退變髓核細(xì)胞修復(fù)及組織工程應(yīng)用研究進(jìn)展

陳中，鄭陽(yáng)，張信成，仇湘中，許輝

(1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，長(zhǎng)沙 410208； 2.湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院骨傷科，長(zhǎng)沙 410006)

腰腿痛是由椎間盤退變(intervertebral disc dege-neration，IDD)髓核突出壓迫或刺激周圍神經(jīng)引起的一種常見癥狀。隨著我國(guó)人口老齡化的加快，IDD的發(fā)病率也逐漸升高，腰腿痛已嚴(yán)重影響人們的生活質(zhì)量，造成致殘率升高和醫(yī)療成本增加[1]。髓核細(xì)胞來(lái)源于脊索細(xì)胞，在正常椎間盤與退變椎間盤內(nèi)，水、纖維膠原蛋白和蛋白聚糖水平因個(gè)體和年齡等因素而存在差異，髓核內(nèi)蛋白聚糖和水的含量最高，纖維膠原蛋白含量最低[2]。髓核細(xì)胞不可再生且具有重要功能，因此預(yù)防甚至逆轉(zhuǎn)髓核細(xì)胞退變顯得尤為重要。目前，針對(duì)IDD臨床主要通過(guò)外科手術(shù)減壓緩解臨床癥狀，雖然手術(shù)治療可取得良好療效，但會(huì)給患者帶來(lái)更大的身體創(chuàng)傷和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，且手術(shù)治療無(wú)法逆轉(zhuǎn)退變椎間盤的病理狀態(tài)，使其喪失自我修復(fù)機(jī)會(huì)，同時(shí)手術(shù)干預(yù)還會(huì)破壞椎體正常生物力學(xué)結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致鄰近節(jié)段IDD，這也是手術(shù)治療高復(fù)發(fā)率的原因之一[3]。隨著對(duì)髓核細(xì)胞退變機(jī)制研究的深入以及生物材料的不斷發(fā)展，應(yīng)用細(xì)胞技術(shù)和組織工程等方法修復(fù)退變髓核細(xì)胞越來(lái)越受到關(guān)注。現(xiàn)就退變髓核細(xì)胞修復(fù)及組織工程應(yīng)用的研究進(jìn)展予以綜述。

1 退變髓核組織的修復(fù)

目前髓核細(xì)胞退變的機(jī)制尚未完全闡明，Notch信號(hào)通路可能在髓核細(xì)胞退變過(guò)程中發(fā)揮重要作用，且可能與核因子κB、促分裂原活化的蛋白激酶、Wnt等經(jīng)典信號(hào)通路中的一個(gè)或兩個(gè)以上信號(hào)通路相互拮抗或協(xié)同作用。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明，在培養(yǎng)退變髓核細(xì)胞中加入部分生長(zhǎng)因子或抑制因子可促進(jìn)退變髓核細(xì)胞的修復(fù)并可抑制其退變進(jìn)程[4]。

