香蕉細(xì)菌性軟腐病防控藥劑篩選及田間應(yīng)用效果評價(jià)

番華彩，曾 莉，李衛(wèi)雁，丁云秀，郭志祥，李 舒，徐勝濤，鄭泗軍，王永斌

（1云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)環(huán)境資源研究所，昆明 650205；2西雙版納傣族自治州綠色食品與鄉(xiāng)村產(chǎn)業(yè)發(fā)展中心，云南景洪 666100；3云南省瀾滄縣茶葉和特色生物產(chǎn)業(yè)發(fā)展中心，云南普洱 665600）

0 引言

香蕉是熱帶亞熱帶地區(qū)重要水果，全球共有130多個國家種植香蕉[1]。中國是世界香蕉生產(chǎn)大國，主要分布在廣西、海南、廣東、福建、臺灣、云南[2]。由Dickeyasp.(Dickeya zeae，Dickeya paradisiacia)引起的香蕉細(xì)菌性軟腐病是香蕉產(chǎn)區(qū)僅次于枯萎病危害的主要病害，對香蕉生產(chǎn)具有嚴(yán)重威脅[3]。該病害在幼苗期和成株期都可發(fā)生，主要通過危害香蕉假莖，致使假莖、葉鞘軟腐，葉片發(fā)黃，嚴(yán)重的整株香蕉腐爛、倒伏，有腥臭味，常與香蕉枯萎病混合發(fā)生危害。1983年在西孟加拉首次發(fā)現(xiàn)該病害[4]，隨后在印度[5]及伊朗[6]等地相繼發(fā)生。中國于2009年在廣東番禺發(fā)現(xiàn)香蕉細(xì)菌性軟腐病[7]，目前在廣東[8]、云南[9]和廣西[10]都有危害加重的趨勢，部分蕉園病株率達(dá)20%以上。為此，系統(tǒng)篩選香蕉細(xì)菌性軟腐病防控藥劑并進(jìn)行田間防控效果評價(jià)，有效防控香蕉細(xì)菌性軟腐病的發(fā)生流行，防止濫用殺菌劑，是促進(jìn)香蕉產(chǎn)業(yè)可持續(xù)綠色發(fā)展的保障。

國內(nèi)外關(guān)于香蕉細(xì)菌性軟腐病的研究主要集中于病原菌致病機(jī)理方面[11-13]。在香蕉細(xì)菌性軟腐病的防控上，豆亞亞等[14]構(gòu)建了香蕉細(xì)菌性軟腐病菌的實(shí)時熒光PCR快速檢測體系，蒲小明[15]和袁月[16]等開展了抗病品種的篩選。在化學(xué)藥劑篩選方面的報(bào)道較少，杜嬋娟等[10]開展了7種殺菌劑對香蕉細(xì)菌性軟腐病菌的室內(nèi)毒力測定，室內(nèi)抑菌效果最好的是46%氫氧化銅。蒲小明等[17]通過室內(nèi)抑菌和盆栽試驗(yàn)篩選了水合霉素和菌毒清對香蕉細(xì)菌性軟腐病的防治效果。沈會芳等[18]應(yīng)用最小抑制濃度法、離體葉片法和盆栽試驗(yàn)開展了不同藥劑對香蕉細(xì)菌性軟腐病的防治效果，中生菌素在室內(nèi)對病原菌有較強(qiáng)的抑制能力，通過盆栽試驗(yàn)獲得30%王銅和20%噻菌銅對香蕉細(xì)菌性軟腐病有盆栽防治效果。

