雞腸炎沙門氏菌研究進展

呂興幫，郝 賀，張 博，張永英，2，鐘翠紅通信作者

(1.河北工程大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，河北 邯鄲 056000；2.河北省禽病工程技術(shù)研究中心，河北 邯鄲 056000)

1 細菌病原學(xué)

沙門氏菌為腸桿菌科兼性厭氧菌，沙門菌屬可分為腸道沙門菌和邦戈爾沙門菌，到目前為止，已經(jīng)鑒定出2 500多個血清型。腸炎沙門氏菌屬腸道沙門菌亞種，可感染家禽，是家禽養(yǎng)殖中主要的病原菌，腸炎沙門氏菌也可感染人并造成食源性疾病傳播，其通常在食品加工過程中發(fā)生感染傳播，可粘附在冰箱、加工車床等固體表面，亦可感染蛋類和肉類食品，對公共健康造成嚴重威脅。家禽是腸炎沙門氏菌的天然感染對象，1周齡以下的雛雞表現(xiàn)為高致病性，感染的雛雞常表現(xiàn)出精神萎靡，食欲減少，排白色糞便，常有糊肛現(xiàn)象，急性感染可致雛雞死亡，發(fā)病雛雞心臟表現(xiàn)出不同程度的損傷，肝臟表現(xiàn)出點狀出血或者局部壞死，蛋雞感染后卵巢和卵泡也會損傷變形。然而，腸炎沙門氏菌很少引起1月齡以上的雞死亡，成年雞通常不表現(xiàn)臨床癥狀，雞的產(chǎn)蛋量也無明顯變化，但這種隱性感染雞只的肉制品或蛋制品會成為腸炎沙門氏菌的載體，通過食物鏈傳播使人感染，從而危害公共衛(wèi)生。

2 耐藥性發(fā)展

抗生素是畜禽生產(chǎn)中常用的治療藥物，然而，抗生素的長期使用導(dǎo)致了腸炎沙門氏菌的多重耐藥性。2010年Mezal等[1]從臨床樣本分離出32株腸炎沙門氏菌。32株臨床分離株中有10株對氨芐西林、氯霉素、慶大霉素、卡那霉素、萘啶酸、磺胺甲惡唑、鏈霉素和四環(huán)素敏感；有21株對氨芐西林和四環(huán)素耐藥；1株對萘啶酸耐藥。2019年Song Y等[2]從家禽養(yǎng)殖場采集了3 508份樣本，共檢出沙門氏菌126株，陽性率為3.59%。對95株沙門菌進行藥敏試驗、耐藥基因檢測和血清分型，得出腸炎血清型約占分離株的23.16%；95株菌株對紅霉素的耐藥率為100%，對四環(huán)素的耐藥率為68.42%，對鏈霉素和氨芐西林的耐藥率為53.68%；利用PCR檢測β-內(nèi)酰胺和硫磺酰胺的耐藥基因，發(fā)現(xiàn)sulII和aaC4的檢出率分別為52.63%和23.16%；2018年Zhou X等[3]從上海地區(qū)零售雞肉產(chǎn)品中分離的146株腸炎沙門氏菌進行了藥敏及耐藥基因分析，大約42%的分離株對13種抗菌素敏感，其中對氨芐西林、磺胺惡唑、四環(huán)素和強力霉素的耐藥率分別為50.70%、49.32%、17.12%和15.75%；20.55%的分離株對3種或3種以上的抗菌藥物耐藥；所有菌株均檢測到avrA、mgtC和sopE毒力基因，而bcfC和spvC基因分別為97.2%和92.4%。在相應(yīng)的耐藥菌株中檢測到鏈霉素(aadA)、β-內(nèi)酰胺(blaTEM、blaCMY、blaSHV、blaCTX)、四環(huán)素(tetAandtetB)、磺胺類(sulI、sulII、sulIII)耐藥相關(guān)基因。以上結(jié)果表明，畜禽養(yǎng)殖中雞腸炎沙門菌已對多種抗生素產(chǎn)生了耐藥性，其中對磺胺類藥物的耐藥性最為嚴重。

3 流行病學(xué)

腸炎沙門氏菌(SE)是近20年來人類食源性沙門氏菌病大流行的主要原因。自20世紀80年代中期以來，SE已成為食源性疾病暴發(fā)的主要病原菌。1985—1999年，美國由腸炎沙門氏菌引發(fā)的371例疾病中，298例與雞蛋有關(guān)[4]。2006年，歐洲聯(lián)盟通過歐洲監(jiān)測系統(tǒng)共報告了165 023例人類沙門氏菌感染病例，其中62.5%的病例被確定為SE感染[5]，在一些亞洲國家如韓國、日本，多數(shù)的食源性疾病發(fā)生也與雞蛋中的腸炎沙門菌有關(guān)[6]，我國于2016年在33 288枚雞蛋檢測出沙門菌的流行率約為0.5%，最主要的血清型仍以腸炎型為主[7]，由此可見，受污染的雞蛋是人類SE發(fā)病中最重要的感染載體。