1.1信號(hào)通路對(duì)髓核細(xì)胞的調(diào)控作用 Notch信號(hào)通路受體可直接將接收到的鄰近細(xì)胞組織信號(hào)傳遞至細(xì)胞核，并與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合激活Notch信號(hào)通路。有研究顯示，髓核內(nèi)長(zhǎng)期存在一個(gè)缺氧環(huán)境，缺氧誘導(dǎo)因子(hypoxia inducible factor，HIF)-1α和HIF-2α在髓核細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)，髓核細(xì)胞已適應(yīng)這種缺氧環(huán)境，當(dāng)髓核內(nèi)氧分壓低于5%時(shí)，細(xì)胞存活率最大[5]。Hirose等[6]研究發(fā)現(xiàn)，抑制髓核內(nèi)HIF-1的表達(dá)可間接抑制HES(hairy enhancer of split)/HEY(hairy/enhancer-of-split related with YRPW motif family members)樣轉(zhuǎn)錄因子和Notch信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)的激活因子JAG1(Jagged 1)等參與髓核細(xì)胞信息交換的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的表達(dá)。曹光彪等[7]通過(guò)檢測(cè)小鼠椎間盤中的Notch信號(hào)表達(dá)水平，篩選出DLL-1(一種人源重組蛋白)和JAG1表達(dá)變化最顯著的信號(hào)分子，而DLL-1、JAG1對(duì)軟骨細(xì)胞分化起負(fù)性調(diào)節(jié)作用。提示Notch信號(hào)通路可通過(guò)調(diào)控脊柱軟骨終板中軟骨細(xì)胞的增殖、分化修復(fù)退變的椎間盤。目前國(guó)內(nèi)尚無(wú)相關(guān)Notch信號(hào)在髓核細(xì)胞退變中的作用機(jī)制研究，但何坤[8]用γ-分泌酶抑制劑阻滯星形膠質(zhì)細(xì)胞Notch信號(hào)后發(fā)現(xiàn)，白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-1β、膠質(zhì)纖維酸性蛋白、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的表達(dá)均受到抑制，進(jìn)而影響細(xì)胞的增殖、凋亡。潘東晟等[9]研究發(fā)現(xiàn)，miR-21可激活退變髓核細(xì)胞中沉默的人第10號(hào)染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因，促進(jìn)磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K)和蛋白激酶B(protein kinase B，PKB/Akt)磷酸化，從而抑制退變的髓核細(xì)胞自噬。張晗祥等[10]利用病毒轉(zhuǎn)染人體退變髓核細(xì)胞中的基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1(stromal cell-derived factor-1，SDF-1)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，退變髓核細(xì)胞可分泌SDF-1，且血管內(nèi)皮細(xì)胞的活性和增殖水平均與SDF-1呈正相關(guān)；IDD時(shí)，髓核細(xì)胞內(nèi)的聚集蛋白聚糖減少，促進(jìn)血管和神經(jīng)纖維長(zhǎng)入髓核引起盤源性腰痛，但隨著髓核細(xì)胞退變程度的增加SDF-1水平也逐漸升高，更有利于血管、神經(jīng)的生長(zhǎng)，如此形成惡性循環(huán)。陳江等[11]用身痛逐瘀湯含藥血清干預(yù)靜水壓力建造退變髓核細(xì)胞模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)身痛逐瘀湯可上調(diào)磷酸化Akt的表達(dá)，抑制胱天蛋白酶-9、糖原合成酶激酶3β蛋白表達(dá)。提示身痛逐瘀湯可通過(guò)抑制PI3K/Akt信號(hào)通路中促凋亡因子的活化轉(zhuǎn)錄延緩人體髓核細(xì)胞退變。

以上研究表明，Notch通路通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的表達(dá)延緩髓核細(xì)胞退變、改善營(yíng)養(yǎng)途徑，從而補(bǔ)充髓核細(xì)胞數(shù)量。Notch2受體在老年段髓核組織中的表達(dá)顯著高于中年齡段的髓核組織[7]，也提示該信號(hào)通路可能嘗試自我修復(fù)。因此，可通過(guò)干預(yù)Notch通路、改善髓核細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)促進(jìn)髓核細(xì)胞的增殖、分化。

1.2生長(zhǎng)因子對(duì)髓核細(xì)胞的修復(fù)作用 各種合成代謝生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子均可改變椎間盤內(nèi)平衡，刺激細(xì)胞外基質(zhì)的合成。成骨蛋白1(osteogenicptotein 1，OP-1)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)均可促進(jìn)髓核細(xì)胞蛋白聚糖代謝[12-13]。Liu等[14]向兔椎間盤內(nèi)注射OP-1后發(fā)現(xiàn)，OP-1可促進(jìn)髓核細(xì)胞蛋白聚糖和膠原蛋白的分泌。Takegami等[15]用軟骨素誘導(dǎo)兔體外髓核細(xì)胞退變，將OP-1加入兔退變髓核細(xì)胞培養(yǎng)基中發(fā)現(xiàn)，兔髓核細(xì)胞蛋白聚糖可快速恢復(fù)至誘導(dǎo)前水平，且經(jīng)OP-1干預(yù)的正常兔髓核細(xì)胞蛋白聚糖表達(dá)增加。以上研究證實(shí)，OP-1可拮抗軟骨素誘導(dǎo)的兔髓核細(xì)胞分解代謝，同時(shí)OP-1也可促進(jìn)正常髓核細(xì)胞蛋白聚糖表達(dá)。