文獻(xiàn)報(bào)道的香蕉細(xì)菌性軟腐病相關(guān)化學(xué)藥劑篩選，目前僅表現(xiàn)于室內(nèi)和盆栽試驗(yàn)階段，本研究在綜合前人研究結(jié)果基礎(chǔ)上，以生產(chǎn)上常用的抗生素類和非抗生素類細(xì)菌性病害的主要防治藥劑，通過室內(nèi)抑菌、盆栽防效以及大田試驗(yàn)，系統(tǒng)開展香蕉細(xì)菌性軟腐病防治藥劑篩選，以期為該病害的防治提供參考和科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試病原菌與香蕉品種 供試病原菌為香蕉細(xì)菌性軟腐病病原菌(Dickeya zeae)。項(xiàng)目組于2016年采自于云南省西雙版納州香蕉種植園，按照柯赫氏法則經(jīng)分離培養(yǎng)、致病性測定及病原鑒定后用50%無菌甘油保存于-80℃冰箱備用[9]。

供試香蕉為巴西蕉，株高14～19 cm、6～8葉齡的健康香蕉苗。

1.1.2 供試培養(yǎng)基

（1）NA固體培養(yǎng)基。蛋白胨10 g，牛肉膏3 g，NaCl 5 g，瓊脂15 g，蒸餾水1000 mL，調(diào)節(jié)至pH 7.0。

（2）LB液體培養(yǎng)基。蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g，蒸餾水1000 mL，調(diào)節(jié)至pH 7.0。

1.1.3 供試藥劑 藥劑包括抗生素類藥劑和非抗生素類藥劑，共11種，其中抗生素類藥劑5種、非抗生素類藥劑6種，其種類、有效成分詳見表1。

表1 供試藥劑種類

1.2 供試方法

1.2.1 病原細(xì)菌菌懸液制備 將香蕉細(xì)菌性軟腐病病原菌接種于NA固體培養(yǎng)基上，30℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，挑取單菌落接種于300 mL LB液體培養(yǎng)基的三角瓶中，30℃、160 r/min搖床培養(yǎng)24 h獲得菌原液備用。按照平板菌落計(jì)數(shù)法[19]，將液體培養(yǎng)的菌原液用無菌水稀釋為 10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6不同濃度梯度的菌液，然后每個濃度分別取1 mL均勻涂布于NA平板，同一個稀釋度涂板重復(fù)3次，37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，選擇每個平板上長有約100個菌落的稀釋度計(jì)算每毫升的含菌量，算出同一稀釋度3次重復(fù)的菌落平均數(shù)，并根據(jù)式(1)計(jì)算出每毫升中菌落形成單位即菌原液濃度。用無菌水將菌原液稀釋配成約1×108cfu/mL的菌懸液備盆栽藥效測定使用。

1.2.2 室內(nèi)藥劑初步篩選 采用含毒介質(zhì)法中的最低抑制濃度法[19-21]進(jìn)行室內(nèi)藥劑初步篩選。用無菌水將各藥劑配制成一定濃度的稀釋母液，把各藥劑按一定比例加入到滅菌培養(yǎng)基中，配制成不同藥劑濃度梯度的含藥培養(yǎng)基，每種藥劑選適宜的5個濃度梯度進(jìn)行測定。把1 mL不同濃度藥劑分別與滅菌后冷卻至約50℃的49 mL NA培養(yǎng)基均勻混合，配制成不同藥劑濃度梯度的含藥培養(yǎng)基，將含藥培養(yǎng)基均勻倒入3個直徑為9 cm的培養(yǎng)皿中，取100 μL菌懸液均勻涂于凝固的帶毒培養(yǎng)皿中，對照分別為1 mL無菌水與49 mLNA培養(yǎng)基均勻混合。每個處理重復(fù)3次，置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48 h后檢查菌落生長情況并記錄數(shù)據(jù)。

帶毒平板上無病原菌菌落產(chǎn)生，記錄為“-”，表示抑制菌落生長，對應(yīng)的藥劑濃度記錄為“C-”；帶毒平板上產(chǎn)生病原菌菌落，記錄為“+”，表示菌落生長，對應(yīng)的藥劑濃度記錄為“C+”。根據(jù)記錄的菌落生長與不生長的2個藥劑濃度，參照式(2)計(jì)算出每次重復(fù)的抑菌最低有效濃度Cn'，再參照式(3)計(jì)算出每種藥劑3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均值即該藥劑的抑菌最低有效濃度（n表示每個處理重復(fù)的次數(shù)）。