腸炎沙門氏菌是目前唯一一種與雞蛋污染相關(guān)的可致人類疾病的沙門氏菌，這表明其對食品安全具有“獨特性”威脅[8]。雞蛋被沙門氏菌污染的途徑可能有兩種，第一種是在產(chǎn)卵期間或產(chǎn)卵后，從定植的腸道或受污染的糞便穿透蛋殼進行水平傳播。腸道感染途徑通常是沙門菌從母雞口中進入腸道，后侵入腸上皮細胞在腸道定植，隨后，巨噬細胞被吸引到入侵部位并包圍著沙門菌，最后沙門菌隨著巨噬細胞的遷移而進入內(nèi)部器官，盲腸、肝臟、脾臟和卵巢中均可分離到腸炎沙門菌[9]；蛋殼污染途徑是腸炎沙門菌在蛋殼和蛋殼膜附著，這種表面污染可能是母雞的陰道感染或糞便污染所造成的結(jié)果。第二種可能的途徑是來自帶菌母雞的垂直傳播，直接污染卵黃、卵黃膜、蛋白、殼膜和蛋殼，沉積在蛋白和卵黃膜上的沙門氏菌雖然在雞蛋內(nèi)部的抗菌環(huán)境中受到生長抑制，然而一旦它們穿透卵黃膜到達卵黃，便會在這種營養(yǎng)豐富的環(huán)境中廣泛生長[10]。

4 腸炎沙門氏菌的毒力基因及致病作用

4.1 毒力基因

許多毒力因子已被證實在沙門氏菌感染的發(fā)病機制中發(fā)揮多種作用。這些因子包括鞭毛、莢膜、質(zhì)粒、粘附系統(tǒng)及毒力島。沙門菌的毒力作用與其毒力島(SPI)密切相關(guān)，SPI是位于細菌細胞染色體特定區(qū)域的基因簇，負責(zé)編碼各種毒力因子。這些基因簇或SPI可以位于質(zhì)?；蛉旧w上，與周圍區(qū)域相比，它們往往具有可變的G/C組成，兩側(cè)有重復(fù)序列。SPI通常與轉(zhuǎn)移RNA(tRNA)和移動遺傳元件相關(guān)，它們的堿基組成往往與核心基因組完全不同[11]。

不同SPI在沙門氏菌的發(fā)病機制和毒力中起著不同的作用。目前，在沙門氏菌中已發(fā)現(xiàn)23個SPI，而SPI-1、SPI-2、SPI-3、SPI-4、SPI-5存在于所有腸炎沙門氏菌。腸炎沙門氏菌進入腸道后附著于腸上皮細胞和M細胞，SPI-1編碼的T3SS系統(tǒng)可形成針狀復(fù)合體與宿主細胞相連接，在針尖處經(jīng)SipB蛋白插入細胞膜，形成到達細胞內(nèi)部的通道[12]，T3SS的效應(yīng)體即可通過管道進入宿主細胞。SPI-1中的T3SS系統(tǒng)可分泌20余種效應(yīng)蛋白，其中SipA和SptP可結(jié)合肌動蛋白，通過影響膜褶邊形成和肌動蛋白細胞的骨架重排，提高沙門氏菌進入宿主細胞的效率。AvrA和Sptp蛋白可促進細胞內(nèi)的沙門氏菌復(fù)制，增加細菌的侵襲能力和易位[13]。當細菌穿過細胞膜時，可與胞膜結(jié)合形成囊泡結(jié)構(gòu)(SCV)，腸炎沙門氏菌在囊泡中表達SPI-2的效應(yīng)蛋白，隨SCV向細胞外周遷移，促進細胞內(nèi)復(fù)制和全身擴散[14]，在此期間，SpiA可持續(xù)存在，這有助于囊泡的維持并與SPI-2的效應(yīng)體發(fā)生協(xié)同作用。SPI-3基因參與MisL依賴的纖連蛋白結(jié)合的腸道定植和mgtCB編碼的高親和力鎂運輸?shù)募毎麅?nèi)生存對腸道疾病期是必需的，SPI-4編碼特定的Ⅰ性分泌系統(tǒng)，這與細菌的致病性有關(guān)，SPI-5與SP-1或SPI-2基因共同調(diào)控，參與腸黏膜液的分泌和炎癥因子的激活[15]。

