-200b和miR-200c。它們位于非編碼RNA的內(nèi)含子中，當(dāng)E-box上調(diào)時(shí)，可增加miR-200家族的表達(dá)；miR-200家族通過作用于Fog2來激活PI3K信號(hào)通路，導(dǎo)致腎細(xì)胞肥大和纖維化[22]。

2.2 參與腎小球足細(xì)胞損傷

在DN早期，會(huì)出現(xiàn)足細(xì)胞足突融合等改變。隨著DN的進(jìn)展，足細(xì)胞會(huì)凋亡與脫落，導(dǎo)致大量蛋白尿，而蛋白尿的出現(xiàn)可進(jìn)一步加重足細(xì)胞的損傷，由此形成惡性循環(huán)，最終導(dǎo)致終末期腎臟病。ZHDANOVA等[23]選擇性敲除小鼠Dicer基因(調(diào)控足細(xì)胞miRNA生成的關(guān)鍵基因)，小鼠出現(xiàn)大量蛋白尿、病理變化，足細(xì)胞凋亡、腎小球硬化等。這提示miRNA對(duì)維持足細(xì)胞正常功能至關(guān)重要。有研究[24]表明，miR-29c在DN患者足細(xì)胞中升高，足細(xì)胞中過表達(dá)miR-29c可導(dǎo)致炎癥細(xì)胞因子，如IL-1、IL-6、IL-18、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的升高。然而，用其抑制劑抑制miRNA-29c表達(dá)可以降低足細(xì)胞中的炎癥細(xì)胞因子。這表明miRNA-29c可能通過增加炎癥因子的表達(dá)參與DN的發(fā)生發(fā)展。LONG等[25]實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在2型糖尿病db/db小鼠腎小球、HG處理的小鼠內(nèi)皮細(xì)胞和足細(xì)胞中，miR-29c均出現(xiàn)上調(diào)，且miR-29c通過靶向抑制Spry1表達(dá)，激活Rho激酶，參與DN患者ECM沉積和足細(xì)胞凋亡，予以反義寡核苷酸沉默miR-29c基因后，可抑制DN患者腎臟內(nèi)皮細(xì)胞和足細(xì)胞凋亡，減少患者蛋白尿和ECM沉積。LEE等[26]發(fā)現(xiàn)，miR-146a在糖尿病腎病患者足細(xì)胞中表達(dá)明顯減少，miR-146a水平較低的患者與對(duì)照組相比，腎功能明顯下降得更快；該作者還發(fā)現(xiàn)，miR-146a表達(dá)下降，直接導(dǎo)致其靶基因Notch-1和ErbB4的表達(dá)上調(diào)。正常情況下，miR-146a可以抑制ErbB4信號(hào)傳導(dǎo)，而DN患者可以通過TGF-β1信號(hào)通路降低miR-146a表達(dá)，從而激活ErbB4信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。使用ErbB4受體阻滯劑厄洛替尼治療后，DN患者蛋白尿進(jìn)展緩慢，腎小球損傷較前減輕。此外，WAN等[27]研究表明，miR-146a表達(dá)的增加可以抑制DN患者的炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激。

2.3 參與腎小管間質(zhì)纖維化

腎小管間質(zhì)纖維化(tubulointerstitial fibrosis，TIF)是評(píng)估腎功能衰竭嚴(yán)重程度的重要指標(biāo)，因此闡明TIF在DN中的發(fā)病機(jī)制具有重要意義。有研究[28]表明，miR-34a-5p可以通過靶向調(diào)節(jié)沉默信息調(diào)節(jié)因子2相關(guān)酶1(sirtuin-1，SIRT1)，導(dǎo)致DN患者腎小管間質(zhì)纖維化。有研究[29]顯示，在DN小鼠腎組織中，miR-34a-5p水平上調(diào)，導(dǎo)致其下游分子SIRT1表達(dá)下降，然而，SIRT1低表達(dá)可導(dǎo)致TGF-β1表達(dá)明顯增加。這提示miR-34a-5p/SIRT1可能通過TGF-β1信號(hào)通路加重DN的TIF進(jìn)展。除TIF外，miR-34a-5p還可以通過抑制BCL-2和BCL-W(BCL家族抗凋亡成員)蛋白的產(chǎn)生，增加硬脂酸誘導(dǎo)的胰島β細(xì)胞脂質(zhì)毒性[30]。因此，減少miR-34a-5p表達(dá)可能是防治TIF和胰島β細(xì)胞脂毒性的有效策略。另外，在研究糖尿病大鼠的miRNA表達(dá)譜時(shí)，ZANCHI等[31]發(fā)現(xiàn)，miR-184在晚期DN大鼠腎臟中的表達(dá)顯著上調(diào)，并且主要集中在受損的近端小管區(qū)域，同時(shí)出現(xiàn)脂肪磷酸酶3(llipophosphatase 3，LPP3)的表達(dá)減少和間質(zhì)3型膠原的增多。巧合的是，他們還發(fā)現(xiàn)大鼠腎臟連續(xù)切片中LPP3染色減少，既往研究[32]證實(shí)，LPP3的減少會(huì)增加溶血磷脂酸(lysophosphatidic acid,LPA)的表達(dá)，進(jìn)一步導(dǎo)致腎小管間質(zhì)纖維化。