1.2.3 藥劑盆栽試驗(yàn) 根據(jù)室內(nèi)抑菌效果，2015年7月選取抑制濃度較低的10種藥劑在云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)環(huán)境資源研究所溫室中進(jìn)行盆栽試驗(yàn)。采用傷根浸菌液接種法，香蕉植株根部清洗后用滅菌的剪刀剪斷1/3根須后，將其浸泡于香蕉細(xì)菌性軟腐病菌液中30 min，然后種植于直徑11 cm、高12 cm的塑料盆內(nèi)（每盆放土280 g），澆水300 mL。香蕉植株接種菌液種植48 h后，按照各藥劑的推薦劑量將供試藥劑以清水稀釋到供試濃度，每盆澆灌藥劑300 mL，對照澆灌等量清水。每個處理3株，設(shè)接種菌液不澆灌藥劑的空白對照，3次重復(fù)。施藥后14天調(diào)查發(fā)病情況，病情調(diào)查分級記載，按式(4)、(5)分別計(jì)算病情指數(shù)和防治效果[22]。根據(jù)香蕉細(xì)菌性軟腐病田間發(fā)病特點(diǎn)，參照文獻(xiàn)[16,18]綜合制定盆栽試驗(yàn)病情分級標(biāo)準(zhǔn)。0級，植株無癥狀；1級，植株外圍下部1～2片葉萎焉發(fā)黃；3級，植株外圍葉片3～4片葉萎焉發(fā)黃；5級，植株整株葉片萎焉發(fā)黃，燙傷狀；7級，植株整株萎焉、枯死。

1.2.4 田間藥效測定 2018年7月在云南省西雙版納州西雙版納南香源農(nóng)業(yè)科技有限公司，打洛鎮(zhèn)曼山村委會楊稿地（東經(jīng)100°11′，北緯21°71′，海拔609 m）開展田間藥效測定。香蕉品種為巴西蕉，施藥時期在田間定植香蕉5個月后，葉片數(shù)約為12～15片的旺長期。選擇噻霉酮、噻菌銅、中生菌素、春雷霉素4種室內(nèi)和盆栽效果較好的藥劑，采用3%噻霉酮可濕性粉劑500倍液、20%噻菌銅懸浮劑500倍液、3%中生菌素可濕性粉劑1000倍液、6%春雷霉素水劑800倍液進(jìn)行噴淋防治，設(shè)1個空白對照，共5個處理，每個處理4次重復(fù)，每個重復(fù)10株香蕉。田間小區(qū)隨機(jī)區(qū)組排列，每個重復(fù)設(shè)置1個小區(qū)，共20個小區(qū)，每小區(qū)10株。發(fā)病初期第1次噴藥，間隔7天噴1次，共噴藥3次，對照噴淋等量清水。

施藥前調(diào)查第1次病情指數(shù)，每株調(diào)查葉片、葉鞘及植株枯黃、壞死癥狀，第3次施藥后10天調(diào)查第2次。分級記載調(diào)查植株，病情指數(shù)按葉片枯黃位置及程度大小分為0、1、3、5、7、9這6個等級。其中，0級，植株無枯黃癥狀；1級，植株底腳葉及葉鞘出現(xiàn)枯黃癥狀；3級，植株中部以下葉片發(fā)黃，葉鞘枯黃壞死；5級，植株中上部片發(fā)黃，葉鞘枯黃壞死；7級，植株整株發(fā)黃；9級，植株整株枯死、倒伏。按式(4)、(6)分別計(jì)算病情指數(shù)和防治效果[22]。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析數(shù)據(jù)

