m6A在前列腺癌中的作用研究進(jìn)展

張宏宇，張宇曦，孔垂?jié)?/p>

(中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院泌尿外科，遼寧沈陽(yáng) 110001)

前列腺癌(prostate cancer，PCa)是男性泌尿生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，在全球惡性腫瘤死因排行榜中位列第5[1]，是美國(guó)男性惡性腫瘤的第2大死亡原因[2]。在亞洲國(guó)家，PCa患者的數(shù)量也呈逐年上升的趨勢(shì)，并有研究發(fā)現(xiàn)，PCa的患病風(fēng)險(xiǎn)可能與人口老齡化有關(guān)[3]。N6-甲基腺嘌呤(N6-methyladenosine，m6A)是RNA的一種修飾形式，參與PCa的發(fā)生發(fā)展過程。但m6A甲基化修飾在PCa中的作用機(jī)制尚不明確，因此本文就m6A與PCa的最新研究進(jìn)展作一綜述。

1 m6A的概述

隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)了170多種RNA修飾形式[4]。其中m6A是真核生物中最常見的在腺苷酸第6位氮原子上發(fā)生的RNA修飾形式[5]，常見于信使RNA(mRNA)中[6]。m6A修飾常發(fā)生在RRACH(R=A/G,H=A/C/U)的特定序列中，主要出現(xiàn)在3′端非翻譯區(qū)(3′UTR)的終止密碼子附近和長(zhǎng)的外顯子內(nèi)[7]。m6A修飾由甲基轉(zhuǎn)移酶催化，被甲基化結(jié)合蛋白識(shí)別，通過去甲基化酶去除修飾，是一個(gè)動(dòng)態(tài)可逆的過程[5-6，8]。m6A修飾在RNA代謝的許多方面發(fā)揮著重要作用，影響mRNA的剪切、轉(zhuǎn)運(yùn)、翻譯和穩(wěn)定性，并參與各種生物過程[5，8]。

2 調(diào)控m6A甲基化修飾的機(jī)制

2.1 甲基轉(zhuǎn)移酶m6A甲基化修飾過程是由甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物催化的[9]，甲基轉(zhuǎn)移酶樣蛋白3(methyltransferase-like 3，METTL3)、甲基轉(zhuǎn)移酶樣蛋白14(methyltransferase-like 14，METTL14)和Wilms腫瘤1相關(guān)蛋白(Wilm’s tumor 1-associated protein，WTAP)是組成甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物的核心部分[10-11]。METTL3作為催化單元與METTL14緊密結(jié)合形成穩(wěn)定的異二聚體[9]，催化甲基轉(zhuǎn)移到腺苷上[12]。WTAP起橋梁作用，結(jié)合甲基轉(zhuǎn)移酶形成復(fù)合物[13]，使甲基基團(tuán)進(jìn)入RNA[8]，完成m6A甲基化過程。隨著研究的深入，甲基轉(zhuǎn)移酶樣蛋白16、病毒樣m6A甲基轉(zhuǎn)移酶相關(guān)蛋白(virlike m6A methyltransferase associated protein，VIRMA)、RNA 結(jié)合基序蛋白15、RNA 結(jié)合基序蛋白15B、鋅指CCCH域蛋白13、Cbl原癌基因E3泛素連接酶蛋白類似物1等甲基轉(zhuǎn)移酶蛋白被發(fā)現(xiàn)參與m6A的修飾過程[8-9，14-18]。轉(zhuǎn)錄因子鋅指蛋白217也參與甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物活性的調(diào)控[9]。

