固相萃取柱凈化-氣相色譜-三重四極桿質(zhì)譜法測(cè)定茶葉中角鯊烯的含量

周 敏,孫文閃,董葉箐,趙月鈞,鐘寒輝,王川丕

(綠城農(nóng)科檢測(cè)技術(shù)有限公司,杭州 310052)

角鯊烯是動(dòng)植物、微生物和海洋微藻等的脂肪組織中一種功能性活性脂質(zhì),具有抗氧化、調(diào)節(jié)膽固醇代謝、防癌抗癌、抗輻射、解毒和抑制微生物生長(zhǎng)等功能[1-2],廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥產(chǎn)品和化妝品中。茶葉是人日常生活必不可少的消費(fèi)品,角鯊烯是其中重要的功能成分。隨著人對(duì)茶葉品質(zhì)要求的提高,茶葉中角鯊烯含量的準(zhǔn)確測(cè)定變得越來越有意義,而不同產(chǎn)地和不同發(fā)酵工藝制備的茶葉中角鯊烯的含量存在一定差異,因此有必要提供一種簡(jiǎn)單、通用性強(qiáng)的檢測(cè)方法。

角鯊烯的前處理方法主要有機(jī)溶劑提取法、皂化法、分布結(jié)晶法、固相萃取法、固相微萃取法、超臨界二氧化碳萃取法[3-5]。測(cè)定方法主要為高效液相色譜法[6-8]、氣相色譜法[9-13]、氣相色譜-質(zhì)譜法[14-15]等。目前,相關(guān)研究多集中在植物油中角鯊烯含量的測(cè)定上[11-19],茶葉中角鯊烯的檢測(cè)方法的研究較少。

鑒于此,本工作以固相萃取柱凈化茶葉樣品,以氣相色譜-三重四極桿質(zhì)譜法測(cè)定其中角鯊烯的含量,該方法前處理凈化效果好、靈敏度高,通過內(nèi)標(biāo)法可以有效消除基質(zhì)干擾,準(zhǔn)確度高,可為茶葉中角鯊烯含量的測(cè)定提供重要的參考依據(jù)。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

TQ8040 型氣相色譜-三重四極桿質(zhì)譜儀;ST16R 型離心機(jī);BSA2202S 型電子天平;TALBOYS型旋渦混合器;KQ5200E 型超聲波清洗器;RE52-86A 型 旋轉(zhuǎn)蒸 發(fā)儀;Reeko AutoEVA-20 型全自動(dòng)氮吹濃縮儀;弗羅里硅土(Cleanert Florisil)小柱;石墨化碳黑-氨基復(fù)合(Cleanert GCB-NH2)小柱;0.22μm 有機(jī)濾膜。

單標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液:4 000 mg·L－1,分別取適量角鯊烯、角鯊?fù)?內(nèi)標(biāo))標(biāo)準(zhǔn)品,用正己烷溶解并定容于25 mL容量瓶中,搖勻后置于4 ℃冰箱中避光保存,有效期6個(gè)月。

角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)中間液:40.0 mg·L－1,取4 000 mg·L－1角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液1.00 mL,用正己烷定容于100 mL容量瓶中,搖勻備用。

角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)溶液系列:取適量角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)中間液和角鯊?fù)闃?biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液,用正己烷逐級(jí)稀釋,配制成質(zhì)量濃度分別為0.030 0,0.050 0,0.200,0.500,1.00,2.00 mg·L－1的角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)溶液系列,其中角鯊?fù)榈馁|(zhì)量濃度為1.00 mg·L－1,現(xiàn)配現(xiàn)用。

角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)品(規(guī)格為5 mL)的純度不小于99.4%;角鯊?fù)闃?biāo)準(zhǔn)品(規(guī)格為5 mL)的純度不小于99.5%;丙酮、正己烷、乙腈、乙醚、甲醇、甲苯、石油醚均為色譜純;試驗(yàn)用水為二級(jí)水。48批茶葉樣品分別為綠茶(20 批次)、紅茶(10 批次)、普洱茶(10批次)和烏龍茶(8批次),產(chǎn)地分別為浙江杭州西湖龍井村、浙江湖州安吉縣、浙江衢州開化縣齊溪鎮(zhèn)、浙江金華武義縣。

1.2 儀器工作條件

1.2.1 色譜條件

HP-5MS色譜柱(30 m×0.25 mm,0.25μm);進(jìn)樣口溫度250 ℃;載氣為氦氣,純度不小于99.999%;碰撞氣為氬氣,純度不小于99.999%;流量1.00 mL·min－1。柱升溫程序:初始溫度為80 ℃,保持2.00 min;以40 ℃·min－1速率升溫至250 ℃,保持1.00 min;以20℃·min－1速率升溫至290 ℃,保持3.75 min;總用時(shí)13.00 min。進(jìn)樣量1μL;不分流進(jìn)樣。