BMP家族和TGF-β超家族主要干預(yù)細(xì)胞增殖、分化進(jìn)程。研究發(fā)現(xiàn)，將TGF-β與生長(zhǎng)分化因子5(growth differentiation factor 5，GDF5)聯(lián)合作用于髓核工程樣細(xì)胞，可促進(jìn)豐富的聚集蛋白聚糖和富含Ⅱ型膠原的細(xì)胞外基質(zhì)分泌，且髓核工程樣細(xì)胞中的聚集蛋白聚糖和Ⅱ型膠原水平與正常髓核細(xì)胞相當(dāng)[16-17]。張象[18]研究發(fā)現(xiàn)，BMP-9可通過(guò)抑制髓核細(xì)胞Notch信號(hào)通路受體Notch1和配體DLL-1的表達(dá)，導(dǎo)致NICD-1(Notch1的活性分子)的表達(dá)減少，下調(diào)靶基因HES1和HES5表達(dá)，從而促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)分泌增加。魯花等[19]將BMP-9轉(zhuǎn)染入人髓核細(xì)胞內(nèi)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染腺病毒-BMP-9患者的磷酸化Akt和磷酸化哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白的表達(dá)均顯著高于正常對(duì)照者，而正常對(duì)照者的腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、IL-1β、IL-6和IL-8水平均顯著降低。還有研究證實(shí)，TGF-β3與BMP-2可協(xié)同誘導(dǎo)髓核間充質(zhì)干細(xì)胞向類髓核細(xì)胞分化[20-21]。TGF-β3與BMP-2聯(lián)合可顯著促進(jìn)BMP受體2的表達(dá)，同時(shí)TGF-β與BMP還可通過(guò)磷酸化分別激活Smad2/3和Smad1/5/8信號(hào)通路，此外，TGF-β與BMP協(xié)同還可同時(shí)激活Smad4[22]。

生長(zhǎng)因子是促進(jìn)髓核細(xì)胞自我修復(fù)的重要組成部分，其生物效應(yīng)與不同細(xì)胞類型、生物環(huán)境密切相關(guān)，如TGF-β作用于髓核細(xì)胞和髓核間充質(zhì)干細(xì)胞發(fā)揮不同的生物效應(yīng)。雖然OP-1、BMP-2、BMP-9、TGF-β等生長(zhǎng)因子可通過(guò)Notch、PI3K/Akt、Smad信號(hào)通路調(diào)控髓核細(xì)胞細(xì)胞外基質(zhì)的分泌和細(xì)胞的增殖凋亡、促進(jìn)髓核細(xì)胞的修復(fù)，但仍存在效率低、分化不穩(wěn)定等問(wèn)題，因此生長(zhǎng)因子與髓核細(xì)胞間的復(fù)雜作用仍需進(jìn)一步探究。

1.3抑制因子對(duì)髓核細(xì)胞的修復(fù)作用 某些不包含合成代謝抑制的藥劑正在被用于退變椎間盤的修復(fù)。胡凱[23]使用干擾小RNA沉默人體外髓核細(xì)胞去整合素-金屬蛋白酶5的表達(dá)，然后用環(huán)形針穿刺造模，8周后發(fā)現(xiàn)正常髓核細(xì)胞髓核組織完全消失，而被去整合素-金屬蛋白酶5沉默的髓核細(xì)胞則保持原有結(jié)構(gòu)。此外，將IL-1受體拮抗劑作用于體外退變、突出的人椎間盤組織，可導(dǎo)致基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)-3的表達(dá)降低[24]。經(jīng)IL-1受體拮抗劑預(yù)處理和IL-1處理的退變?nèi)怂韬思?xì)胞中的去整合素-金屬蛋白酶4和MMP-3的表達(dá)水平均降低[25]。此外，在人體椎間盤中，溶解性的TNF受體與IL-1α可協(xié)同上調(diào)蛋白聚糖的合成，但溶解性的TNF受體與TNF-α共處理會(huì)抑制一氧化氮和IL-6的產(chǎn)生，雖然顯性抑制TNF并不會(huì)激活TNF受體，但其可與TNF有效競(jìng)爭(zhēng)，當(dāng)顯性抑制TNF與椎間盤細(xì)胞的IL-β拮抗時(shí)，顯性抑制TNF可下調(diào)TNF-α、MMP-3、胱天蛋白酶3、前列腺素E2的表達(dá)[26-27]。目前TNF抑制劑已用于臨床坐骨神經(jīng)痛的治療，但受樣本量的影響，其有效性尚待驗(yàn)證[28]。p38促分裂原活化的蛋白激酶抑制因子可抑制MMP-3、IL-1的表達(dá)并可作為核因子κB的一種誘導(dǎo)劑，將p38促分裂原活化的蛋白激酶抑制因子應(yīng)用于椎間盤突出模型大鼠可減輕大鼠疼痛[29]。雖然大量抑制因子對(duì)椎間盤和周圍組織的影響已被廣泛研究，但受倫理學(xué)和安全性的限制，其長(zhǎng)期效應(yīng)問(wèn)題仍未解決。隨著未來(lái)對(duì)髓核細(xì)胞自噬研究的不斷深入，調(diào)節(jié)髓核細(xì)胞自噬可能成為延緩或逆轉(zhuǎn)IDD過(guò)程的有效方法。