2.2 去甲基化酶去甲基化酶在去除m6A RNA上的甲基基團(tuán)過程中發(fā)揮作用，脂肪和肥胖相關(guān)蛋白(fat-mass and obesity associated protein，F(xiàn)TO)和ALKB同系物5(AlkB homolog 5，ALKBH5)是最常見的去甲基化酶[19-21]。FTO以m6A修飾的rRNA為底物，且對(duì)含有3-甲基尿嘧啶(3-meU)的單鏈RNA尤為敏感[22]，而ALKBH5主要催化去除mRNA的m6A修飾[23]。最近的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)另一種去甲基化酶——ALKB同系物3(AlkB homolog 3，ALKBH3)，不同于上述2種去甲基化酶，它主要對(duì)tRNA中的m6A位點(diǎn)發(fā)揮去甲基化酶的活性，而對(duì)mRNA和rRNA的敏感性較差[21]。

2.3 甲基化結(jié)合蛋白甲基化結(jié)合蛋白識(shí)別m6A修飾位點(diǎn)并與之結(jié)合發(fā)揮特定作用。我們最早發(fā)現(xiàn)的甲基化結(jié)合蛋白是YTH結(jié)構(gòu)域家族蛋白，包括YTHDF1(YTH domain-containing family protein 1)、YTHDF2(YTH domain-containing family protein 2)、YTHDF3(YTH domain-containing family protein 3)、YTHDC1(YTH domain-containing protein 1)和YTHDC2(YTH domain-containing protein 2)[24-25]，它們通過自身的“疏水口袋”和“芳香結(jié)構(gòu)”結(jié)合含有m6A的RNA[9]。YTHDF亞型蛋白與mRNA中的所有m6A位點(diǎn)結(jié)合，而YTHDC1則結(jié)合mRNA中的某些m6A位點(diǎn)以及核非編碼RNA(non-coding RNA,ncRNA)中的m6A位點(diǎn)，YTHDC2則與少數(shù)特定的m6A位點(diǎn)相結(jié)合，尤其是在ncRNA中[24]。當(dāng)前的研究證明，YTHDF亞型的蛋白主要位于細(xì)胞質(zhì)中[8]，而YTHDC亞型的蛋白主要在細(xì)胞核中發(fā)揮作用。YTHDF1能夠提高mRNA的翻譯效率[26]，YTHDF2則通過破壞mRNA的穩(wěn)定性促進(jìn)mRNA的降解[27]，而YTHDF3與YTHDF1和YTHDF2相互作用分別促進(jìn)mRNA的翻譯和衰變。YTHDC1能夠調(diào)控mRNA的表達(dá)水平，也可以影響mRNA的轉(zhuǎn)運(yùn)[8-9]。YTHDC2蛋白在細(xì)胞核內(nèi)外均可存在，可以選擇性地與ncRNA的m6A位點(diǎn)結(jié)合提高轉(zhuǎn)移相關(guān)因子HIF1α的表達(dá)[24]。隨著研究的深入，胰島素樣生長(zhǎng)因子2結(jié)合蛋白(Insulin-like growth factor 2 binding protein,IGF2BP)、真核起始因子3、不均一核糖核蛋白A2B1和不均一核糖核蛋白C作為甲基化結(jié)合蛋白也陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)[28]。

3 m6A甲基化修飾和PCa的關(guān)系

3.1 METTL3與PCa的關(guān)系通過對(duì)TCGA和GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)的研究分析，CAI[29]等發(fā)現(xiàn)，在人PCa細(xì)胞系(LNCaP、PC3、C4-2、C4-2B和DU-145)中，METTL3蛋白和m6A水平高于正常人前列腺上皮細(xì)胞(RWPE-1)。將METTL3基因敲除后能夠發(fā)現(xiàn)LNCaP和PC3細(xì)胞的增殖和存活被明顯抑制，同時(shí)其集落形成能力和侵襲性也受到明顯抑制。這些結(jié)果表明降低METTL3水平能夠抑制PCa細(xì)胞的增殖、存活、集落形成和侵襲，并且m6A水平也受到明顯抑制。過表達(dá)METTL3時(shí)，m6A水平和PCa細(xì)胞的作用出現(xiàn)一致的變化，表明METTL3對(duì)PCa細(xì)胞的作用依賴于m6A的催化活性。通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)METTL3能夠調(diào)節(jié)腫瘤的生長(zhǎng)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)METTL3耗盡后，GLI1(SHH-GLI信號(hào)通路重要組成部分)的表達(dá)水平下降，Sonic Hedgehog(SHH)信號(hào)通路下游靶點(diǎn)(如c-myc、cyclin D1)的mRNA水平受到明顯抑制，Bak和Bax(促凋亡)蛋白水平、PARP cleavage、caspase 3/7活性均升高，Bcl-2和Bcl-xL(抗凋亡)蛋白水平下降。這表明METTL3通過SHH-GLI信號(hào)通路調(diào)控PCa細(xì)胞凋亡。而且，SHH-GLI信號(hào)通路的激活與PCa的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，SHH-GLI信號(hào)通路的活性與耐藥性之間也存在一定的相關(guān)性。