1.2.2 質(zhì)譜條件

電子轟擊離子源;色譜-質(zhì)譜接口溫度230 ℃;電離能量70 eV;離子源溫度230 ℃;檢測(cè)器電壓1.40 kV;多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式。角鯊烯、角鯊?fù)槎侩x子對(duì)質(zhì)荷比(m/z)分別為136.00/112.10,113.00/71.10,碰撞能量分別為9,6 eV;定性離子對(duì)m/z分別為149.00/93.00,149.00/107.10 和113.00/57.10,127.00/71.10,碰撞能量分別為9,6 eV 和6,6 eV。

1.3 試驗(yàn)方法

取5.000 g樣品,置于50 mL 離心管中,加入100 mg·L－1角鯊?fù)閮?nèi)標(biāo)溶液50μL 和石油醚50 mL,以2 500 r·min－1轉(zhuǎn)速渦旋3 min,超聲30 min,以8 000 r·min－1轉(zhuǎn)速離心3 min。上清液過定性濾紙,濾液置于100 mL雞心瓶中,再按照上述步驟重復(fù)提取1次。合并提取液,于40℃水浴中旋至1～2 mL,得到待測(cè)液。用體積比3∶1 的乙腈-甲苯混合溶液5 mL活化Cleanert GCB-NH2小柱,在待測(cè)液中加入體積比3∶1的乙腈-甲苯混合溶液3 mL,過Cleanert GCB-NH2小柱。分兩次用6 mL體積比3∶1的乙腈-甲苯混合溶液清洗雞心瓶,洗液全部過柱,再用體積比3∶1的乙腈-甲苯混合溶液25 mL洗脫小柱。洗脫液收集于100 mL雞心瓶中,于40 ℃水浴中旋至近干,用氮?dú)饩従彺蹈珊?加入5.00 mL 正己烷,超聲30 s,過0.22μm 有機(jī)濾膜,濾液按照儀器工作條件測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 前處理?xiàng)l件的選擇

2.1.1 提取溶劑

試驗(yàn)考察了乙醚、甲醇、丙酮、乙腈、石油醚等5種提取溶劑對(duì)加標(biāo)茶葉樣品(加標(biāo)量1.00 mg·kg－1)中角鯊烯回收率的影響,每種溶劑均平行測(cè)定6次,結(jié)果見圖1。

圖1 不同提取溶劑效果的比較Fig.1 Comparison of effects with different extraction solvents

由圖1可知:甲醇、乙腈的提取效果相對(duì)較差,回收率在60.0%,65.0%左右;乙醚、丙酮、石油醚對(duì)茶葉中角鯊烯的提取效果較好,回收率均在85.0%以上?？紤]到丙酮、乙醚為易制毒有機(jī)試劑,領(lǐng)用成本高,試驗(yàn)選擇石油醚作為茶葉中角鯊烯的提取溶劑。

2.1.2 提取溶劑體積

適宜體積的提取溶劑不僅能滿足回收率的要求,還能避免浪費(fèi)和對(duì)環(huán)境的污染,因此試驗(yàn)考察了提取溶劑體積(20,30,40,50,60 mL)對(duì)加標(biāo)茶葉樣品(加標(biāo)量1.00 mg·kg－1)中角鯊烯回收率的影響,每種體積均平行測(cè)定6次,結(jié)果見圖2。

圖2 不同體積提取溶劑效果的比較Fig.2 Comparison of effects with different volumes of the extraction solvent

由圖2可知,角鯊烯回收率隨著提取溶劑體積的增加而增加,當(dāng)提取溶劑體積不小于50 mL 時(shí),回收率無明顯提高,因此試驗(yàn)選擇的提取溶劑石油醚體積為50 mL。

2.1.3 超聲時(shí)間

試驗(yàn)考察了超聲時(shí)間(10,15,20,25,30,35 min)對(duì)加標(biāo)茶葉樣品(加標(biāo)量1.00 mg·kg－1)中角鯊烯回收率的影響,每種溶劑均平行測(cè)定6次,結(jié)果見圖3。

圖3 不同超聲時(shí)間效果的比較Fig.3 Comparison of effects with different ultrasound time

由圖3可知,角鯊烯回收率隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)而增加,當(dāng)超聲時(shí)間不小于30 min時(shí),回收率無明顯提高,因此試驗(yàn)選擇的超聲時(shí)間為30 min。

2.1.4 凈化小柱

茶葉基質(zhì)復(fù)雜,其中色素、茶多酚、多糖、咖啡堿、茶氨酸等成分含量較高,經(jīng)過石油醚提取后,大部分有機(jī)雜質(zhì)可隨角鯊烯一同提取出來,如果直接上機(jī)測(cè)定,不僅會(huì)導(dǎo)致基線噪聲高、雜質(zhì)峰多,還會(huì)對(duì)儀器進(jìn)樣口和毛細(xì)管柱造成污染。因此,有必要對(duì)提取液進(jìn)行凈化。試驗(yàn)比較了Cleanert Florisil小柱和Cleanert GCB-NH2小柱的凈化效果,樣品凈化前后的色譜圖見圖4。