4.2 腸炎沙門氏菌的致病作用

緊密連接蛋白(TJ)在腸道屏障功能中起著重要作用。TJ復(fù)合體的結(jié)構(gòu)和功能由幾種其他種類的蛋白組成，包括Occludin、JAM、ZO和MAGUK家族蛋白[16]，這些蛋白不僅有助于TJ的穩(wěn)定，而且有助于調(diào)節(jié)IEC之間的相互作用[17]。TJ結(jié)構(gòu)最重要的作用之一是為腔內(nèi)炎癥分子提供物理屏障，TJ屏障的完整性和結(jié)構(gòu)受損會導(dǎo)致不同組織中的免疫細胞被強行激活并導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的激活[18]。腸炎沙門氏菌對腸道的損傷作用主要是其對腸道屏障的破壞。當腸炎沙門菌進入腸道中，首先借助其粘附結(jié)構(gòu)(菌毛黏附素和非菌毛黏附素)在腸道中定植，之后侵入腸上皮細胞，釋放毒力因子損傷緊密連接結(jié)構(gòu)。Zhang等[19]通過建立小鼠鼠傷寒沙門菌感染模型觀察到感染小鼠中結(jié)腸上皮微絨毛有不同程度的損傷，緊密連接結(jié)構(gòu)受到破壞，免疫熒光法檢測緊密連接蛋白，發(fā)現(xiàn)ZO-1、Occludin和Claudin-1表達量均有顯著下降；另有Yu等[20]發(fā)現(xiàn)鼠傷寒沙門菌SL1344不僅可以影響緊密連接蛋白，還可以影響粘附連接蛋白E-cadherin的再分配和表達，這種再分配可能使腸道通透性增加，從而增加宿主對各種感染性和炎性疾病的易感性。

除了對腸道屏障造成損傷外，腸炎沙門氏菌本身及其產(chǎn)物也可被機體識別引起炎癥反應(yīng)。脂多糖(LPS)是沙門氏菌細胞壁的成分，也是機體炎癥激活的主要毒素。機體依靠吞噬細胞的Toll樣受體4(TLR4)對細菌LPS的識別，通過不同的作用機制來激活與炎癥相關(guān)進程，這也是激活吞噬細胞的初始信號[21]。在沙門氏菌最初感染時，吞噬細胞迅速在派爾集合淋巴結(jié)和腸系膜淋巴結(jié)內(nèi)積累，產(chǎn)生大量的細胞因子[22]，因此，巨噬細胞能夠感知宿主中細菌的存在，并向鄰近細胞發(fā)送信號，從而有助于激活宿主的防御[23]。巨噬細胞暴露于沙門氏菌下可增加多種細胞因子的mRNA表達和分泌，包括典型的促炎細胞因子IL-2、TNF-α和IL-6，以及幾種趨化因子MIP-1α、MIP-1β、MIP-2α、KC，這些細胞因子可以將吞噬細胞(如中性粒細胞、巨噬細胞)召集到感染部位，誘導(dǎo)機體的炎癥反應(yīng)進程[24]。

5 檢測方法

腸炎沙門氏菌與鼠傷寒沙門氏菌都是引起食源性疾病的病原菌，如何對兩者進行檢測及鑒別一直是眾多學(xué)者研究的焦點。傳統(tǒng)的血清學(xué)鑒定是常用的檢測方法，但血清價格昂貴，鑒定過程繁瑣，對檢測人員也有一定的專業(yè)基礎(chǔ)要求，在結(jié)果的分析中也存在一定的主觀性。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，許多腸炎沙門氏菌和鼠傷寒沙門氏菌的基因序列逐漸被了解，為從分子水平探討它們之間的本質(zhì)差別提供了方便[25]。熒光定量PCR已被證明是一種快速、簡便、靈敏的檢測沙門氏菌種類和各種沙門氏菌的分子技術(shù)。通過qPCR可在24 h內(nèi)表明檢測樣本是否為沙門氏菌陰性或陽性，而傳統(tǒng)培養(yǎng)的方法更加費力和耗時，需要48 h才能產(chǎn)生結(jié)果。通過qPCR早期檢測沙門氏菌陽性樣本有助于早期干預(yù)和防止受污染食品流入市場。

6 防控措施

家禽是腸炎沙門氏菌的主要感染對象，因此在畜禽養(yǎng)殖中防治腸炎沙門氏菌是重中之重。首先，在源頭上要建立無病原菌的種雞群；其次，要保證雞群良好的生活環(huán)境，同時也要不斷檢疫種雞群，并淘汰陽性雞。除了做好衛(wèi)生措施外，藥物治療也是養(yǎng)殖場必不可少的防治手段。過去，養(yǎng)殖場中的常用藥物以抗生素為主，在當今“限抗”的綠色發(fā)展背景下，一些新興藥物如微生態(tài)制劑及中草藥逐漸替代抗生素作為防治腸炎沙門氏菌的手段，除此之外，疫苗的接種在養(yǎng)殖中也被廣泛應(yīng)用。