有研究表明，METTL3通過增加MYC(c-myc) mRNA的m6A水平來(lái)增強(qiáng)MYC的表達(dá)，從而導(dǎo)致PCa的發(fā)生發(fā)展。過表達(dá)野生型METTL3可以顯著增加MYC蛋白的表達(dá)，而當(dāng)催化突變型METTL3過表達(dá)時(shí)，甲基化的MYC mRNA水平不受影響，說(shuō)明過表達(dá)催化突變型METTL3并不能促進(jìn)細(xì)胞的增殖和PCa的進(jìn)展，提示METTL3在PCa中的致癌作用依賴其甲基轉(zhuǎn)移酶的催化活性。分析顯示，MYC和METTL3蛋白水平呈正相關(guān)，METTL3高表達(dá)的樣本中MYC水平也較高，反之亦然。MYC過表達(dá)能夠挽救METTL3基因敲除對(duì)PCa細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的抑制作用，這些發(fā)現(xiàn)表明原癌基因MYC是METTL3介導(dǎo)m6A修飾調(diào)控的下游功能靶點(diǎn)[30]。

MA[31]等研究發(fā)現(xiàn)，淋巴樣增強(qiáng)結(jié)合因子1(lymphoid enhancer-binding factor 1，LEF1)在PCa組織中的表達(dá)也出現(xiàn)明顯上調(diào)，METTL3通過LEF1 mRNA m6A甲基化來(lái)調(diào)節(jié)LEF1的蛋白水平。IGF2BP2與m6A修飾的LEF1 mRNA結(jié)合，延長(zhǎng)LEF1 mRNA的半衰期，提高LEF1蛋白水平。METTL3通過m6A修飾的LEF1激活Wnt通路。LEF1/TCF蛋白與β-catenin相互作用激活Wnt通路及其下游基因，并通過激活Wnt通路來(lái)刺激細(xì)胞增殖和抑制分化。METTL3的敲除能夠降低Wnt通路的活性，但LEF1過表達(dá)可以部分逆轉(zhuǎn)因METTL3基因敲除而導(dǎo)致的Wnt通路活性下降?？偟膩?lái)說(shuō)，METTL3通過m6A甲基化作用于LEF1 mRNA，影響Wnt/β-catenin通路的活性，進(jìn)而促進(jìn)PCa的進(jìn)展。

最近的研究發(fā)現(xiàn)，在PCa組織中METTL3蛋白的表達(dá)明顯高于癌旁組織，并且在伴有骨轉(zhuǎn)移的PCa中表達(dá)最高。METTL3可能通過依賴m6A的方式調(diào)節(jié)整合素β1(integrin β1，ITGB1)、mRNA的穩(wěn)定性和/或翻譯來(lái)調(diào)控ITGB1蛋白的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)PCa細(xì)胞向Ⅰ型膠原的募集。此外，METTL3的過表達(dá)促進(jìn)了PCa細(xì)胞在富含膠原的環(huán)境中的存活和增殖，而其表達(dá)下調(diào)抑制了PCa細(xì)胞的增殖[32]。

綜上所述，針對(duì)SHH-GLI信號(hào)通路、MYC下游功能靶點(diǎn)、Wnt/β-catenin通路等相關(guān)靶點(diǎn)的治療方法，可能為PCa的治療提供新的方向。

