二甲雙胍聯(lián)合飲食干預(yù)對(duì)高脂飲食肥胖大鼠膝骨關(guān)節(jié)炎的影響

陳行堯 項(xiàng)佳 魯琛

骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是致殘率高的慢性骨關(guān)節(jié)病。目前對(duì)骨關(guān)節(jié)炎的確切病因仍不清楚，其主要的相關(guān)致病因素有：年齡，肥胖，創(chuàng)傷，關(guān)節(jié)負(fù)重改變，感染，基因突變等［1］。隨著人口老齡化及肥胖癥患者人數(shù)逐年增多，肥胖和老齡化成為了OA發(fā)生發(fā)展主要的致病因素［2］。二甲雙胍臨床應(yīng)用60余年，是全球應(yīng)用最廣泛的口服降糖藥之一，其具有良好的單藥/聯(lián)合治療降血糖作用。最近研究表明，二甲雙胍具有抗OA作用，主要表現(xiàn)為保護(hù)軟骨基質(zhì)的降解、抑制軟骨細(xì)胞的肥大分化、保持軟骨細(xì)胞的正常生理功能、阻止軟骨下骨的硬化及重塑［3］。并且，現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)飲食干預(yù)可以調(diào)節(jié)膝關(guān)節(jié)的代謝及其炎癥，從而起到改善膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎癥狀的作用［4］。目前，研究表明二甲雙胍和飲食干預(yù)都分別對(duì)OA具有一定的緩解作用，但兩者聯(lián)合干預(yù)對(duì)OA的影響未見報(bào)道。因此，本研究結(jié)合高脂高糖及Hulth法建立大鼠OA模型，并通過二甲雙胍聯(lián)合飲食干預(yù)探討對(duì)肥胖型OA大鼠氧化應(yīng)激及炎癥因子分泌的影響，揭示二甲雙胍聯(lián)合飲食干預(yù)對(duì)肥胖型OA的輔助治療作用，以期為臨床護(hù)理OA患者提供一定的治療方向。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 低溫高速離心機(jī)來自Thermo公司；電泳儀電泳槽，轉(zhuǎn)膜儀，化學(xué)發(fā)光儀均來自天能公司；全自動(dòng)脫水機(jī)，石蠟切片機(jī)，烤片臺(tái)，水浴缸，加熱石蠟包埋系統(tǒng)，正置熒光顯微鏡均來自Leica公司。BCA蛋白定量試劑盒（批號(hào)：KGP903），化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑，預(yù)染蛋白marker均來自Solarbio公司；蘇木素染液來自MDL公司；伊紅染液來自珠海貝索生物技術(shù)有限公司。二甲雙胍（貨號(hào)B1970）購(gòu)自美國(guó)APExBIO公司。水合氯醛（批號(hào)：MB4202）購(gòu)自大連美侖生物技術(shù)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 72只5周齡清潔級(jí)雄性SD大鼠，體質(zhì)量（170~180）g，購(gòu)買于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：［SCXK（滬）2017-0005］。保持溫度（22±2）℃，濕度50%~60%，在12 h晝夜節(jié)律的環(huán)境下自由飲水與進(jìn)食，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心飼養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號(hào)為 20210205。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法 （1）動(dòng)物分組及給藥：72只SD大鼠隨機(jī)選取分為6組：健康組、OA模型組、肥胖模型組、肥胖OA模型組、飲食干預(yù)組、飲食干預(yù)+二甲雙胍組，每組12只。除健康組及肥胖模型組外，其余各組采用改良Hulth法建立膝骨關(guān)節(jié)炎大鼠模型，大鼠腹腔注射3%戊巴比妥鈉（2 mL /kg），于大鼠左髕骨上方正中做一切口，切除內(nèi)側(cè)半月板及內(nèi)側(cè)副韌帶。術(shù)后連續(xù)3 d予青霉素20萬(wàn)單位肌內(nèi)注射以預(yù)防感染。術(shù)后1周，健康組及OA模型組給予常規(guī)飼料，肥胖模型組及肥胖OA模型組飼以高脂飼料（10%蛋黃、10%蔗糖、10%豬油、0.5%膽固醇）與糖水（10%蔗糖）；飲食干預(yù)組飼脫脂飼料與自來水；飲食干預(yù)+二甲雙胍組飼脫脂飼料與自來水的同時(shí)，給予二甲雙胍2 mg/kg灌胃，均連續(xù)干預(yù)3月。（2）一般生理學(xué)觀察：每天早晚觀察各組大鼠精神狀態(tài)、行為活動(dòng)狀態(tài)、毛發(fā)狀態(tài)。每日觀察各大鼠飲食飲水及排泄等情況。（3）大鼠的體質(zhì)量及BMI值的測(cè)定：飲食干預(yù)3個(gè)月后，稱重并量取體長(zhǎng)，計(jì)算體質(zhì)量指數(shù)（BMI），BMI=體質(zhì)量/身高的平方（kg/m2）。