富血小板血漿治療薄型子宮內(nèi)膜的研究進展

李慕白，楊清，馬紅麗，仇穎

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院a.婦科一科，b.內(nèi)鏡診療科，哈爾濱 150040； 2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，哈爾濱 150040)

據(jù)統(tǒng)計，全球范圍內(nèi)育齡期不孕癥患者達8%～12%[1]，其中以薄型子宮內(nèi)膜所致不孕較為常見。子宮內(nèi)膜過薄會影響子宮內(nèi)膜容受性，并導(dǎo)致臨床妊娠率、活產(chǎn)率的下降[2]。在輔助生殖技術(shù)中，子宮內(nèi)膜的狀態(tài)被認為是胚胎種植成功的關(guān)鍵因素。研究發(fā)現(xiàn)，在胚胎移植失敗的群體中，子宮內(nèi)膜容受性不良者占總數(shù)的2/3以上[3]。目前，薄型子宮內(nèi)膜的定義多以人絨毛膜促性腺激素日子宮內(nèi)膜厚度<7 mm為參考[4]。隨著研究的深入，薄型子宮內(nèi)膜的治療也不斷更新，但新型療法(干細胞的應(yīng)用等)存在治療體系不成熟的弊端，因此薄型子宮內(nèi)膜治療在生殖醫(yī)學(xué)領(lǐng)域仍是一項亟待解決的難題。富血小板血漿(platelet-rich plasma，PRP)是自體全血經(jīng)離心后得到的血小板濃縮物，含有大量參與各種細胞增殖、遷移和組織再生的生長因子[5]。宮腔灌注PRP是一種較為新穎的治療手段，2015年我國首次報道了應(yīng)用PRP治療薄型子宮內(nèi)膜的研究，之后PRP被用于輔助生殖技術(shù)中薄型子宮內(nèi)膜患者的干預(yù)治療，其可促進受損子宮內(nèi)膜的生長和發(fā)育，并改善妊娠結(jié)局，為臨床薄型子宮內(nèi)膜不孕的治療帶來新希望[6-8]?，F(xiàn)就PRP治療薄型子宮內(nèi)膜的研究進展予以綜述。

1 對薄型子宮內(nèi)膜的認識

1.1薄型子宮內(nèi)膜的病因及病理 薄型子宮內(nèi)膜的病因眾多、病理機制復(fù)雜，嚴重威脅女性生殖功能與心理健康。薄型子宮內(nèi)膜的病因分為機能性內(nèi)膜菲薄(口服避孕藥、來曲唑及氯米芬等)、器質(zhì)性內(nèi)膜菲薄(反復(fù)宮腔操作、子宮內(nèi)膜結(jié)核、子宮動脈栓塞術(shù)等)以及原因不明的內(nèi)膜菲薄[9]。而重度炎癥反應(yīng)或子宮基層受損會形成難治性薄型子宮內(nèi)膜[10]。其中，反復(fù)宮腔操作是薄型子宮內(nèi)膜發(fā)生發(fā)展的主要原因，因此減少人工流產(chǎn)等宮腔操作可作為減少薄型子宮內(nèi)膜發(fā)生的預(yù)防手段。薄型子宮內(nèi)膜病理生理機制表現(xiàn)為血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)表達水平降低、子宮內(nèi)膜纖維化水平增加、宮腔粘連、間質(zhì)減少以及子宮動脈高血流阻抗等[11]。此外，薄型子宮內(nèi)膜的厚度還會限制胚胎著床，使胚胎植入靠近基層的螺旋動脈，此處產(chǎn)生的活性氧對胚胎的著床及發(fā)育有負性作用，使臨床妊娠率及活產(chǎn)率下降[12]。

