吳 沙 鄒夢(mèng)怡 廖洪斐

視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤(RB)是兒童最常見的原發(fā)性眼眶內(nèi)惡性腫瘤，約占所有兒童癌癥的3%。盡管RB很少見，但在癌癥管理的許多方面，包括分類方案、治療方式、基因檢測(cè)和篩查，一直是腫瘤學(xué)領(lǐng)域的基石。在發(fā)達(dá)國(guó)家中，RB患兒存活率超過(guò)95%，但在發(fā)展中國(guó)家這個(gè)概率卻低得多。一項(xiàng)來(lái)自全球RB就診報(bào)告和國(guó)民收入水平分析結(jié)果顯示：國(guó)民收入越低，就診年齡越大，確診腫瘤晚期和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的比例越高[1]。目前已發(fā)現(xiàn)大量microRNAs(miRNA)在人類癌癥中表達(dá)上調(diào)或下調(diào)[2]，并通過(guò)與靶基因序列互補(bǔ)，調(diào)控蛋白質(zhì)編碼基因而發(fā)揮致癌或抑癌功能。miRNA是一類非編碼小RNA，可以通過(guò)細(xì)胞和分子途徑的靶向序列參與多種生物過(guò)程。miRNA在RB的病理過(guò)程、診斷及治療中具有重要的作用。本文現(xiàn)對(duì)此研究進(jìn)展作一綜述。

1 RB

RB是一種起源于視網(wǎng)膜光感受器的惡性腫瘤，是嬰幼兒最常見的原發(fā)性眼內(nèi)惡性腫瘤，臨床表現(xiàn)以白瞳癥和斜視為主，發(fā)病無(wú)種族、地域和性別差異。RB分為遺傳型和非遺傳型兩種類型。遺傳型大約占40%，在遺傳型RB中，所有細(xì)胞都發(fā)生了一個(gè)RB1等位基因的突變。當(dāng)再次發(fā)生突變事件影響第二個(gè)等位基因時(shí)，細(xì)胞可能會(huì)發(fā)生惡性轉(zhuǎn)移[4]，這類患兒大多數(shù)為雙側(cè)和多灶性發(fā)病。非遺傳型RB是單側(cè)的，無(wú)遺傳傾向，不易合并第二種腫瘤。RB的治療是高度個(gè)性化的，需要多學(xué)科團(tuán)隊(duì)根據(jù)腫瘤的臨床和影像學(xué)特征來(lái)制定治療方案[5]。在大多數(shù)情況下，化學(xué)治療是主要的治療方法，可與局部治療結(jié)合使用?；瘜W(xué)治療失敗或者晚期病例，通常需行眼球摘除術(shù)[6]。

2 miRNA

miRNA是一種單鏈RNA，長(zhǎng)度約22 nt，具有物種間高度保守性、表達(dá)時(shí)序性以及組織特異性，在調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)和發(fā)育過(guò)程中起多種作用。由較長(zhǎng)的初級(jí)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在經(jīng)過(guò)多步核酸酶的剪切、加工后產(chǎn)生的，隨后被組裝入RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體，通過(guò)堿基的互補(bǔ)配對(duì)方式識(shí)別靶mRNA，并依據(jù)互補(bǔ)的不同程度指導(dǎo)沉默復(fù)合體進(jìn)行降解目標(biāo)mRNA或者阻遏目標(biāo)mRNA的翻譯。從1993年發(fā)現(xiàn)首個(gè)miRNA，到現(xiàn)在新一代基因測(cè)序和其他方法普遍應(yīng)用，在短短的二十多年里，miRNA在生物學(xué)的研究領(lǐng)域得到了極大的發(fā)展[7]。miRNA不僅可以作為診斷的生物學(xué)指標(biāo)，而且可以作為新的治療靶點(diǎn)。

