新冠0號(hào)防治新冠肺炎的作用機(jī)制

劉孟楠，羅鋼，陳立，楊思進(jìn)

1.西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院 心血管內(nèi)科（瀘州646000）；2.西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院 藥劑科（瀘州646000）；3.澳門科技大學(xué) 中醫(yī)藥學(xué)院（澳門 999078）

新型冠狀病毒肺炎簡(jiǎn)稱新冠肺炎（corona virus dis?ease 2019，COVID-19）是一種由嚴(yán)重急性呼吸系統(tǒng)綜合癥冠狀病毒-2（SARS-CoV-2）引起的傳染病，患者主要癥狀為發(fā)熱、咳嗽和疲勞等[1-2]，除此之外，還會(huì)造成多個(gè)器官的損傷[3]及心理應(yīng)激創(chuàng)傷[4]?；谥嗅t(yī)藥防治新冠肺炎的可觀療效，各省市相關(guān)機(jī)構(gòu)“三因制宜”陸續(xù)發(fā)布了中醫(yī)藥防治新冠肺炎的方案[5]。新冠0 號(hào)扶正辟邪方是由西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院自行研發(fā)的用于新冠肺炎防治的中藥復(fù)方制劑，該藥品以免煎顆粒的形式進(jìn)行發(fā)放及銷售。該藥組方為黃芪、銀花、廣藿香、連翹、貫眾、厚樸、白扁豆、薄荷、荊芥和蘆根[6]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明該處方的多種藥物或有效成分具有抑制病毒及細(xì)菌的作用[7]。中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)分析平臺(tái)（TCMSP）是用于中草藥藥理學(xué)研究的網(wǎng)絡(luò)平臺(tái)，是目前進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析的主要研究工具，而網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)為中醫(yī)方劑的機(jī)理研究提供了一種新的途徑[8]。有研究報(bào)道新冠肺炎爆發(fā)的病源為冠狀病毒SARS-CoV-2[9]。本研究利用數(shù)據(jù)庫(kù)篩選新冠0號(hào)的有效生物活性成分和靶點(diǎn)，分析其治療新冠肺炎的關(guān)鍵靶點(diǎn)和信號(hào)通路；選取SARS-CoV-2 作為核心受體與新冠0 號(hào)篩選出的核心成分進(jìn)行分子對(duì)接加以驗(yàn)證，為進(jìn)一步研究新冠0號(hào)及防治新冠肺炎提供指導(dǎo)。

1 材料和方法

1.1 新冠0號(hào)所含中藥化學(xué)成分相關(guān)靶點(diǎn)收集及篩選

通過(guò)TCMSP檢索新冠0號(hào)所含中草藥的所有有效成分，包括黃芪、銀花、廣藿香、連翹、貫眾、厚樸、白扁豆、薄荷、荊芥和蘆根；再以口服生物利用度（OB）≥30%，藥物相似性（DL）≥0.18 為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)化合物的藥物動(dòng)力學(xué)進(jìn)行篩選。運(yùn)用Uniprot 數(shù)據(jù)庫(kù)官方命名，將靶點(diǎn)基因的全稱轉(zhuǎn)換為簡(jiǎn)稱，并刪除無(wú)對(duì)應(yīng)基因名的靶點(diǎn)備用[10]。

1.2 新冠肺炎相關(guān)基因靶點(diǎn)收集及篩選

在Genecards數(shù)據(jù)庫(kù)中錄入關(guān)鍵詞“Novel coronavi?rus pneumonia”（新型冠狀病毒肺炎）收集疾病相關(guān)基因。

1.3 篩選新冠0號(hào)-新冠肺炎共同作用靶點(diǎn)

利用TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)搜索新冠0號(hào)關(guān)鍵化學(xué)成分的靶點(diǎn)信息，并通過(guò)Uniprot 數(shù)據(jù)庫(kù)查詢與靶點(diǎn)相對(duì)應(yīng)的人類基因名稱，然后與上一步篩選出的新冠肺炎的蛋白靶點(diǎn)基因進(jìn)行映射，得到藥物-疾病靶點(diǎn)基因[13]。

1.4 構(gòu)建中藥復(fù)方調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

為了研究新冠0 號(hào)防治新冠肺炎的作用機(jī)制，本研究將新冠0 號(hào)-新冠肺炎的共同蛋白靶點(diǎn)基因?qū)隒ytoscape 3.8.2軟件進(jìn)行可視化處理，將藥物-化合物-疾病靶點(diǎn)以網(wǎng)絡(luò)圖的形式呈現(xiàn)出來(lái)。在這個(gè)網(wǎng)絡(luò)圖中，鍵化合物和靶點(diǎn)以節(jié)點(diǎn)表示，節(jié)點(diǎn)之間相互作用的關(guān)系以邊來(lái)表示，以此篩選核心化合物[11]。以對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)數(shù)量超過(guò)10個(gè)的化合物作為核心化合物。