1.2薄型子宮內(nèi)膜的新型治療方法 薄型子宮內(nèi)膜的一般治療主要包括激素(雌二醇、人絨毛膜促性腺激素、他莫昔芬、生長激素等)治療、改善子宮內(nèi)膜血流(阿司匹林、西地那非、己酮可可堿以及神經(jīng)肌肉電刺激等)治療、干細胞治療以及粒細胞集落刺激因子治療等[13-14]。不同治療方法對薄型子宮內(nèi)膜的治療具有針對性和選擇性，療效突出。近年，一種多功能微環(huán)境保護的外來體水凝膠被證實具有促進子宮內(nèi)膜微環(huán)境再生、抑制局部組織纖維化、促進新血管形成和組織再生的作用，能夠促進子宮內(nèi)膜生長和生殖力恢復(fù)[15]。此外，日本一項體外培養(yǎng)子宮內(nèi)膜的研究發(fā)現(xiàn)，將解凍的子宮內(nèi)膜上皮細胞和患者子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞共培養(yǎng)，可成功建立子宮內(nèi)膜三維模型[16]，這對體外植入治療薄型子宮內(nèi)膜的發(fā)展具有重要意義。薄型子宮內(nèi)膜的治療方法不斷完善，但不同治療方法的臨床療效尚不一致。如目前外源性雌激素治療應(yīng)用最廣泛，但其可能影響子宮內(nèi)膜癌的發(fā)展[17]。干細胞治療是一種新興的治療手段，但其規(guī)范使用仍需要進一步大樣本量研究的探索和明確；其他治療方法的有效性也需要大量試驗證據(jù)的支持。因此，探索治療薄型子宮內(nèi)膜新療法成為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的重要課題。

2 PRP

PRP是一種富含血小板的血漿制劑，Hood等[18]于1993年首次提出PRP的概念，發(fā)現(xiàn)血小板含量較自身全血高3倍以上。血小板包含致密顆粒、α顆粒和溶酶體3種類型的顆粒，其中溶酶體含有許多蛋白水解酶，致密顆粒含有凝血酶原因子，α顆粒含有高含量的生長因子，包括血小板衍生生長因子、成纖維細胞生長因子、胰島素樣生長因子1、胰島素樣生長因子2、VEGF、表皮生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子、結(jié)締組織生長因子等。當(dāng)血小板被激活后，α顆粒釋放的生長因子可協(xié)同作用于靶細胞，促進細胞的增殖、遷移和組織再生[19]。近年來，PRP促進組織再生的作用已在多學(xué)科應(yīng)用，如口腔科、骨科、頜面外科、眼科和神經(jīng)外科等[20-24]。PRP的多重優(yōu)勢引起了國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注，其在薄型子宮內(nèi)膜的治療中具有獨特優(yōu)勢。

3 PRP治療薄型子宮內(nèi)膜的作用機制

3.1促細胞增殖 生長因子屬于細胞因子，主要作用是刺激細胞生長活性。PRP含有高濃度的生長因子，其中血小板衍生生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子-β、表皮生長因子、成纖維細胞生長因子和VEGF均在子宮內(nèi)膜細胞增殖和分化的調(diào)節(jié)中起作用[25-27]。PRP促進子宮內(nèi)膜細胞生長的過程可概括為通過激活細胞膜表面的信號通路促進細胞有絲分裂，使子宮內(nèi)膜功能層上皮細胞增生、腺上皮數(shù)量增多，同時螺旋動脈增生擴張，從而促進子宮內(nèi)膜細胞生長。PRP中含有的表皮生長因子還可介導(dǎo)雌激素促進子宮內(nèi)膜上皮細胞增殖的作用，從而調(diào)控子宮內(nèi)膜的增殖[28]。Jang等[29]將60只大鼠隨機分為空白組(正常大鼠)、乙醇組(乙醇誘導(dǎo)的子宮內(nèi)膜損傷型模型大鼠)和PRP治療組(經(jīng)PRP治療的子宮內(nèi)膜損傷組大鼠)進行實驗研究，結(jié)果顯示，與乙醇組相比，PRP治療組大鼠Ki-67表達水平升高，表明子宮內(nèi)膜細胞增殖；此外，PRP治療組細胞角蛋白(上皮細胞的標志)染色強度明顯高于乙醇組，且主要位于腺體和柱狀上皮層的上皮細胞中，表明PRP通過加速誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜上皮的分化促進子宮內(nèi)膜細胞生長。PRP中多種生長因子的協(xié)同作用能夠促進子宮內(nèi)膜細胞增殖、加速受損子宮內(nèi)膜生長、改善子宮內(nèi)膜容受性。