3 miRNA在RB的研究進(jìn)展

3.1 miRNA在RB的病理機(jī)制RB主要是由視網(wǎng)膜細(xì)胞中RB1基因的失活引發(fā)的。但是，除RB1突變外，其他遺傳改變特別是異常表達(dá)的miRNA在RB的腫瘤發(fā)生和發(fā)展中起關(guān)鍵作用[8]。Tian等[9]通過(guò)對(duì)人和小鼠RB相關(guān)miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和途徑的鑒定，發(fā)現(xiàn)7條miRNAs(hsa-miR-373、hsa-miR-34a、hsamiR-129、hsa-miR-494、hsa-miR-503、hsa-let-7和hsamiR-518c)與RB相關(guān)。這些miRNA通過(guò)調(diào)節(jié)包括CCND1、CDC25C、E2F2和CDKN2D在內(nèi)的靶標(biāo)，以及“細(xì)胞周期”和“癌癥途徑”在RB發(fā)生中起關(guān)鍵作用。Xu等[10]研究表明，miR-494可能作為腫瘤啟動(dòng)子起作用，并通過(guò)靶向PTEN調(diào)節(jié)RB進(jìn)展。Li等[11]研究表明，miR-433通過(guò)抑制Notch1和PAX6的表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)RB細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。Bu等[12]研究發(fā)現(xiàn)，miR-106b作為致癌基因，通過(guò)抑制ZBTB4蛋白的表達(dá)來(lái)促進(jìn)WERI-Rb-1細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，并且與疾病的嚴(yán)重性密切相關(guān)。綜上所述，miRNA在RB的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程發(fā)揮重要作用。

3.2 miRNA在RB診斷方面的應(yīng)用RB是最嚴(yán)重的眼內(nèi)腫瘤，通常難以診斷，而且兒科人群中遇到的眼眶異常也與成人患者中發(fā)現(xiàn)的眼眶異常大不相同[13]。目前CT和MRI已經(jīng)廣泛擴(kuò)展了眼眶成像的能力，并為許多其他腫瘤的診斷提供了有用的信息?？紤]到較高的輻射劑量，以及患兒年齡小難以配合，CT和MRI對(duì)于RB的早期診斷有一定的缺陷。RB是首批具有已知遺傳病因的腫瘤之一，突變傳遞給下一代的概率約為40%。高危家庭成員均應(yīng)早期篩查，對(duì)患者的腫瘤組織和血液樣本及患者家屬的血液樣本進(jìn)行遺傳學(xué)研究至關(guān)重要。早期診斷關(guān)系到患兒保留視力，拯救眼睛和生命的機(jī)會(huì)。Beta等[14]通過(guò)比較RB患兒和正常兒童血清中差異表達(dá)的miRNA，發(fā)現(xiàn)miR-17、miR-18a和miR-20a在血清樣本中顯著表達(dá)，探索了血清中miRNA作為非侵入性診斷的潛力。Liu等[15]收集65例RB患者和65例健康個(gè)體血漿樣本作為對(duì)照，發(fā)現(xiàn)microRNA-320、microRNA-let-7e和microRNA-21可以作為檢測(cè)RB的新型潛在生物標(biāo)志物。Zheng等[16]測(cè)量RB組織和鄰近正常組織中miR-144表達(dá)水平，以及來(lái)自RB患者和健康對(duì)照者的血清樣品，發(fā)現(xiàn)RB患者腫瘤組織中miR-144表達(dá)水平顯著降低，miR-144表達(dá)水平與RB患者的腫瘤大小和轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，提示其可作為RB診斷和預(yù)后的標(biāo)志物。Zhou等[17]研究發(fā)現(xiàn)，血清中miR-338-5p有可能成為RB的腫瘤標(biāo)志物，并且與神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)聯(lián)合使用可以提高RB的早期診斷率。因此，miRNA在RB的診斷中具有重要的價(jià)值，可能成為新的診斷學(xué)生物標(biāo)志物。

3.3 miRNA在RB治療方面的應(yīng)用RB的治療在過(guò)去的幾十年中逐漸發(fā)展，其目的不僅是保護(hù)生命和眼睛，而且優(yōu)化殘余視力。RB的治療是多模式的，化學(xué)治療、經(jīng)瞳孔溫?zé)岑煼?、冷凍和激光光凝等局部治療、放射治療和手術(shù)治療都起著至關(guān)重要的作用[18]。盡管最近的治療進(jìn)展使RB成為可治愈的腫瘤，但由于化學(xué)抗性的復(fù)雜機(jī)制和化學(xué)療法的毒性[19]，以及發(fā)生繼發(fā)性腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)，長(zhǎng)期存活的可能性很低[20]，迫切需要新的治療方法。近年來(lái)，大量研究發(fā)現(xiàn)RB相關(guān)miRNA的表達(dá)、作用和相關(guān)機(jī)制可能有助于為RB患者開發(fā)新的治療策略[21]。