圖4 不同小柱凈化樣品前后的色譜圖Fig.4 Chromatograms of samples before and after purification with different cartridges

由圖4可知:未凈化時(shí),樣品色譜圖中雜質(zhì)峰較多;以Cleanert Florisil小柱凈化后,雜質(zhì)峰減少,回收率為70.0%～85.0%,但樣品溶液為黃色,說明該小柱對(duì)色素的去除效果較差,大批量分析時(shí)可能會(huì)污染儀器;以Cleanert GCB-NH2小柱凈化后,基線噪聲下降,有機(jī)干擾物減少,樣品溶液為無色,回收率為77.6%～95.6%,說明該小柱對(duì)雜質(zhì)的去除效果較好。因此,試驗(yàn)選擇Cleanert GCB-NH2小柱凈化茶葉樣品。

2.1.5 洗脫溶劑

洗脫溶劑的選擇非常重要,要求它既能洗脫目標(biāo)物,又能固定雜質(zhì)。Cleanert GCB-NH2小柱常采用的洗脫溶劑為乙腈-甲苯混合溶液,經(jīng)過多次試驗(yàn)優(yōu)化,發(fā)現(xiàn)混合溶液中乙腈和甲苯體積比為3∶1時(shí),角鯊烯和角鯊?fù)榫鼙幌疵撓聛?同時(shí)色素、茶多酚、多糖、咖啡堿、茶氨酸等極性物質(zhì)會(huì)固定在小柱上。因此,試驗(yàn)選擇體積比3∶1的乙腈-甲苯混合溶液作為洗脫溶劑。

2.1.6 洗脫溶劑體積

試驗(yàn)考察了洗脫溶劑體積(10,15,20,25,30 mL)對(duì)加標(biāo)茶葉樣品(加標(biāo)量1.00 mg·kg－1)中角鯊烯回收率的影響,每種體積均平行測(cè)定6次,結(jié)果見圖5。

圖5 不同體積洗脫溶劑效果的比較Fig.5 Comparison of effects with different volumes of the elution solvent

由圖5可知:角鯊烯回收率隨著洗脫溶劑體積的增加而增加,當(dāng)洗脫體積不小于25 mL 時(shí),回收率沒有明顯提高,因此試驗(yàn)選擇的洗脫溶劑體積為25 mL。

2.2 質(zhì)譜條件的選擇

對(duì)角鯊烯和角鯊?fù)檫M(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜掃描,找到響應(yīng)較高的離子碎片,對(duì)它進(jìn)行子離子掃描,并在3～45 eV 內(nèi)進(jìn)行碰撞能量?jī)?yōu)化,將響應(yīng)較強(qiáng)的3個(gè)離子對(duì)作為定量離子對(duì)和定性離子對(duì),優(yōu)化后的質(zhì)譜參數(shù)詳見1.2.2節(jié)。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限及測(cè)定下限

按照儀器工作條件測(cè)定角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)溶液系列,以角鯊烯的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),其對(duì)應(yīng)的峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果顯示,角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍為0.030 0～2.00 mg·L－1,線 性 回 歸 方 程 為y＝1.725x＋0.126 0,相關(guān)系數(shù)為0.999 4。

對(duì)空白加標(biāo)樣品進(jìn)行試驗(yàn),以3,10 倍信噪比(S/N)對(duì)應(yīng)的加標(biāo)量計(jì)算檢出限(3S/N)和測(cè)定下限(10S/N),得到的結(jié)果分別為0.010 0,0.030 0 mg·kg－1。

2.4 精密度和回收試驗(yàn)

以紅茶、綠茶、普洱茶、烏龍茶等經(jīng)過不同發(fā)酵工藝制備的茶葉樣品為待測(cè)對(duì)象,對(duì)其進(jìn)行3個(gè)濃度水平的加標(biāo)回收試驗(yàn),每個(gè)濃度水平平行測(cè)定6次,計(jì)算回收率和測(cè)定值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD),結(jié)果見表1。

表1 精密度和回收試驗(yàn)結(jié)果(n＝6)Tab.1 Results of tests for precision and recovery(n＝6)

由表1可知,不同類型茶葉樣品中角鯊烯的回收 率 為77.6%～95.6%,RSD 為4.5%～8.3%,準(zhǔn) 確度和精密度均符合GB/T 27404－2008《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測(cè)》附表F.1和附表F.2的要求。

2.5 樣品分析

按照試驗(yàn)方法分析各地具有代表性的48批茶葉樣品,角鯊烯均有檢出,檢出量為0.10～29.5 mg·kg－1,但是不同茶葉中角鯊烯含量差異較大,可能與產(chǎn)地環(huán)境以及發(fā)酵工藝有關(guān),需要進(jìn)一步研究。

本工作以Cleanert GCB-NH2小柱凈化茶葉樣品,用氣相色譜-三重四極桿質(zhì)譜法測(cè)定樣品溶液中角鯊烯的含量,該方法前處理凈化效果好、靈敏度和準(zhǔn)確度高,可為茶葉中角鯊烯的研究提供重要的參考依據(jù)。