（4）大鼠自主活動(dòng)，抓力及疼痛閥值的測(cè)定：飲食干預(yù)結(jié)束后，應(yīng)用大鼠自主活動(dòng)程序儀測(cè)定大鼠的自發(fā)活動(dòng)并計(jì)數(shù)，當(dāng)計(jì)算機(jī)進(jìn)入測(cè)定程序后，將大鼠放入箱中自由活動(dòng)，每個(gè)活動(dòng)箱中1只，由計(jì)算機(jī)自動(dòng)記錄大鼠的活動(dòng)情況。實(shí)驗(yàn)時(shí)，把每只大鼠依次放入活動(dòng)箱內(nèi)，3 min適應(yīng)期后，記錄每只大鼠5 min內(nèi)的活動(dòng)次數(shù)；抓力測(cè)定則是在飲食干預(yù)及聯(lián)合二甲雙胍干預(yù)結(jié)束后用抓力測(cè)定儀對(duì)老鼠進(jìn)行抓力測(cè)試，多次測(cè)量，并記錄最大值。飲食干預(yù)3個(gè)月后，進(jìn)行大鼠疼痛閥值水平測(cè)量，使用Electric Von Frey電子測(cè)痛儀，大鼠足掌心部放置探頭，然后緩慢加壓至出現(xiàn)縮足或抬腿，為疼痛閾值表現(xiàn)。每只重復(fù)測(cè)量3次，每次間隔15 min，3次測(cè)量結(jié)果的平均值作為疼痛閾值。（5）ELISA法檢測(cè)大鼠關(guān)節(jié)液中炎癥因子的含量：各組大鼠以10%水合氯醛0.3 mL/100 g麻醉后，注射器吸取膝關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)液，用PBS按1∶9的比例稀釋后，2,000 r/min離心10 min，取上清液，-20℃保存待測(cè)。TNF-α、IL-1β、IL-6、MCP-1、SOD、MDA、GSHPx表達(dá)水平檢測(cè)，嚴(yán)格按照試劑盒操作說明進(jìn)行，最后在酶標(biāo)儀上檢測(cè)并分析其含量。（6）肥胖型OA大鼠TC、TG、LDL-C、HDL-C的含量測(cè)定：心臟采血后，使用3,500 r/min，離心機(jī)離心15 min后，分離出上層血清，保存待檢。用全自動(dòng)血生化儀對(duì)血樣的血生化指標(biāo)（TC、TG、HDL-C、LDL-C）進(jìn)行分析。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)Aggrecan、Collagan II水平。（7）HE法觀察肥胖型OA大鼠膝關(guān)節(jié)病理的改變：10%多聚甲醛固定膝關(guān)節(jié)標(biāo)本48 h，20% EDTA脫鈣4周。常規(guī)石蠟包埋、切片。石蠟切片60℃烤箱20 min，二甲苯 I、II、III各5 min，無水乙醇，95%、85%、75%乙醇各 3 min，水洗，蘇木素2 min，水洗，鹽酸乙醇分化5 s，水洗，1%氨水返藍(lán)30 s，伊紅2 min，水洗，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。切片于光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察。（8）WB法檢測(cè)肥胖OA大鼠膝關(guān)節(jié)中Nrf2、HO-1、NF-κB p65、IκBα蛋白表達(dá)：膝關(guān)節(jié)組織混合裂解液放入預(yù)冷的玻璃勻漿器中進(jìn)行研磨，提取膝關(guān)節(jié)總蛋白，并采用BCA法檢測(cè)蛋白濃度。取樣本蛋白30 μg于十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳中分離，隨后轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜上。10%脫脂奶粉封閉，隨后加入一抗Nrf2（1∶1,000）、HO-1（1∶2,000）、NF-κB p65（1∶1,000）、IκBα（1∶2,000）和β-actin（1∶10,000）稀釋液，4℃條件下過夜孵育，TBST洗膜后，加入二抗（1∶5,000）室溫孵育1 h后。ECL化學(xué)發(fā)光顯色、拍照，并進(jìn)行蛋白條帶灰度檢測(cè)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料多組間用One-way-ANOAY單因素方差分析，組間比較采用LSD或SNK分析。方差不齊者采用Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)。所有數(shù)據(jù)以（）表示，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般生理狀態(tài) 健康組大鼠生長(zhǎng)良好，精力旺盛，活動(dòng)頻繁，毛發(fā)順滑有光澤。肥胖OA模型組大鼠精神萎靡，活動(dòng)減少，毛發(fā)蓬松無光；飲食干預(yù)組和飲食干預(yù)+二甲雙胍組較肥胖OA模型組，活動(dòng)有一定程度的增加。