3.3.1 miRNA上調(diào)在RB靶向治療方面的應(yīng)用Wang等[22]對(duì)microRNA-143在正常人視網(wǎng)膜組織樣本、Y79和Weri1的RB細(xì)胞系中的表達(dá)并進(jìn)行比較，將microRNA-143模擬物分別轉(zhuǎn)染到RB細(xì)胞系中，并使用逆轉(zhuǎn)錄-定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)和蛋白免疫印跡法檢測(cè)其對(duì)RB細(xì)胞系的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)microRNA-143的過(guò)表達(dá)顯著降低了細(xì)胞活力和RB細(xì)胞系的侵襲，并增加了凋亡細(xì)胞的數(shù)量。Zhang等[23]使用微陣列分析及逆轉(zhuǎn)錄-實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)，以鑒定其與RB進(jìn)展相關(guān)的關(guān)鍵miRNA，發(fā)現(xiàn)miR-125a-5p的過(guò)表達(dá)顯著抑制了RB中的細(xì)胞增殖和腫瘤形成，進(jìn)一步研究表明miR-125a-5p作為重要的腫瘤抑制劑起作用，其通過(guò)靶向TAZ抑制EGFR途徑來(lái)抑制RB的進(jìn)展。Wu等[24]發(fā)現(xiàn)，miR-186靶向含有AAA結(jié)構(gòu)域的蛋白2(ATAD2)，通過(guò)Hedgehog信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑影響RB的存活力、侵襲、遷移、血管生成和凋亡的能力。Xu等[25]研究表明，miR-340在RB細(xì)胞系中低表達(dá)，miR-340的上調(diào)可以降低RB細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)其凋亡，并證明其在RB細(xì)胞中的功能至少部分通過(guò)下調(diào)KIF14實(shí)現(xiàn)，有望成為未來(lái)RB臨床治療的新方向。因此，這一類為抑癌基因作用的miRNA上調(diào)后，通過(guò)靶向不同的蛋白基因途徑在RB治療中發(fā)揮作用。

3.3.2 miRNA下調(diào)在RB靶向治療方面的應(yīng)用Huang等[26]在接受眼球摘除術(shù)的RB患者的RB組織和從接受眼球摘除術(shù)的其他創(chuàng)傷患者收集的正常視網(wǎng)膜組織中檢測(cè)到miR-182和細(xì)胞間黏附分子2(CADM2)的表達(dá)水平，結(jié)果表明，miRNA-182的下調(diào)通過(guò)抑制PI3K/AKT途徑和CADM2上調(diào)來(lái)抑制RB中的細(xì)胞活力、侵襲和血管生成。Song等[27]研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-224-3p的下調(diào)通過(guò)增加大腫瘤抑制因子2(LATS2)激活Hippo-YAP信號(hào)通路來(lái)阻礙RB的進(jìn)展。同時(shí)，Sun等[28]發(fā)現(xiàn)，miRNA-492下調(diào)也通過(guò)直接靶向LATS2減弱RB中的細(xì)胞增殖和侵襲。Gui等[29]研究發(fā)現(xiàn)，在Weri-Rb-1細(xì)胞中miR-21抑制劑可抑制miR-21的表達(dá)和細(xì)胞活力，但通過(guò)調(diào)節(jié)PDCD4、Bax和Bcl-2的表達(dá)來(lái)改善細(xì)胞凋亡率。同時(shí)，miR-21抑制劑通過(guò)抑制MMP-2和MMP-9的蛋白表達(dá)抑制細(xì)胞遷移和侵襲，并顯著影響PTEN、PI3K和p-AKT的表達(dá)。Ding[30]檢測(cè)了HXO-RB44細(xì)胞系人正常視網(wǎng)膜組織和RB組織標(biāo)本中miR-21的表達(dá)，并使用靶向抗miR-21(t-anti-miR-21)的8-mer微小種子研究了其功能，發(fā)現(xiàn)t-anti-miR-21在體外顯著抑制了RB細(xì)胞增殖、遷移和集落形成，具有與抗miR-21相似的作用，證明HXO-RB44細(xì)胞中miR-21的敲低能夠抑制RB的進(jìn)展。綜上所述，這一類為癌基因作用的miRNA下調(diào)后，通過(guò)靶向不同的信號(hào)途徑抑制RB的細(xì)胞增殖、侵襲和血管生成等生物學(xué)行為，發(fā)揮治療作用。