3.2改善子宮內(nèi)膜容受性 子宮內(nèi)膜容受性是制約胚胎種植成功的關(guān)鍵，也是目前生殖領(lǐng)域的研究熱點之一。子宮內(nèi)膜的厚度與子宮內(nèi)膜容受性息息相關(guān)。子宮內(nèi)膜容受性為子宮內(nèi)膜允許囊胚定位、黏附、植入并最終著床的能力，子宮內(nèi)膜容受性受到多個生物分子的精準調(diào)控[30]。HOXA10是代表子宮內(nèi)膜容受性狀態(tài)的重要標志之一，是參與調(diào)節(jié)月經(jīng)周期期間子宮內(nèi)膜功能和發(fā)育的重要轉(zhuǎn)錄因子。研究顯示，PRP可上調(diào)薄型子宮內(nèi)膜患者HOXA10的表達，從而改善子宮內(nèi)膜容受性[29]。子宮內(nèi)膜細胞中相關(guān)調(diào)節(jié)基因的表達也是影響子宮內(nèi)膜容受性和胚胎著床的重要因素，研究表明，PRP可誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜細胞中相關(guān)調(diào)節(jié)基因的表達，提高子宮內(nèi)膜容受性[31]。此外，血小板顆粒中的抗菌藥物可能對干擾胚胎黏附和著床的沉默病原體起作用，從而改善子宮內(nèi)膜容受性[32]。上述研究結(jié)果為PRP改善子宮內(nèi)膜容受性提供了科學(xué)依據(jù)，體現(xiàn)出PRP治療薄型子宮內(nèi)膜的有效性。

3.3促血管形成 薄型子宮內(nèi)膜的血管狀態(tài)不佳、血供不足，嚴重影響子宮內(nèi)膜生長。薄型子宮內(nèi)膜的病理表現(xiàn)為子宮血管橈動脈的高血流阻抗、上皮生長不良、VEGF表達降低以及血管發(fā)育不良[9]。改善子宮內(nèi)膜血流狀態(tài)一直是治療薄型子宮內(nèi)膜的重要方向之一。PRP中含有高濃度的生長因子，VEGF作為子宮內(nèi)膜容受性標志分子之一，在血管生成和調(diào)節(jié)中起核心作用，其還可通過調(diào)節(jié)血管通透性來表達和優(yōu)化胚泡植入[12]。在血小板形成過程中，可從培養(yǎng)基中積累大量鞘氨醇-1-磷酸、磷脂酸等，而上述物質(zhì)對內(nèi)皮細胞有趨化和抗凋亡作用，可促進毛細血管樣結(jié)構(gòu)的形成。鞘氨醇作為內(nèi)皮分化基因受體的配體，參與血管生成，VEGF受體2的表達升高使內(nèi)皮細胞對VEGF更敏感，內(nèi)皮細胞由此開始血管生成過程[20]。

生長因子的優(yōu)勢顯著，但需要通過基因工程等獲得，成本較高，且程序復(fù)雜。而PRP由自體血漿經(jīng)離心獲得，成本低，VEGF等生長因子含量高，能夠較好地替代生長因子，在促血管生成方面具有顯著的優(yōu)越性。劉科鵬等[33]選取127例反復(fù)種植失敗(repeated implantation failure，RIF)患者(經(jīng)3次以上胚胎移植仍未受孕)，隨機分為PRP組(采取激素周期治療+宮腔灌注PRP)和對照組(僅采取激素周期治療)，結(jié)果顯示，與對照組相比，PRP組的子宮內(nèi)膜厚度、化學(xué)妊娠率、臨床妊娠率較高，且子宮動脈搏動指數(shù)和子宮動脈阻力指數(shù)較低，提示PRP可改善子宮內(nèi)膜血流、增加供血、提高子宮內(nèi)膜容受性，從而改善妊娠結(jié)局。