1.5 構(gòu)建蛋白互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)及核心基因篩選

以STRING數(shù)據(jù)平臺(tái)構(gòu)建新冠0號(hào)防治新冠肺炎靶蛋白PPI網(wǎng)絡(luò)，分析新冠0號(hào)防治新冠肺炎靶蛋白之間的相互作用。將藥物-疾病交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)，物種設(shè)為homo sapiens（人類），最低相互作用閾值設(shè)為medium confidence（中等置信程度0.4），其余參數(shù)保持默認(rèn)設(shè)置，將所得網(wǎng)絡(luò)保存為TSV格式備用[11]。

1.6 篩選PPI網(wǎng)絡(luò)核心基因

在TSV文件中篩選PPI網(wǎng)絡(luò)中的核心基因，將TSV文件導(dǎo)入Cytoscape 3.8.2軟件，使用CytoNCA插件并選擇Betweenness、Closeness、Degree、Eigenvector、Local Average Conmectivity-based method、Network 作為評(píng)分依據(jù)，這些數(shù)值大小與該節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中的位置的重要性呈正相關(guān)，得到打分文件后取所有大于中位值的基因得到核心網(wǎng)絡(luò)，重復(fù)篩選2次，得到核心基因[11]。

1.7 GO功能分析和KEGG通路富集分析

通過(guò)Bioconductor 數(shù)據(jù)庫(kù)查詢藥物-疾病共同靶點(diǎn)基因的基因ID。利用R 語(yǔ)言安裝Bioconductor 平臺(tái)相關(guān)安裝包，設(shè)置pvalue=0.05，qvalue=0.05進(jìn)行GO富集分析和KEGG富集分析，輸出結(jié)果并繪制氣泡圖[12-13]。

1.8 分子對(duì)接驗(yàn)證

將新冠肺炎的治療藥物α-干擾素、洛匹那韋、利托那韋、利巴韋林、磷酸氯喹和阿比多爾列為陽(yáng)性對(duì)照藥物，于PubChem 數(shù)據(jù)庫(kù)中下載以上陽(yáng)性藥物及篩選出的核心化合物小分子配體2D 結(jié)構(gòu)，使用ChemOffice軟件將其轉(zhuǎn)換為3D結(jié)構(gòu)；經(jīng)Auto Dock Tools加極性氫、分配電荷、設(shè)置可旋轉(zhuǎn)鍵后保存為pdbqt 格式文件；在PDB 數(shù)據(jù)庫(kù)中查找新冠肺炎的的核心基因SARSCoV-2（PDB ID:6LU7）作為蛋白受體；使用Py Mol 將靶蛋白和原始配體分離并去除水分子，將配體和受體導(dǎo)入Auto Dock Tools 軟件，分析其三維結(jié)構(gòu)活性部位，采集配體分子在受體活性口袋中的構(gòu)象模式；最后，使用Auto Dock Vina對(duì)接模型。配體與受體結(jié)合能越低，二者之間的結(jié)合就越穩(wěn)定，通常以結(jié)合能≤-5.0 kcal/mol作為標(biāo)準(zhǔn)以預(yù)測(cè)的關(guān)鍵活性成分和關(guān)鍵靶之間的結(jié)合情況[14]。

2 結(jié)果

2.1 新冠0號(hào)-活性化合物網(wǎng)絡(luò)分析

根據(jù)化合物的OB和DL的特性，分別篩選出黃芪、銀花、廣藿香、連翹、貫眾、厚樸、白扁豆、薄荷、荊芥和蘆根中所含的化合物分別為16、17、9、17、5、2、1、8、1和10種，去重后共71 種化合物，見圖1 及表1；通過(guò)在Uniprot 數(shù)據(jù)庫(kù)分析轉(zhuǎn)換，將Targets 全稱轉(zhuǎn)換為Gene Symbol，新冠0號(hào)所含的化合物共對(duì)應(yīng)了249個(gè)基因。

表1 新冠0號(hào)所含有效化合物Table 1 Effective compounds contained in Xinguan No.0

圖1 新冠0號(hào)所含有效化合物網(wǎng)絡(luò)圖Figure 1 Network diagram of effective compounds contained in Xinguan No.0