3.3.3 miRNA在RB治療藥物敏感性方面的應(yīng)用腫瘤細(xì)胞群體具有內(nèi)在的、高度有序發(fā)展的抗藥能力[31]，無(wú)論是細(xì)胞毒類藥物還是靶向藥物，均未能克服耐藥問(wèn)題[32]，而不少學(xué)者提出腫瘤耐藥性的發(fā)展與miRNA的失調(diào)有關(guān)[33-34]，miRNA也成為腫瘤耐藥研究領(lǐng)域一個(gè)熱點(diǎn)。miR34a的上調(diào)、HMGB1的敲低或自噬的抑制恢復(fù)了RB細(xì)胞中的化學(xué)敏感性并增強(qiáng)了腫瘤細(xì)胞的死亡[34]。這些為miRNA調(diào)控HMGB1表達(dá)的機(jī)制及其對(duì)自噬和耐藥性的可能貢獻(xiàn)提供了新的見解[35]。Yang等[36]使用人RB和鄰近的腫瘤組織以及人RB細(xì)胞系(HXO-Rb44、SO-Rb50、Y79和WERI-RB-1)，使用四種化學(xué)治療藥物，包括卡鉑(CBP)、依托泊苷(VP-16)、阿霉素(ADM)和長(zhǎng)春新堿(VCR)來(lái)處理細(xì)胞系，以評(píng)估RB細(xì)胞的藥物敏感性，結(jié)果表明miR-34a/MAGE-A/p53軸可能有助于提高RB化學(xué)治療的療效。也有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，miR-34a下調(diào)，Notch1在HXO-RB44和Y79細(xì)胞中上調(diào)，此外，Notch1被鑒定為miR-34a的靶基因，其可通過(guò)miR-34a的表達(dá)增加而下調(diào)[37]。證明miR-34a上調(diào)和Notch1下調(diào)顯著抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡并增強(qiáng)卡鉑HXO-RB44和Y79細(xì)胞的敏感性。Yuan等[38]利用人RB細(xì)胞系(WERI-RB1、SO-RB50和Y79)和人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞系A(chǔ)RPE-19，同時(shí)構(gòu)建了耐藥細(xì)胞SO-RB50/VCR和SO-RB50/CBP，檢測(cè)RB細(xì)胞中miR-515-5p和Notch1的表達(dá)，進(jìn)一步證明過(guò)表達(dá)的miR-515-5p通過(guò)靶向Notch1表達(dá)抑制RB細(xì)胞的增殖和耐藥性增加。Li等[38]采用生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)RB樣本及其下游靶基因差異表達(dá)的miR-222，通過(guò)模擬物或抑制劑改變miR-222的表達(dá)，以檢查其在響應(yīng)化學(xué)治療劑VCR在RB細(xì)胞中的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-222通過(guò)靶向von Hippel-Lindau(VHL)腫瘤抑制因子促進(jìn)缺氧誘導(dǎo)因子1α的表達(dá)，從而增加RB細(xì)胞對(duì)化學(xué)治療藥物VCR的耐藥性。因此，miRNA可提高RB治療中的藥物敏感性。

4 小結(jié)

RB嚴(yán)重威脅著患兒的健康和生命，近年來(lái)，大量miRNA的研究為RB的病因?qū)W研究、診斷和治療提供了新思路。到目前為止，有關(guān)miRNA的調(diào)查研究規(guī)模均較小，同時(shí)考慮到血清及組織樣品中miRNA水平存在個(gè)體差異，實(shí)驗(yàn)的可重復(fù)性較低，選擇特異的miRNA作為RB新興的生物學(xué)指標(biāo)及靶向治療藥物，還需要更深入的探索。另外，雖然化學(xué)治療及靶向藥物的出現(xiàn)大大提高了RB的治愈率，但是耐藥性的發(fā)生不僅降低了化學(xué)治療效果，而且阻礙了新藥的研發(fā)。因此，對(duì)miRNA與腫瘤耐藥性的研究具有一定的現(xiàn)實(shí)意義，也將是未來(lái)腫瘤研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。