利用軟件SPSS 18.0，采用Duncan’s新復(fù)極差法和獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)分析各處理間的差異顯著性。平均數(shù)據(jù)以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 室內(nèi)藥劑篩選

供試的11種藥劑中，除井崗霉素在濃度為2000 μg/mL時仍未抑制病菌生長外，其余藥劑對香蕉細(xì)菌性軟腐病菌均有不同程度的抑菌效果（表2）?？股仡愃巹υ摬≡?xì)菌的抑菌效果較好，其中四霉素的抑菌效果較好，抑菌最低有效濃度僅為1.74 μg/mL，其次為硫酸鏈霉素、春雷霉素、中生菌素，抑菌最低有效濃度分別為9.10、29.50、89.10 μg/mL；非抗生素類藥劑以銅制劑類抑菌效果較好，噻霉酮抑菌最低有效濃度為89.55 μg/mL，王銅、噻菌銅抑菌最低有效濃度分別為445.00、595.00 μg/mL，20%葉枯唑抑菌最低有效濃度分別為795.00 μg/mL，乙酸銅、氫氧化銅的抑菌最低有效濃度分別為1050.00、1350.00 μg/mL。

表2 11種藥劑對香蕉細(xì)菌性軟腐病的抑菌最低有效濃度 μg/mL

2.2 盆栽試驗(yàn)效果

盆栽結(jié)果（表3）表明，在開展盆栽試驗(yàn)的10種藥劑中，春雷霉素、噻霉酮、中生菌素、噻菌銅的防治效果較好，施藥后14天的防治效果分別為67.97%、64.58%、63.53%、61.83%。這些藥劑可以在生產(chǎn)中推廣應(yīng)用。

表3 供試藥劑對香蕉細(xì)菌性軟腐病的盆栽藥效試驗(yàn)

續(xù)表3

2.3 田間試驗(yàn)結(jié)果

從表4可看出，供試的4種藥劑對香蕉細(xì)菌性軟腐病都有防治效果，春雷霉素防治效果較好，第3次施藥后10天的防治效果達(dá)90.19%，其次為噻霉酮、中生菌素、噻菌銅，防治效果分別為89.84%、84.60%、74.59%。4種藥劑對香蕉細(xì)菌性軟腐病的防效差異不顯著。

表4 供試藥劑防治香蕉細(xì)菌性軟腐病的田間效果

3 結(jié)論與討論

軟腐病是生產(chǎn)中各類作物的主要病害之一，殺菌劑是當(dāng)前防治軟腐病的主要藥劑，抗生素與廣普性殺菌劑的應(yīng)用可降低生產(chǎn)中不同作物軟腐病的發(fā)生危害程度[23-24]。

