凝膠色譜-多角度激光光散射法測定聚對二氧環(huán)己酮絕對分子量及分子量分布指數(shù)

彭 健,施燕平,劉 葉,沈 永,劉莉莉,陳 方

(1.山東省醫(yī)療器械和藥品包裝檢驗(yàn)研究院,濟(jì)南 250101;2.國家藥品監(jiān)督管理局生物材料器械安全性評價重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,濟(jì)南 250101;3.山東省醫(yī)療器械生物學(xué)評價重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,濟(jì)南 250101)

聚對二氧環(huán)己酮(PPDO)是由對二氧環(huán)己酮聚合而成的高分子聚合物,分子鏈上有醚鍵,具有較高的柔韌性和抗張強(qiáng)度[1]。由PPDO 制成的醫(yī)療產(chǎn)品,如可吸收手術(shù)縫合線、面部提拉線、生物可吸收支架、止血鉗、止血膏、縫合線夾、藥用篩網(wǎng)和醫(yī)用黏合劑等[2-6],具有優(yōu)異的生物相容性、可吸收性和生物可降解性,被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。該類產(chǎn)品在體內(nèi)的降解產(chǎn)物會經(jīng)代謝作用排出體外,對人體無危害性及毒副作用,效果優(yōu)于傳統(tǒng)材料制品[7]。PPDO 相對分子質(zhì)量及分子量分布指數(shù)[D,重均分子量(Mw)和數(shù)均分子量(Mn)的比值]會影響PPDO產(chǎn)品的力學(xué)性能,而聚合物相關(guān)測定方法通常為黏度法和凝膠色譜法(GPC)。前者無法獲得D,后者需要采用標(biāo)準(zhǔn)品聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚苯乙烯(PS)等校準(zhǔn),但PMMA、PS的空間構(gòu)象和PPDO 的存在差異,不能真實(shí)反映PPDO的絕對分子量。激光光散射法是一種非破壞性、無需校正的檢測相對分子質(zhì)量和分子尺寸的方法,散射光強(qiáng)度正比于待測分子的絕對分子量、含量、折光指數(shù)增量的平方,散射光角度只與分子尺寸相關(guān)。將凝膠色譜法和多角度激光光散射儀聯(lián)用,不僅能分離出樣品中不同組分,還可在不依賴標(biāo)準(zhǔn)品的前提下得到PPDO 的Mw、Mn、D、均方根旋轉(zhuǎn)半徑(Rg)、分子構(gòu)象和聚集態(tài)等[8-11],為PPDO 絕對分子量的準(zhǔn)確測定提供參考。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 1260 Infinity 型凝膠色譜儀,配G1311C 型四元泵、G1329B 型自動進(jìn)樣系統(tǒng)和G1316A 型柱溫箱;Optilab T-r EX 型示差折光儀和DAWN HELEOS-Ⅱ型18角度激光光散射儀,軟件分別采用Astra 5.3.4和Astra 6.1;ME3002E/02型電子天平。

PMMA 歸一化標(biāo)準(zhǔn)溶液:取相對分子質(zhì)量為22 800的PMMA 標(biāo)準(zhǔn)品10.2 mg,用流動相溶解并稀釋,配制成2 g·L－1PMMA 歸一化標(biāo)準(zhǔn)溶液。

六氟異丙醇(HFIP)的純度為99.5%;三氟乙酸鈉的純度為97%;相對分子質(zhì)量分別為602,2 160,5 980,12 900,22 800,41 400,88 500,202 000,520 000,988 000,1 510 000,2 200 000 的PMMA標(biāo)準(zhǔn)品的純度均為100%;PPDO 面部埋植線(外購)產(chǎn)品批號分別為1924301X、CB19041903、CB19041502、CB19 041501;試驗(yàn)用水為純化水。

1.2 儀器工作條件

1.2.1 色譜儀

Shodex HFIP 805(300 mm×8.0 mm,6μm)/Shodex HFIP 803(300 mm×8.0 mm,6μm)串聯(lián)色譜柱;柱溫40 ℃;流動相為含0.01 mol·L－1三氟乙酸鈉的HFIP溶液(使用前用0.22μm 聚四氟乙烯濾膜過濾并超聲30 min);流量1.0 mL·min－1;進(jìn)樣量50μL。