2.2 飲食干預(yù)聯(lián)合二甲雙胍對(duì)肥胖型OA大鼠體質(zhì)量及BMI的影響 各組大鼠體長(zhǎng)并無顯著區(qū)別，肥胖模型組大鼠體質(zhì)量相較于健康組有顯著增加（P＜0.01）。飲食干預(yù)組，飲食干預(yù)+二甲雙胍組大鼠與肥胖OA模型組比，體質(zhì)量和BMI值均顯著下降（P＜0.05）。見圖1。

圖1 各組大鼠的體質(zhì)量，體長(zhǎng)及BMI指數(shù)

2.3 飲食干預(yù)聯(lián)合二甲雙胍對(duì)肥胖型OA大鼠自主活動(dòng)，抓力，疼痛閾值的影響 與健康組大鼠相比，OA模型組，肥胖模型組及肥胖OA模型組大鼠的自主活動(dòng)次數(shù)，疼痛閥值和抓力均顯著下降（P＜0.05）。與肥胖OA模型組大鼠相比，飲食干預(yù)組和飲食干預(yù)+二甲雙胍組的自主活動(dòng)次數(shù)，抓力和疼痛閥值有顯著上升（P＜0.01），其中飲食干預(yù)+二甲雙胍組的上升趨勢(shì)更為突出。見圖2。

圖2 各組大鼠自主活動(dòng)次數(shù)，抓力及疼痛閥值的比較

2.4 飲食干預(yù)聯(lián)合二甲雙胍對(duì)肥胖型OA大鼠脂代謝和Aggrecan、Collagan II水平的影響 與健康組大鼠相比，OA模型組大鼠TC、TG、LDL-C、HDL-C的含量無顯著變化，Aggrecan、Collagan II水平則顯著下降（P＜0.01），肥胖模型組的TC、TG、LDL-C含量顯著上升（P＜0.01），HDL-C 含量顯著下降（P＜0.01），Aggrecan、Collagan II水平無明顯變化，肥胖OA模型組大鼠的TC、TG、LDL-C含量顯著上升（P＜0.01），HDL-C含量顯著下降（P＜0.01），Aggrecan、Collagan II水平也顯著下降（P＜0.01）。與肥胖OA模型組大鼠相比，飲食干預(yù)組，和飲食干預(yù)+二甲雙胍組的TC、TG、LDL-C含量顯著下降（P＜0.05），HDL-C 含量顯著上升（P＜0.01），Aggrecan、Collagan II水平顯著上升（P＜0.05）。見圖 3。