2.2 新冠0號(hào)-化合物-疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

在GeneCards 中與新冠肺炎有關(guān)的靶點(diǎn)共438 個(gè)。將新冠0號(hào)對(duì)應(yīng)的相應(yīng)目標(biāo)靶點(diǎn)數(shù)去重后，共獲得249個(gè)人源靶標(biāo)蛋白；通過(guò)使用Venny 2.1在線工具尋找新冠0 號(hào)所含249 個(gè)復(fù)合相關(guān)靶點(diǎn)與438 個(gè)新冠肺炎相關(guān)靶點(diǎn)的交集，共獲得58個(gè)重疊基因（圖2）。將新冠0號(hào)的活性成分與其對(duì)應(yīng)的疾病-藥物重合的靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape 3.8.2 形成新冠0 號(hào)-化合物-疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)分析圖（圖3）。該網(wǎng)絡(luò)由115 個(gè)節(jié)點(diǎn)和297 個(gè)邊緣組成，其中以節(jié)點(diǎn)表示符合相關(guān)目標(biāo)的活性化合物和目標(biāo)蛋白，以邊緣表示活性化合物與目標(biāo)蛋白之間的相互作用，以矩形的大小表示其連接數(shù)量的多少。在本次篩選中香葉木素（Diosmetin）存在于荊芥和薄荷中，β-胡蘿卜素（β-carotene）存在于白扁豆和銀花中，豆甾醇（Stigmasterol）荊芥、蘆根和銀花中，山柰酚（kaemp?ferol）存在于連翹、貫眾、黃芪和銀花中，β-谷甾醇（βsitosterol）存在于荊芥、連翹和銀花中，槲皮苷（querce?tin）存在于荊芥、連翹、黃芪、廣藿香和銀花中，木樨草素（luteolin）存在于荊芥、連翹、銀花和薄荷中；在這些靶點(diǎn)中，以相互連接的數(shù)目進(jìn)行排名，連接超10 個(gè)的包括：槲皮苷，共涉及43 個(gè)靶點(diǎn)，木樨草素共涉及22個(gè)，漢黃芩素（wogonin）共涉及18個(gè)，山柰酚共涉及14個(gè)，依立酮（irisolidone）共涉及12個(gè)，刺槐素（acacetin）和柚皮素（naringenin）各涉及11個(gè)，異鼠李素（isorham?netin）和花黃素（formononetin）各涉及10個(gè)靶點(diǎn)。這表明新冠0 號(hào)配方中的化合物可能共同作用于這些靶點(diǎn)，在防治新冠肺炎中發(fā)揮藥理作用。

圖2 新冠0號(hào)靶點(diǎn)與新冠肺炎靶點(diǎn)交集韋恩圖Figure 2 Venn diagram of intersection of Xinguan No.0 target and COVID-19 target

圖3 新冠0號(hào)-化合物-疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖Figure 3 Network diagram of Xinguan No.0-compound-disease target

2.3 蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將58 個(gè)藥物-疾病重疊的基因提交給STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)，隱藏游離點(diǎn)，最低相互作用閾值設(shè)為中等置信程度。獲得了由58 個(gè)PPI 網(wǎng)絡(luò)目標(biāo)基因，即由58 個(gè)節(jié)點(diǎn)和748 個(gè)邊緣組成的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，見圖4，邊緣代表蛋白之間的相關(guān)程度。在STRING 中下載TSV 文件，導(dǎo)入Cytoscape 3.8.2 軟件，使用CytoNCA 對(duì)TSV 文件進(jìn)行PPI 網(wǎng)絡(luò)分析得到核心基因網(wǎng)絡(luò)，最終篩選出11 個(gè)核心基因，包括PTGS2、VEGFA、ICAM1、MAPK8、CASP3、TP53、CCL2、MAPK3、MAPK1、MAPK14和CXCL8（圖5），這些可能是防治新冠肺炎的重要靶點(diǎn)。

圖4 新冠0號(hào)與新冠肺炎作用靶點(diǎn)蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖Figure 4 Network diagram of interaction between Xinguan No.0 and target proteins of COVID-19

圖5 新冠0號(hào)防治新冠肺炎核心蛋白靶點(diǎn)篩選圖Figure 5 Screening map of core protein targets for prevention and treatment of COVID-19 in Xinguan No.0