3.4抗炎 子宮內(nèi)膜受到損傷時，炎癥聯(lián)級反應(yīng)發(fā)生。在胚胎植入窗口期，子宮內(nèi)膜發(fā)生從輔助性T細胞(helper T cell，Th細胞)1促炎環(huán)境到Th2細胞抗炎環(huán)境的免疫轉(zhuǎn)換，建立母體耐受性，子宮自然殺傷細胞參與Th2細胞免疫過程并發(fā)揮作用。而在薄型子宮內(nèi)膜患者中，存在Th1/Th2轉(zhuǎn)換失衡，子宮自然殺傷細胞被高度激活，Th1細胞促炎條件被誘導(dǎo)，局部產(chǎn)生炎癥因子(如γ干擾素)，使子宮內(nèi)膜殺傷細胞具有細胞毒性，導(dǎo)致子宮內(nèi)膜容受能力降低[34]，即薄型子宮內(nèi)膜中存在炎癥反應(yīng)。宮腔操作會損傷子宮內(nèi)膜，導(dǎo)致宮腔粘連，又稱Asherman綜合征。炎癥不僅損傷子宮內(nèi)膜，還會阻礙子宮內(nèi)膜的再生，形成薄型子宮內(nèi)膜。加拿大生殖與男科學(xué)會臨床實踐指南委員會編寫的《2019臨床實踐指南——輔助生殖中薄型子宮內(nèi)膜的管理》中提到，PRP可以治療因Asherman綜合征造成的薄型子宮內(nèi)膜[35]。PRP富含大量抗菌蛋白，如抗菌結(jié)締組織激活肽3、血小板因子4、調(diào)節(jié)激活正常T細胞因子等，這些蛋白作用于細菌細胞膜，導(dǎo)致蛋白質(zhì)合成受阻，其還可靶向作用于細胞內(nèi)蛋白質(zhì)，從而干擾DNA合成或抑制酶活性[20]。另外，PRP中含有胰島素樣生長因子1，其具有抗炎作用，可抑制損傷子宮內(nèi)膜中炎癥因子的釋放、纖維性瘢痕的形成以及過度的炎癥反應(yīng)，胰島素樣生長因子1表達可激活核因子κB途徑亞單位p50，介導(dǎo)白細胞介素-10的產(chǎn)生和表達，從而促進損傷子宮內(nèi)膜的再生[36]。Kim等[37]發(fā)現(xiàn)，Asherman綜合征雌鼠子宮腔狹窄、間質(zhì)減少、柱狀上皮萎縮，并伴有退行性改變，經(jīng)PRP治療后可觀察到增生的腺體和子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞；同時，PRP治療組雌鼠的3種纖維化相關(guān)因子(Ⅰ型膠原α1鏈、轉(zhuǎn)化生長因子-β1和組織金屬蛋白酶抑制物1)表達水平均明顯低于未治療組。另有研究表明，PRP可減緩受損子宮內(nèi)膜的纖維化進展，降低白細胞介素-1β的表達[29]。宮腔灌注PRP后，子宮內(nèi)膜的纖維化水平或趨向水平大大降低，炎癥環(huán)境改善，子宮內(nèi)膜狀態(tài)得到正性恢復(fù)，這為胚胎的植入著床等創(chuàng)造了良好的條件。

3.5促進細胞遷移 干細胞具有較強的自我更新和增殖分化能力，可促進子宮內(nèi)膜的再生修復(fù)[38]。子宮內(nèi)膜間充質(zhì)干細胞(endometrial mesenchymal stem cells，EnMSCs)存在于人月經(jīng)血中，在維持子宮內(nèi)膜的組織穩(wěn)態(tài)中起重要作用，參與細胞外基質(zhì)重塑、血管生成、細胞間通訊、月經(jīng)后組織修復(fù)。子宮內(nèi)膜對滋養(yǎng)層的入侵敏感，而細胞外基質(zhì)重塑是這一過程的標志，提示子宮內(nèi)膜容受性良好[39]。雌激素受體α與雌激素作用可促進通路中相關(guān)因子的轉(zhuǎn)錄和子宮內(nèi)膜生長發(fā)育[40]。EnMSCs可上調(diào)雌激素受體，從而促進受損子宮內(nèi)膜的生長[41]。然而，干細胞療法程序復(fù)雜、成本昂貴，如骨髓活檢和細胞儲存，臨床尚未廣泛推廣。研究表明，EnMSCs對生長因子的作用高度敏感，而PRP含有大量生長因子，可直接促進EnMSCs的增殖和遷移，并通過增強自噬水平促進間充質(zhì)干細胞的自我更新[42]，從而擴大間充質(zhì)干細胞對子宮內(nèi)膜的諸多正性作用。