6.1 中藥對腸炎沙門氏菌的防治

中藥具有多組分、多靶點和多作用的特點，其活性成分具有抗菌、抑菌活性，其毒副作用小，且不易產(chǎn)生耐藥性[26]。中藥配方制劑的應(yīng)用效果也顯示了作為替代或聯(lián)合抗生素在抗菌中的有效性和應(yīng)用前景[27-28]。Chang等[29]研究表明，中藥水提物對ST21的體外抑菌和殺菌活性較弱，只表現(xiàn)為MIC和MBC值的升高。然而，在體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)中藥預(yù)處理7 d和處理4 d后可顯著降低試驗小鼠糞便、血液和器官中的ST21數(shù)量。

6.2 微生態(tài)制劑對腸炎沙門氏菌的防治

益生菌作為抗生素的替代產(chǎn)品使用，已經(jīng)被廣泛研究，可在不改變腸道微生物結(jié)構(gòu)和功能的情況下，選擇性地減小腸炎沙門氏菌在雞腸道中的定植[30-32]。Shi等[33]通過體外試驗觀察到益生菌對腸炎沙門氏菌的抑制作用，經(jīng)羅伊氏菌S5 CFS處理后，25株沙門氏菌毒力、運動和粘附基因的表達顯著降低，運動能力顯著降低，還可抑制生物膜的形成和運動，破壞細菌結(jié)構(gòu)。

噬菌體也是近年來研究較多的微生態(tài)制劑，可特異性感染并裂解宿主病原菌，易于分離且綠色環(huán)保，目前在疾病預(yù)防中得到了廣泛的應(yīng)用。Wójcik等[34]在污染飼料中添加噬菌體BAFASAL?，發(fā)現(xiàn)可減少飼料中的沙門氏菌數(shù)量，而在體內(nèi)藥效研究表明，BAFASAL?可顯著降低腸炎沙門氏菌感染禽類的盲腸沙門氏菌含量。Ahmadi[35]在攻毒前對鵪鶉進行噬菌體灌胃，在口服沙門氏菌后，發(fā)現(xiàn)噬菌體可對體內(nèi)腸炎沙門氏菌有不同程度的降低。另外，通過氣溶膠噴霧消毒和口服接種噬菌體都可減少腸炎沙門氏菌對肉雞的感染。

6.3 疫苗對腸炎沙門氏菌的防護

疫苗免疫是家禽養(yǎng)殖業(yè)預(yù)防沙門菌病的一個有效措施，疫苗主要分為減毒活疫苗和滅活疫苗。減毒活疫苗可以通過供水口服給雞，使接種過程簡單，但它們只引起局部的腸道免疫反應(yīng)。相比之下，滅活疫苗可以通過注射接種，雖然這更耗時，但也更具有安全性[36]。朱悅[37]以自殺性質(zhì)粒pGMB152-△siC/Cm與腸炎沙門氏菌CZ14-1腸炎沙門氏菌結(jié)合轉(zhuǎn)移，通過對nmpc和rfal的基因敲除以構(gòu)建腸炎沙門氏菌的減毒疫苗應(yīng)用于攻毒保護試驗，發(fā)現(xiàn)減毒疫苗的免疫保護率達到80%和70%，腸道內(nèi)的載菌量也顯著下降。而國外學(xué)者Huberman[38]采用Sm24/Rif12/Ssq株的腸炎沙門氏菌減毒活疫苗對不同周齡的雞進行1～3次的接種，對雞攻毒后顯示，與未接種組相比，疫苗接種組的雞各臟器組織的載菌量均有不同程度的減少，而且隨著接種次數(shù)的增多，疫苗保護效果越好

7 結(jié)語

腸炎沙門氏菌在全球范圍內(nèi)廣泛傳播，對畜禽養(yǎng)殖造成巨大威脅。國內(nèi)外學(xué)者已經(jīng)對腸炎沙門氏菌進行了較為深入的研究，針對養(yǎng)殖中的腸炎沙門氏菌耐多藥問題，已有多種替抗藥物可供選擇，而中藥和微生態(tài)制劑是目前研究最廣泛的替抗產(chǎn)品，雖然兩者在臨床治療中起到了良好的抗菌作用，但其生產(chǎn)工藝仍須不斷完善和發(fā)展。疫苗也是養(yǎng)殖中防控腸炎沙門氏菌的有效手段之一，已有一些弱毒疫苗被研究并產(chǎn)生良好的保護效果，但到廣泛的臨床應(yīng)用仍須不斷探索，尤其是新型亞單位疫苗的研發(fā)。另外，生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展以及雞腸炎沙門氏菌基因組序列的公布都極大地促進了對雞腸炎沙門氏菌病原學(xué)、致病機制及檢測方法的深入研究，這為雞腸炎沙門氏菌的防控提供了科學(xué)的理論基礎(chǔ)。