2.4 新冠0 號(hào)防治新冠肺炎作用靶點(diǎn)基因本體（GO）富集與KEGG通路富集分析

為了進(jìn)一步闡明58個(gè)候選靶點(diǎn)的可能作用，對(duì)新冠0 號(hào)防治新冠肺炎的158 個(gè)候選靶點(diǎn)進(jìn)行GO 富集分析和KEGG 生物途徑分析。得到生物過(guò)程（biologi?cal process，BP）條目2015個(gè)，細(xì)胞組成（cellular compo?nent，CC）條目41 和分子功能（molecular function，MF）條目124個(gè)，其中各組排名前10的條目見圖6。在生物過(guò)程中，對(duì)脂多糖應(yīng)答，對(duì)細(xì)菌來(lái)源分子的反應(yīng)，細(xì)胞對(duì)生物刺激的反應(yīng)等排位靠前；在細(xì)胞組成中對(duì)膜筏、膜微區(qū)和膜的調(diào)控等排在前面；在分子功能中與細(xì)胞因子受體結(jié)合、蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶活性及信號(hào)受體激活物的活性等密切相關(guān)。KEGG 生物途徑分析出與之相關(guān)的信號(hào)途徑功166條，取排名前30 的條目見圖7。結(jié)果顯示，糖尿病并發(fā)癥的年齡-年齡信號(hào)通路、人巨細(xì)胞病毒感染和神經(jīng)退行性變途徑-多種疾病通路及多種病毒、炎癥相關(guān)通路與新冠0 號(hào)防治新冠肺炎的機(jī)制有關(guān)。

圖6 新冠0號(hào)防治新冠肺炎作用靶點(diǎn)GO富集分析Figure 6 GO enrichment analysis of targets of Xinguan No.0 inprevention and treatment of COVID-19

圖7 新冠0號(hào)防治新冠肺炎作用靶點(diǎn)KEGG富集分析Figure 7 KEGG enrichment analysis of targets of Xinguan No.0 in prevention and treatment of COVID-19

2.5 新冠0號(hào)防治新冠肺炎活性成分分子對(duì)接

將SARS-CoV-2 作為核心受體對(duì)新冠0 號(hào)-化合物-疾病網(wǎng)絡(luò)中的核心化合物及陽(yáng)性對(duì)照藥物進(jìn)行分子對(duì)接。分子對(duì)接結(jié)果顯示新冠0號(hào)的關(guān)鍵活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)對(duì)接的親和力均小于-5.0 kcal/mol，由此表明預(yù)測(cè)的新冠0號(hào)關(guān)鍵活性成分與防治新冠肺炎的關(guān)鍵作用靶點(diǎn)具有較好的結(jié)合活性，與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選結(jié)果一致，驗(yàn)證了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)具有一定的可靠性，見表2。

表2 新冠0號(hào)核心化合物及陽(yáng)性對(duì)照藥與SARS-CoV-2的分子對(duì)接Table 2 Molecular docking of SARS-CoV-2 and core compound and positive control drug in Xinguan No.0

3 討論

新冠0 號(hào)組方以黃芪、銀花為君藥，重用黃芪，方以益氣固表，御邪于外，銀花清熱解毒、補(bǔ)氣祛邪，二者聯(lián)用相得益彰[15-17]；廣藿香、連翹、貫眾及厚樸共為臣藥，四藥相配取其清熱解毒，輕宣透表之功[18]；荊芥解表祛風(fēng)，薄荷疏風(fēng)清熱而清利頭目，厚樸、白扁豆運(yùn)脾燥濕，下氣和中，此四味同為佐藥[19]；蘆根為使藥，其性甘而寒，可清熱生津，滋肺清肺，取引經(jīng)入肺之效[20]。諸藥共用，共奏益氣解毒、清熱化濁之功?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究證實(shí)黃芪有效成分黃芪甲苷具有包括誘導(dǎo)T細(xì)胞活化，調(diào)節(jié)效應(yīng)子/調(diào)節(jié)T 細(xì)胞平衡，增強(qiáng)CD45 磷酸酶活性，抑制促炎細(xì)胞因子及免疫刺激的作用[16，21]；酸和類黃酮提取物是金銀花主要的抗病毒活性成分，其黃酮提取物對(duì)H7N9 流感病毒抑制作用最強(qiáng)[17，22]；此外，已逐步驗(yàn)證廣藿香、薄荷、荊芥及蘆根等的有效成分化合物均有不同程度的抗病毒作用[18-20]。新冠0 號(hào)自批準(zhǔn)配置以來(lái)共生產(chǎn)銷售和發(fā)放近3 萬(wàn)劑，在2020 年3月疫情較為嚴(yán)重的階段起到了保健康、穩(wěn)人心的重要作用，對(duì)四川省疫情的防控作出了較大貢獻(xiàn)[9]。