3.2 FTO與PCa的關(guān)系有關(guān)基因多態(tài)性研究提示，F(xiàn)TO基因的多態(tài)性(SNPs)rs9930506和rs9939609與肥胖和PCa相關(guān)。FTO基因區(qū)SNP rs9930506與體重指數(shù)(body mass index,BMI)和肥胖相關(guān)，而肥胖與PCa侵襲性和死亡率的增加有關(guān)。突變的rs9939609與患PCa的風(fēng)險(xiǎn)呈負(fù)相關(guān)，與超重呈正相關(guān)，但在超重的病例中，rs9939609突變的患者患嚴(yán)重PCa的幾率更高。分析rs9939609與PCa風(fēng)險(xiǎn)和嚴(yán)重性之間的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，擁有至少一個(gè)“A”等位基因可以降低PCa風(fēng)險(xiǎn)和嚴(yán)重程度。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，過表達(dá)FTO會(huì)增加胚胎成纖維細(xì)胞中RUNX1T1轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，刺激脂肪細(xì)胞的數(shù)量導(dǎo)致肥胖，同時(shí)升高PCa的患病風(fēng)險(xiǎn)[33-34]。

3.3 YTHDF2與PCa的關(guān)系另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，與正常前列腺上皮細(xì)胞和組織相比，YTHDF2在人PCa細(xì)胞系(DU-145和PC3)和組織中高表達(dá)。YTHDF2通過結(jié)合m6A位點(diǎn)，使mRNA降解，從而降低mRNA m6A的整體水平，進(jìn)而促進(jìn)PCa的增殖和轉(zhuǎn)移。當(dāng)YTHDF2基因被敲除后，發(fā)現(xiàn)m6A的整體水平升高，并且PCa的增殖和轉(zhuǎn)移能力受到明顯抑制。這表明YTHDF2以依賴m6A的方式參與了PCa的發(fā)展進(jìn)程。miR-493-3p作為YTHDF2的直接上游因子，與YTHDF2表現(xiàn)出相反的作用，過表達(dá)miR-493-3p通過3′UTR抑制了YTHDF2的翻譯，使m6A水平上調(diào)，從而抑制PCa的增殖轉(zhuǎn)移。二者均參與了PCa中m6A的修飾，并以m6A的方式間接調(diào)控PCa的進(jìn)展。這說(shuō)明YTHDF2和miR-493-3p作為2個(gè)關(guān)鍵的m6A調(diào)控因子在調(diào)節(jié)PCa的過程中發(fā)揮重要作用[35]，可能成為PCa治療的一個(gè)潛在方向。

4 總結(jié)與展望

m6A甲基化修飾是由甲基轉(zhuǎn)移酶、去甲基化酶和甲基化結(jié)合蛋白共同作用完成的一種RNA修飾形式，參與RNA代謝、腫瘤發(fā)生發(fā)展等多種生物過程。在PCa中，METTL3蛋白以m6A依賴的方式促進(jìn)PCa細(xì)胞的增殖、存活、集落形成和侵襲能力，通過增強(qiáng)MYC的表達(dá)和Wnt通路的激活促進(jìn)PCa的發(fā)生發(fā)展，并通過SHH-GLI信號(hào)通路調(diào)控PCa細(xì)胞的凋亡。YTHDF2蛋白作為m6A的調(diào)控因子，以依賴m6A的方式促進(jìn)了PCa的發(fā)展。VIRMA和YTHDF3蛋白在晚期PCa患者中也出現(xiàn)明顯表達(dá)。因此，針對(duì)m6A甲基化修飾及其相關(guān)蛋白為靶點(diǎn)的治療方法可能成為PCa治療的一個(gè)潛在的新方向，所以需要進(jìn)一步去明確m6A甲基化修飾及其相關(guān)蛋白在PCa中的作用機(jī)制，以發(fā)現(xiàn)更有效的治療方法。