一些miRNA，包括miR-192，在嚴(yán)重或晚期DN模型中被下調(diào)，如糖尿病Apoe基因缺陷小鼠[33]。DN晚期腎小管壞死/凋亡，可導(dǎo)致腎小管上皮細(xì)胞miRNA水平降低。WANG等[33]觀察到，在HG或TGF-β1處理下，小鼠近端腎小管上皮細(xì)胞中miR-192表達(dá)下降，同時(shí)檢測(cè)到E-鈣黏素(E-cadherin)降低。E-cadherin是一種鈣依賴性的跨膜蛋白，參與細(xì)胞與細(xì)胞間黏附，它廣泛分布于人和動(dòng)物的各類上皮細(xì)胞，其中包括腎小管上皮細(xì)胞，在維持細(xì)胞的極性和完整性等方面起著重要作用。當(dāng)E-cadherin減少時(shí)，可出現(xiàn)腎小管上皮細(xì)胞損傷、腎間質(zhì)纖維化。

3 miRNA可作為DN的分子標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)

隨著miRNA檢測(cè)和定量技術(shù)的迅速發(fā)展，包括基因芯片、定量PCR和高通量測(cè)序，開發(fā)miRNA作為人類疾病的潛在生物標(biāo)記物和治療靶點(diǎn)成為研究熱點(diǎn)。miRNA在人體血漿及尿液中穩(wěn)定存在，血液中存在的miRNA是癌癥、組織損傷和心力衰竭的敏感生物標(biāo)志物[34-35]。TAYEL等研究[36]發(fā)現(xiàn)，與健康對(duì)照組相比，DN患者中的miR-126和miR-192表達(dá)下調(diào)，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，miR-126和miR-192表達(dá)與肌酐水平及尿白蛋白肌酐比值(ACR)呈負(fù)相關(guān)。此外，MENG等[37]研究表明，尿液中miR-199-3p的降低可以從糖尿病患者和健康對(duì)照中篩查出DN患者。故除了miR-192，其他關(guān)鍵性的miRNA如miR-21、miR-200家族成員及miR-29b/c的靶向抑制或過表達(dá)，在DN和其他腎臟疾病的體外和體內(nèi)模型中顯示出一定的應(yīng)用前景。

K?LLING等[38]研究認(rèn)為，在DN小鼠腎臟中，miR-21是表達(dá)較多的miRNA之一，體內(nèi)外抑制這種miRNA可以降低系膜基質(zhì)擴(kuò)張、間質(zhì)纖維化、巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)、足細(xì)胞丟失、蛋白尿以及炎癥和纖維化分子的表達(dá)。miR-21拮抗劑可改善DN小鼠腎臟的結(jié)構(gòu)和功能，是治療糖尿病并發(fā)癥的有效藥物。CIVANTOS等[39]發(fā)現(xiàn)，作為二肽基肽酶-4(Dipeptidyl peptidase-4，DPP-4)抑制劑的西格列汀，通過下調(diào)miR-200a/Keap-1/Nrf2信號(hào)通路,減輕DN大鼠miRNA介導(dǎo)的氧化應(yīng)激。KANG等[40]研究發(fā)現(xiàn)，阿曲生坦可以降低miRNA-199b-5p的表達(dá)，增加klotho水平，klotho是一種抗衰老的單通道蛋白質(zhì)，可以調(diào)控胰島素敏感性。miRNA-199b-5p介導(dǎo)的血清klotho水平升高，可能是阿曲生坦預(yù)防DN患者腎小管損傷的機(jī)制之一。提示miRNA可作為DN分子標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。

4 結(jié)語與展望

miRNA在各種疾病中的研究越來越廣泛,其重要價(jià)值已逐漸被科學(xué)家們所證實(shí)。其參與疾病的發(fā)生、發(fā)展過程，可作為疾病監(jiān)測(cè)、診斷、治療的新靶點(diǎn)。miRNA通過參與腎小球系膜細(xì)胞肥大、足細(xì)胞損傷、腎小管間質(zhì)纖維化等導(dǎo)致DN的發(fā)生及進(jìn)展。隨著miRNA在DN研究領(lǐng)域的不斷深入，期待miRNA作為敏感及特異的生物標(biāo)志物早日在臨床用于DN早期診斷及病情監(jiān)測(cè)。