通過(guò)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)收集新冠0號(hào)化合物成分共71個(gè)，對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)數(shù)為249個(gè)，其中與新冠肺炎共同的靶點(diǎn)數(shù)有58個(gè)，如篩選出的核心靶點(diǎn)PTGS2、VEGFA、ICAM1、MAPK8 和CASP3等，此外還有包括白介素在內(nèi)的多種炎性因子。有研究表明，SARS-CoV-2 病毒感染將啟動(dòng)機(jī)體的炎癥反應(yīng)、感染、細(xì)胞凋亡等病理過(guò)程，免疫力低下的群體感染病毒后會(huì)引發(fā)體內(nèi)免疫細(xì)胞分泌大量炎癥因子如TNF-α、IL-1、IL-6、IL-12 和IFN-α等，這種因人體免疫系統(tǒng)過(guò)度激活導(dǎo)致的細(xì)胞因子風(fēng)暴（cytokine storm）是引起急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）和多臟器功能失常綜合征（multiple organ dysfunction syndrome，MODS）的重要原因，亦是新冠病毒致死的主要原因之一。已有文獻(xiàn)報(bào)道新冠0號(hào)的有效化學(xué)成分具有提高人體免疫力、抗炎及抗感染的作用，運(yùn)用中醫(yī)理論解釋其組方的科學(xué)性亦表明了該處方具有“御邪于外”“扶正祛邪”的防治效果[23]。

SARS-CoV-2 屬于β-冠狀病毒，內(nèi)含大量非結(jié)構(gòu)蛋白。目前已有研究發(fā)現(xiàn)血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2（angiotensin-converting enzyme 2，ACE2）能夠作為該病毒的宿主細(xì)胞受體，抑制病毒與受體的結(jié)合具有潛在的治療意義[24]。研究人員通過(guò)計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)鑒定了一種基于SARS-CoV-2 的有效抑制劑N3，基于結(jié)構(gòu)的虛擬和高通量篩選相結(jié)合所篩選的靶向藥物對(duì)于防治新冠肺炎具有重要意義[9]。根據(jù)“新冠0 號(hào)-化合物-疾病靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖選取槲皮苷、木樨草素、漢黃芩素和山柰酚等超過(guò)10 個(gè)連接基因的化合物作為核心化合物配體與受體SARS-CoV-2 進(jìn)行分子對(duì)接，結(jié)果顯示這9 種化合物與受體均具有較好的結(jié)合能，表明其作為藥物進(jìn)入人體后能與該受體進(jìn)行結(jié)合的可能性大因此存在潛在的作用價(jià)值。槲皮苷、木樨草素、依立酮、刺槐素和花黃素與SARS-CoV-2 的結(jié)合能均≤7 kcal/mol，表明其發(fā)生作用的可能性更大，表明新冠0號(hào)具有抑制SARS-CoV-2 病毒的潛在能力，起到治療COVID-19 的作用，這些觀點(diǎn)在柴胡達(dá)原飲、玉屏風(fēng)散等中醫(yī)藥防治新冠肺炎的研究中亦得到了類似的結(jié)論[25-27]。雖然陽(yáng)性對(duì)照藥物如洛匹那韋、利托那韋、利巴韋林和阿比多爾都顯示出了較好的結(jié)合活性，其確切的作用機(jī)制和療效擁有一定的循證醫(yī)學(xué)證據(jù)支撐，但根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道使用大劑量的抗病毒治療產(chǎn)生的藥物副作用可能會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生不可逆的損傷[28-30]。中醫(yī)藥具有多成分、多靶點(diǎn)、雙向調(diào)節(jié)、副作用少等優(yōu)勢(shì)特點(diǎn)，其在防治新冠肺炎中還具有更大的潛力亟待挖掘[31]。

4 結(jié)論

本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)合分子對(duì)接的方法從“藥物-疾病-靶點(diǎn)”角度探討新冠0號(hào)防治新冠肺炎的分子機(jī)制。分析結(jié)果表明新冠0 號(hào)可通過(guò)槲皮苷、木樨草素、漢黃芩素、山柰酚和依立酮等成分作用于新冠病毒靶點(diǎn)SARS-CoV-2 及機(jī)體PTGS2、VEGFA、ICAM1、MAPK8 和CASP3 等因子，影響多條病毒及炎癥相關(guān)通路活性以起到防治新冠肺炎的作用。本研究初步確定了新冠0 號(hào)通過(guò)靶向SARS-CoV-2 防治新冠肺炎的的科學(xué)性，基本明確了該處方的有效成分組成，為臨床合理應(yīng)用及防治新冠病毒感染提供了有價(jià)值的理論依據(jù)。

（利益沖突：無(wú)）