1.2.2 示差折光儀

用流動相沖洗儀器至基線穩(wěn)定,使基線噪音穩(wěn)定在±7.5×10－10RIU(折射率單位)附近;溶劑為流動相;檢測波長690 nm;流量1 mL·min－1;進(jìn)樣量1 mL;用Astra 5.3.4軟件采集數(shù)據(jù)。

1.2.3 多角度激光光散射儀

依次使用過濾后的純化水、異丙醇、甲苯?jīng)_洗儀器至激光信號穩(wěn)定;流量1 mL·min－1;進(jìn)樣量1 mL;使用甲苯對激光常數(shù)進(jìn)行測定,激光常數(shù)4.395 5×10－5;用Astra 6.1軟件采集數(shù)據(jù)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 折光指數(shù)增量的測定

取0.253 4 g PPDO 樣品,用流動相溶解并稀釋,配制成5.068 g·L－1PPDO 樣品儲備溶液。取適量上述溶液,用流動相逐級稀釋,配制成質(zhì)量濃度分 別 為0.851 76,1.729 8,2.557 8,3.382 8,4.226 3 g·L－1的PPDO 樣品溶液系列。按照示差折光儀工作條件測定,以PPDO 的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),對應(yīng)的示差響應(yīng)信號為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,所得斜率值即為折光指數(shù)增量,結(jié)果為0.185 3 mL·g－1,用于計(jì)算PPDO 的絕對分子量。

1.3.2 絕對分子量、Rg和D的測定

取適量PPDO 樣品,用流動相逐級稀釋,配制成質(zhì)量濃度為4 g·L－1的PPDO 樣品溶液,用0.45μm濾膜過濾,濾液中各組分按照色譜儀工作條件分離。用相對分子質(zhì)量為22 800的PMMA 歸一化標(biāo)準(zhǔn)溶液對激光光散射儀的不同角度相對于90°進(jìn)行歸一化校正,以修正光電二極管靈敏度及幾何形狀差異。按照多角度激光光散射儀工作條件測定色譜儀分離得到的目標(biāo)產(chǎn)物,同時參考文獻(xiàn)[10-11],采用光散射法測定絕對分子量的公式,計(jì)算Mw、Mn、Rg和D。

2 結(jié)果與討論

2.1 流動相的選擇

PPDO 在常用溶劑三氯甲烷、四氫呋喃等中無法溶解,加熱的條件下可溶解在N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基亞砜(DMSO)中,無法適用常溫下的光散射法測試。HFIP極性較高、黏度較大,在常溫下即可快速溶解PPDO[12],因此試驗(yàn)選擇以HFIP作流動相,并在其中添加三氟乙酸鈉至其質(zhì)量濃度達(dá)到0.01 mol·L－1,以降低流動相黏度和色譜柱壓力,增強(qiáng)PPDO 的分離效果。

2.2 色譜柱的選擇

試驗(yàn)考察了串聯(lián)色譜柱A(Shodex HFIP 805/Shodex HFIP 803,相對分子質(zhì)量排阻范圍1 000～600 000)和串聯(lián)色譜柱B(2根PL1114-6900 HFIP色譜柱串聯(lián),相對分子質(zhì)量排阻范圍100～2 000 000)對樣品分離效果的影響,結(jié)果見圖1。

圖1 樣品在不同串聯(lián)色譜柱下的光散射色譜圖Fig.1 Light scattering chromatograms of the sample on different columns

由圖1可知,以串聯(lián)色譜柱B 分離時,樣品的光散射色譜峰前端有一個干擾峰,因此試驗(yàn)選擇以Shodex HFIP 805/Shodex HFIP 803串聯(lián)色譜柱進(jìn)行色譜分離。