圖3 大鼠血清中TC、TG、LDL-C、HDL-C、Aggrecan及Collagan II的含量水平

2.5 飲食干預(yù)聯(lián)合二甲雙胍對(duì)肥胖型OA大鼠關(guān)節(jié)液TNF-α，IL-1β，IL-6，MCP-1含量水平的影響 與健康組大鼠相比較，OA模型組，肥胖模型組，肥胖OA模型組大鼠膝關(guān)節(jié)中的TNF-α，IL-1β，IL-6，MCP-1含量均有顯著升高（P＜0.01）；與肥胖OA模型組大鼠相比，飲食干預(yù)組，飲食干預(yù)+二甲雙胍組膝關(guān)節(jié)中TNF-α，IL-1β，IL-6，MCP-1的含量則均有明顯下降（P＜0.01）。見圖 4。

圖4 大鼠膝關(guān)節(jié)液中TNF-α，IL-1β，IL-6，MCP-1的含量

2.6 飲食干預(yù)聯(lián)合二甲雙胍對(duì)肥胖型OA大鼠膝關(guān)節(jié)液的SOD，MDA，GSH-Px含量水平的影響 與健康組相比較，OA模型組，肥胖模型組，肥胖OA模型組大鼠膝關(guān)節(jié)中的SOD，GSH-Px含量顯著下降（P＜0.01），MDA則顯著上升（P＜0.01）；與肥胖OA模型組大鼠相較，飲食干預(yù)組，飲食干預(yù)組+二甲雙胍組的大鼠膝關(guān)節(jié)中的大鼠膝關(guān)節(jié)中的SOD，GSH-Px含量顯著上升（P＜0.01），MDA 則顯著下降（P＜0.01）。見圖 5。

圖5 大鼠膝關(guān)節(jié)液中SOD，MDA，GSH-Px的含量

2.7 飲食干預(yù)聯(lián)合二甲雙胍對(duì)肥胖型OA大鼠膝關(guān)節(jié)病理的影響 健康組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞形態(tài)正常，排列緊密，軟骨層厚度適宜，無軟骨脫失現(xiàn)象，骨小梁結(jié)構(gòu)與形態(tài)緊密正常。與健康組相比，OA模型組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨表面明顯缺損，軟骨基質(zhì)降解、軟骨細(xì)胞丟失，蛋白聚糖降解，呈現(xiàn)典型OA退變。與OA模型組比較，肥胖模型組有輕微變化，肥胖OA模型組缺損最嚴(yán)重；與肥胖OA模型組比較，飲食干預(yù)組和飲食干預(yù)+二甲雙胍組有所緩解，飲食干預(yù)+二甲雙胍組比飲食干預(yù)組緩解更多。見圖6。

圖6 飲食干預(yù)聯(lián)合二甲雙胍對(duì)肥胖型OA大鼠膝關(guān)節(jié)病理的影響（HE染色×100）

2.8 飲食干預(yù)聯(lián)合二甲雙胍對(duì)肥胖型OA大鼠膝關(guān)節(jié)蛋白表達(dá)水平影響 與OA模型組相比，健康組膝關(guān)節(jié)組織中Nrf2、HO-1與IκBα蛋白的表達(dá)水平顯著上升（P＜0.05），NF-κB p65蛋白的表達(dá)水平顯著下降（P＜0.05），肥胖模型組膝關(guān)節(jié)組織中Nrf2、HO-1與IκBα蛋白的表達(dá)水平顯著下降（P＜0.05），NF-κB p65蛋白的表達(dá)水平無顯著變化（P＞0.05）；肥胖OA模型組膝關(guān)節(jié)組織中Nrf2、HO-1與IκBα蛋白的表達(dá)水平顯著下降（P＜0.05），NF-κB p65蛋白的表達(dá)水平顯著上升（P＜0.05）。與肥胖OA模型組相比，飲食干預(yù)組與飲食干預(yù)+二甲雙胍組Nrf2、HO-1與IκBα蛋白的表達(dá)水平顯著上升（P＜0.05），NF-κB p65蛋白的表達(dá)水平顯著下降（P＜0.05）。見圖7。