4 PRP新的研究方向

4.1PRP注入宮腔部位 目前，PRP治療薄型子宮內(nèi)膜的相關(guān)試驗多采取直接注入宮腔內(nèi)進行干預(yù)[6-8]。Agarwal等[43]采取一種新型注入方式——在宮腔鏡引導(dǎo)下，將PRP注入子宮四壁的內(nèi)膜下區(qū)域，即子宮內(nèi)膜-肌層交界區(qū)(endometrial-myometrial interface，EMI)。PRP治療可改善因子宮內(nèi)膜過薄而無法行胚胎移植患者的子宮內(nèi)膜厚度，提高其妊娠率。EMI指由子宮肌層內(nèi)側(cè)1/3構(gòu)成的厚約5 mm的區(qū)域，由Hricak等[44]于1983年首次提出。正常EMI具有調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜生長分化的作用，可使子宮內(nèi)膜從基底層向功能層方向生長，對防治子宮腺肌病有重要意義。當(dāng)EMI被破壞后，子宮內(nèi)膜腺體及基質(zhì)向下生長，深入子宮肌層，異位子宮內(nèi)膜增生，從而導(dǎo)致子宮腺肌病的發(fā)生發(fā)展[45]。因此，PRP灌注EMI可能造成的微損傷與子宮腺肌病發(fā)展的關(guān)系以及PRP宮腔灌注與PRP灌注EMI作用的差異均需進一步明確。

4.2影響PRP質(zhì)量的因素 在PRP制備過程中，PRP的質(zhì)量受到轉(zhuǎn)速、離心力、離心時間、抗凝劑和激活劑、PRP供體社會特征、PRP保存條件的影響[20]。楊耀等[46]比較成人外周靜脈血及新生兒臍靜脈血衍生的PRP對人子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞生長增殖的影響，并分別設(shè)置不同濃度(3%、6%、9%、12%)的PRP，結(jié)果顯示，外周靜脈血-PRP促細胞增殖效力均低于臍靜脈血-PRP，其中12%外周靜脈血-PRP及9%臍靜脈血-PRP的促增殖效力最強，表明與外周靜脈血相比，臍靜脈血更適合作為PRP的有效供體來源，對子宮內(nèi)膜發(fā)揮更大的潛力作用；此外，在活化的各組分新生兒臍靜脈血PRP中，9%活化臍靜脈血-PRP的促增殖效力略高于12%活化臍靜脈血-PRP，即存在“最佳濃度PRP”。另有研究表明，40%(v/v)濃度PRP有利于K9骨髓間充質(zhì)干細胞的細胞活力，但80%～100%(v/v)濃度的效果相反[47]，可見確定“最佳PRP濃度”可使PRP效果最大化。

4.3PRP對正常子宮內(nèi)膜的作用 由于PRP具有成本低、易提取、無創(chuàng)、安全性高等優(yōu)點，其在RIF中的應(yīng)用受到廣泛關(guān)注[32,48]。試驗大多選取子宮內(nèi)膜發(fā)育不良的RIF患者，經(jīng)PRP治療后，臨床妊娠率、活產(chǎn)率均升高。但部分RIF患者子宮內(nèi)膜厚度正常(≥7 mm)，研究表明，經(jīng)宮內(nèi)輸注PRP治療的子宮內(nèi)膜厚度正常(≥7 mm)RIF患者的生化、臨床或持續(xù)妊娠率并沒有提高[49]，這與PRP治療薄型子宮內(nèi)膜的正性作用截然不同，故PRP作用于子宮內(nèi)膜的機制仍需深入探索。

5 小 結(jié)

隨著不孕癥患病率逐年增加，人們對不孕癥的重視程度逐漸升高。薄型子宮內(nèi)膜是不孕癥的重要病因，其具體發(fā)病機制至今尚不清楚，臨床治療手段有限，治療效果也不理想，而PRP療法給薄型子宮內(nèi)膜所致不孕癥的治療帶來了希望。PRP可通過促進細胞增殖和遷移、改善血管及抗炎機制，提高子宮內(nèi)膜容受性，促進子宮內(nèi)膜再生，在治療薄型子宮內(nèi)膜不孕癥中表現(xiàn)出明顯優(yōu)勢。但是PRP質(zhì)量的影響因素眾多，目前婦科領(lǐng)域中PRP的相關(guān)研究較少，故仍需要進行長期大量隨機對照試驗，以規(guī)范PRP的使用，提高其治療有效性，從而更好地應(yīng)用于臨床薄型子宮內(nèi)膜不孕癥的治療。