2.3 樣品溶液質(zhì)量濃度對Mw 測定的影響

樣品溶液質(zhì)量濃度的選擇很關(guān)鍵,樣品溶液質(zhì)量濃度過高時,樣品溶液黏度較大,易黏附在色譜柱上,導(dǎo)致色譜柱過載,峰形變差,甚至出現(xiàn)平頭峰,結(jié)果穩(wěn)定性較差。因此,試驗(yàn)考察了PPDO 樣品(1924301X)溶液質(zhì)量濃度分別為0.5,2,4,8 g·L－1時對Mw測定的影響,每個質(zhì)量濃度的樣品溶液均平行測定6 份,計(jì)算Mw的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD),結(jié)果見表1。

表1 不同質(zhì)量濃度PPDO 樣品溶液下Mw 及其RSD(n＝6)Tab.1 Mw and RSD with different mass concentrations of PPDO sample solutions(n＝6)

由表1可知,Mw隨著PPDO 樣品溶液質(zhì)量濃度的增加而降低,樣品溶液的質(zhì)量濃度為4 g·L－1時Mw的RSD 較小,且此時PPDO 色譜峰峰形較好。

按照試驗(yàn)方法分析同質(zhì)量濃度的4 種PPDO樣品溶液,Mw、Mn和D結(jié)果見表2。

表2 不同批號PPDO 樣品的Mw、Mn 和D 及其RSDs(n＝6)Tab.2 Mw,Mn,D and their RSDs of different batches of PPDO samples(n＝6)

由表2可知,Mw、Mn和D測定值的RSD 分別小于3.0%,5.0%和4.0%,說明此質(zhì)量濃度所得的測定結(jié)果的穩(wěn)定性較好,因此試驗(yàn)選擇制備的樣品溶液的質(zhì)量濃度為4 g·L－1。

2.4 聚合物分子半徑以及構(gòu)象的確定

Rg隨Mw變化的曲線見圖2,其中縱坐標(biāo)為對數(shù)坐標(biāo)。

圖2 Rg 隨M w 的變化曲線Fig.2 Curves showing the change of Rg with M w

結(jié)果顯示,PPDO 在HFIP 中的Rg在20～70 nm 內(nèi)。基于文獻(xiàn)[13]的研究結(jié)果,當(dāng)Rg隨Mw變化的曲線的斜率為1時,聚合物為棒狀結(jié)構(gòu),其分子長度與Rg、Mw成正比;斜率為0.5～0.6時,聚合物為無規(guī)線團(tuán)結(jié)構(gòu),分子末端距與Rg、Mw1/2成正比;斜率為1/3 時聚合物呈球形,球體半徑與Rg、Mw1/3成正比。本試驗(yàn)所得斜率為0.55,表明PPDO為無規(guī)線團(tuán)結(jié)構(gòu),分子鏈呈卷曲構(gòu)象,這有利于增加PPDO 埋植線的柔順性。

2.5 方法比對

按照色譜儀工作條件測定由1.1節(jié)中12個不同相對分子質(zhì)量的PMMA 標(biāo)準(zhǔn)品制成的PMMA標(biāo)準(zhǔn)溶液(1 g·L－1,稀釋劑為流動相),以tR為橫坐標(biāo),lgMW為縱坐標(biāo)進(jìn)行三次擬合回歸,所得回歸方 程 為y＝－0.002 892x3＋0.170 5x2－3.618x＋30.88,相關(guān)系數(shù)為0.999 7。取適量樣品(1924301X),用流動相稀釋,配制成4 g·L－1樣品溶液,按照色譜儀工作條件測定,代入回歸方程,所得Mw、Mn和D 分別為204 372,148 347,1.968,遠(yuǎn)高于本方法的測定結(jié)果(表2),這是由于PMMA 與PPDO 的分子結(jié)構(gòu)存在差異,由PMMA 校準(zhǔn)得到的結(jié)果不能反映樣品的真實(shí)情況。

本工作利用GPC 和多角度激光光散射儀聯(lián)用法測定PPDO 的絕對分子量及D,該方法不依賴任何假設(shè)和標(biāo)準(zhǔn)曲線,且精密度好、操作簡單,可對以PPDO 為原料的產(chǎn)品的質(zhì)量控制以及安全性評價提供技術(shù)參考。