2 組織工程在髓核組織修復(fù)中的應(yīng)用

髓核組織的組織工程與其他組織一樣，需要細(xì)胞、載體組織、生長(zhǎng)因子或生物信號(hào)的復(fù)合體，具體選擇則需要依賴于所要修復(fù)的組織。由于椎間盤組織始終處于壓力狀態(tài)，修復(fù)或置換后的組織也需接受機(jī)械應(yīng)力或信號(hào)。與修復(fù)纖維環(huán)相比，應(yīng)用組織工程修復(fù)髓核組織更值得關(guān)注，其原因主要在于髓核組織結(jié)構(gòu)較簡(jiǎn)單，且髓核退變發(fā)生較早，早期干預(yù)對(duì)延緩IDD意義重大。

2.1自體細(xì)胞移植研究 細(xì)胞移植治療髓核細(xì)胞退變具有巨大潛力和可行性。Meisel等[30]研究發(fā)現(xiàn)，將自體軟骨細(xì)胞經(jīng)12周體外培養(yǎng)移植到椎間盤切除節(jié)段，結(jié)果發(fā)現(xiàn)移植的椎間盤軟骨細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白聚糖含量經(jīng)番紅O-快速綠染色技術(shù)檢驗(yàn)與正常椎間盤組織相似，免疫組織化學(xué)也證實(shí)，在再生的椎間盤基質(zhì)中存在Ⅱ型和Ⅰ型膠原，且含量均高于正常椎間盤組織；此外，經(jīng)移植處理的椎間盤與周圍組織整合良好，同時(shí)患者疼痛程度顯著減輕。Nishimura和Mochida[31]將自體髓核細(xì)胞經(jīng)體外傳代后注入退變椎間盤中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)自體髓核細(xì)胞再注入可促進(jìn)椎間盤內(nèi)蛋白聚糖、膠原蛋白的合成，同時(shí)可維持椎間盤高度，延緩IDD進(jìn)程。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)是一類具有強(qiáng)大增殖能力的干細(xì)胞，與其他干細(xì)胞相比更易獲得，在體外培養(yǎng)12代后仍具有正常體型組和酶活性，且不會(huì)自動(dòng)分化[32]。張寧峰等[33]證實(shí)，采用BMSCs培養(yǎng)基培養(yǎng)退變髓核細(xì)胞可恢復(fù)其活性，并促進(jìn)蛋白聚糖信使RNA和蛋白以及MMP-3信使RNA和蛋白的表達(dá)。白亦光等[32]采用體外分離法培養(yǎng)髓核細(xì)胞和BMSCs，并用穿刺抽吸法建立兔IDD模型，造模同時(shí)行細(xì)胞移植治療，然后將36只5月齡日本大耳白兔隨機(jī)分為正常對(duì)照組、髓核細(xì)胞移植組、BMSCs移植組，結(jié)果發(fā)現(xiàn) BMSCs移植組和髓核細(xì)胞移植組Ⅱ型膠原、蛋白聚糖信使RNA相對(duì)表達(dá)水平均顯著高于正常對(duì)照組，而正常對(duì)照組、髓核細(xì)胞移植組和BMSCs移植組比較差異則無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。還有研究分別將胰島素樣生長(zhǎng)因子-1(insulin-like growth factor 1，IGF-1)、BMP-7、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、TGF-β加入BMSCs和髓核細(xì)胞培養(yǎng)基中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)IGF-1和TGF-β可抑制髓核細(xì)胞MMP-2的表達(dá)、減少細(xì)胞外基質(zhì)吸收，且兩者具有協(xié)同作用；同時(shí)，IGF-1和BMP-7還可促進(jìn)BMSCs向軟骨細(xì)胞分泌，增加髓核細(xì)胞和蛋白聚糖的表達(dá)，有利于恢復(fù)椎間盤高度，而堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子則可促進(jìn)BMSCs增殖[34-37]。TGF-β、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子和IGF-1等細(xì)胞因子不僅可促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的表達(dá)，還可促進(jìn)微血管的生長(zhǎng)[38-39]，但其遠(yuǎn)期療效仍有待研究驗(yàn)證。