圖7 大鼠膝關(guān)節(jié)中Nrf2、HO-1、NF-κB p65、IκBα蛋白表達(dá)水平的比較

3 討論

OA是致殘率較高的慢性骨關(guān)節(jié)病，其中以膝骨關(guān)節(jié)炎（kneeosteoarthritis，KOA）的發(fā)病率最高。KOA是一種以關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)崩解、減少、骨贅形成、滑膜無菌性炎癥為特征的關(guān)節(jié)退行性疾病，其病變涉及整個(gè)滑膜關(guān)節(jié)，包括軟骨、滑膜和軟骨下骨［5］。流行病學(xué)調(diào)查表明，體質(zhì)量指數(shù)與KOA的發(fā)生發(fā)展具有顯著關(guān)系，同時(shí)，肥胖相關(guān)檢測(cè)指標(biāo)如血甘油三酯（triglyceride，TG）、總膽固醇（total cholesterol，TC）、低密度脂蛋白膽固醇（low density liptein cholesterol，LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（high density liptein cholesterol，HDL-C）可作為觀測(cè)KOA的重要指標(biāo)［6］。此外，研究表明炎性因子在KOA的疼痛發(fā)生過程中被認(rèn)為是重要影響因素。TNF-α、IL-1β、IL-6是目前研究最為成熟的三種促炎細(xì)胞因子，其中IL-1β在骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生發(fā)展過程中處于核心地位，進(jìn)一步促進(jìn)滑膜炎癥發(fā)展，滑膜壁增生，從而促進(jìn)KOA的進(jìn)展。TNF-α與IL-1β具有相似的生物學(xué)作用，并且在KOA的發(fā)病中與IL-1β起著協(xié)同作用［7-8］。再者，NF-κB是與炎癥因子產(chǎn)生、細(xì)胞增殖、細(xì)胞外基質(zhì)交聯(lián)和細(xì)胞凋亡密切相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，參與多種炎癥的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)［9］。同時(shí)，炎癥經(jīng)常伴隨著大量自由基的產(chǎn)生，自由基與不飽和脂肪酸相互作用后產(chǎn)生的脂質(zhì)過氧化物 MDA會(huì)使細(xì)胞膜流動(dòng)性降低、通透性增加，膜功能受損［10］。SOD和GSH-Px則是人體內(nèi)維持氧化還原平衡的一類重要的酶，其能夠有效地抵抗氧化作用，防御氧化應(yīng)激損傷。Nrf2則可以調(diào)節(jié)抗氧化劑蛋白的表達(dá)，從而防止因炎癥引起的氧化損傷，當(dāng)有氧化應(yīng)激因素存在時(shí)，Nrf2的表達(dá)增加，在氧化應(yīng)激因素消除后，Nrf2表達(dá)逐漸恢復(fù)。有效降低OA炎癥因子的含量并減少氧化應(yīng)激損傷，可改善KOA的發(fā)展［11］。二甲雙胍作為安全，有效的口服降糖藥之一，因具有良好的降糖效果及其減輕體質(zhì)量和其他心血管危險(xiǎn)因素的特點(diǎn)，成為眾多糖尿病指南推薦的T2DM一線治療藥物［12］。隨著更多臨床應(yīng)用數(shù)據(jù)的獲得，表明二甲雙胍具有廣泛的藥理作用，如調(diào)血脂、治療多囊卵巢綜合征和非酒精性脂肪肝等［13］?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍除了可以抑制膽固醇的生物合成和貯存，從而降低TG、TC水平［14］，還對(duì)OA具有雙重保護(hù)作用。OA早期，二甲雙胍能延緩軟骨細(xì)胞老化。OA晚期，二甲雙胍能促進(jìn)軟骨細(xì)胞自噬，避免OA病程的進(jìn)展［15］。

本研究結(jié)果表明，飲食干預(yù)及飲食干預(yù)聯(lián)合二甲雙胍可顯著降低大鼠血脂指標(biāo)，膝關(guān)節(jié)中炎癥因子TNF-α，IL-1β，IL-6，MCP-1，MDA的含量，并上調(diào)膝關(guān)節(jié)中SOD，GSH-Px含量。此外，飲食干預(yù)聯(lián)合二甲雙胍顯著促進(jìn)膝關(guān)節(jié)中Nrf2、HO-1與IκBα的蛋白表達(dá)，而抑制NF-κB p65蛋白表達(dá)水平。綜上所述，飲食干預(yù)聯(lián)合二甲雙胍可能通過改善炎癥，減輕肥胖程度，從而改善高脂飲食介導(dǎo)的膝骨關(guān)節(jié)炎。