細(xì)胞移植有助于延緩甚至逆轉(zhuǎn)髓核細(xì)胞退變進(jìn)程，但高成本、高難度以及椎間盤無(wú)血供、免疫保護(hù)環(huán)境等因素仍限制了其發(fā)展。雖然采用轉(zhuǎn)基因細(xì)胞定向分化已取得一定成果，但轉(zhuǎn)基因定向表達(dá)、轉(zhuǎn)染病毒的免疫性以及轉(zhuǎn)染方法等問(wèn)題尚未達(dá)成共識(shí)。

2.2細(xì)胞支架生物復(fù)合材料研究 采用合適的細(xì)胞支架生物復(fù)合材料不僅有利于細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖，還能減少細(xì)胞移植過(guò)程中的細(xì)胞流失。有研究顯示，良好的細(xì)胞支架復(fù)合材料不僅要與周圍鄰近椎體快速整合，還能恢復(fù)椎間盤正常高度、延緩椎間盤退變[40]。目前研究較多的細(xì)胞支架材料主要包括：①生物活性和相容性類似于髓核細(xì)胞外基質(zhì)的天然材料，如藻酸鹽類、瓊脂糖、膠原蛋白、硫酸軟骨素等，此類材料具有與鄰近椎體快速整合、細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖快等優(yōu)點(diǎn)[41]，但生物力學(xué)效應(yīng)差，不具備髓核的力學(xué)性能；②人工復(fù)合材料，如聚乳酸、聚羥基乙酸、共聚物和納米纖維復(fù)合材料等，這類材料力學(xué)特性較好，甚至優(yōu)于髓核細(xì)胞，但其生物毒性對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖的影響難以控制。王瑾等[42]采用不同膠原支架研究BMSCs的分化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Ⅰ型膠原、Ⅰ/Ⅱ型混合膠原、Ⅱ型膠原支架均可促進(jìn)髓核間充質(zhì)干細(xì)胞分化，其中Ⅱ型膠原支架促進(jìn)髓核間充質(zhì)干細(xì)胞向髓核細(xì)胞分化的能力更強(qiáng)。楊斐[43]以寡肽[Nap-F-F-Y(P)]為基本單位組裝成膠并復(fù)合硫酸軟骨素制成的超分子水凝膠在微觀結(jié)構(gòu)上與細(xì)胞外基質(zhì)近似，具有良好的黏彈性且生物相容度高，但這類材料對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)擴(kuò)增的影響還有待研究。夏金健[44]將聚己內(nèi)酯與聚乳酸-聚乙醇酸共聚物按不同比例混合作為細(xì)胞支架材料，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與單純使用某一類材料相比，混合材料在改善細(xì)胞增殖能力、活性以及細(xì)胞外基質(zhì)分泌方面更具優(yōu)勢(shì)。綜上，Ⅱ型膠原是髓核組織工程學(xué)用于細(xì)胞增殖的理想材料，未來(lái)可考慮將力學(xué)結(jié)構(gòu)良好的人工材料與Ⅱ型膠原按比例復(fù)合，制造出生物性質(zhì)與椎間盤髓核組織更相似的復(fù)合材料。

3 小 結(jié)

目前關(guān)于退變髓核細(xì)胞修復(fù)機(jī)制的研究雖已取得一定進(jìn)展，但確切的髓核細(xì)胞退變機(jī)制仍有待進(jìn)一步闡明。雖然退變髓核組織工程已廣泛應(yīng)用于臨床，但仍有許多問(wèn)題需要解決：①植入細(xì)胞、組織及整體椎間盤最佳治療方案尚未達(dá)成共識(shí)；②生物再生治療受患者病程的影響較大；③腰背痛的發(fā)病機(jī)制尚不明確；④促進(jìn)生物修復(fù)和椎間盤置換以及術(shù)后康復(fù)的最佳治療方案目前尚未明確。未來(lái)的研究應(yīng)著重于細(xì)胞支架復(fù)合材料、細(xì)胞移植來(lái)源、基因編程等不同方法的交叉互補(bǔ)，實(shí)現(xiàn)退變髓核細(xì)胞的生物學(xué)再生，為腰椎間盤突出患者提供最佳治療方案。