筆者進(jìn)行了抗生素類和非抗生素類等11種常見細(xì)菌性病害殺菌劑對香蕉細(xì)菌性軟腐病的篩選。室內(nèi)抑菌和盆栽試驗(yàn)結(jié)果表明，春雷霉素和中生菌素等抗生素對香蕉細(xì)菌性軟腐病菌的抑制效果較好；銅制劑中，噻菌銅和噻霉酮等對香蕉細(xì)菌性軟腐病菌有較好的抑制效果。春雷霉素和中生菌素來源上屬于農(nóng)用抗生素類，是用于細(xì)菌性病害防治的一類殺菌劑[25]。本研究中春雷霉素和中生菌素對香蕉細(xì)菌性軟腐病菌有較好抑制作用和盆栽防效，春雷霉素、中生菌素的室內(nèi)抑菌最低有效濃度分別為29.50、89.10 μg/mL，盆栽防控效果分別為67.97%、63.53%。中生菌素對香蕉細(xì)菌性軟腐病菌的室內(nèi)抑制作用與沈會芳等[18]報(bào)道的室內(nèi)藥劑篩選結(jié)果一致。關(guān)于抗生素在其他細(xì)菌性病害防治篩選中的應(yīng)用，Wang等[26]報(bào)道中生菌素和四霉素等抗生素對獼猴桃軟腐病有明顯抑制活性并有較好的田間防治效果。張賀[27]和王爽[28]等報(bào)道這2類抗生素對杧果細(xì)菌性黑斑病和甜瓜細(xì)菌性果斑病等細(xì)菌病害也同樣有抑制作用，結(jié)果與本研究室內(nèi)抑菌篩選的一致，說明抗生素性殺菌劑對細(xì)菌性病害有一定防控效果。銅制劑是作物病害防控中常用的一種保護(hù)性殺菌劑，對細(xì)菌性病害有較好的防控效果[28-30]，沈會芳等[18]報(bào)道王銅和噻菌銅對香蕉細(xì)菌性軟腐病菌的抑制活性較低，這與本研究的結(jié)果一致，王銅、噻菌銅的室內(nèi)抑菌最低有效濃度分別為445、595 μg/mL。但在本研究的盆栽試驗(yàn)中，王銅對該病害的防治效果為28.50%，防效不理想，這與沈會芳等[18]報(bào)道的在其離體葉片防治試驗(yàn)中的防控效果有差異。本研究中，井崗霉素在濃度為2000 μg/mL時，仍未能抑制香蕉細(xì)菌性軟腐病菌生長，說明該藥劑對香蕉細(xì)菌性軟腐病沒有防治效果。

由于硫酸鏈霉素于2016年6月登記使用到期，大田防控試驗(yàn)沒有延續(xù)使用硫酸鏈霉素進(jìn)行篩選，在盆栽試驗(yàn)基礎(chǔ)上選用春雷霉素、噻霉酮、中生菌素和噻菌銅等4種藥劑開展香蕉細(xì)菌性軟腐病的大田防控藥劑篩選。春雷霉素對香蕉細(xì)菌性軟腐病的防控效果較好，防效達(dá)90.19%，其次為噻霉酮、中生菌素和噻菌銅，防治效果分別為89.84%、84.60%和74.59%。郭安柱等[31]篩選出中生菌素、噻霉酮和春雷霉素等藥劑對核桃黑斑病大田防效達(dá)70%以上，該結(jié)果與本研究結(jié)果一致，抗生素類中的中生菌素和春雷霉素及銅制劑類中的噻霉酮等對細(xì)菌性病害有一定防控效果。

香蕉細(xì)菌性軟腐病是近年在國內(nèi)新發(fā)生的一種土傳病害，寄主范圍廣，在各香蕉產(chǎn)區(qū)均有逐年加重危害的趨勢，對香蕉生產(chǎn)有重大威脅。本研究通過11種殺菌劑對香蕉細(xì)菌性軟腐病菌的室內(nèi)抑菌實(shí)驗(yàn)，10種藥劑的盆栽防效及其中4種殺菌劑的大田防效試驗(yàn)，從室內(nèi)、盆栽到大田系統(tǒng)開展了該病害的防控藥劑篩選，得到了對香蕉細(xì)菌性軟腐病有較好防治效果的4種殺菌劑，分別為春雷霉素、噻霉酮、中生菌素和噻菌銅，防治效果分別為90.19%、89.84%、84.60%、74.59%。廣東、廣西、海南、云南、福建等地區(qū)都有香蕉的大量種植和分布，這些地區(qū)的氣候條件、栽培措施及種植的品種都有差別，并且不同地區(qū)來源的菌株對藥劑的敏感性有差異，該試驗(yàn)篩選的藥劑對不同來源的香蕉細(xì)菌性軟腐病菌室內(nèi)抑菌效果和不同地區(qū)的大田防治效果還有待進(jìn)一步探索，應(yīng)根據(jù)不同香蕉產(chǎn)區(qū)的實(shí)際情況進(jìn)行香蕉細(xì)菌性軟腐病的防控。在開展香蕉細(xì)菌性軟腐病的防控時，應(yīng)積極貫徹“預(yù)防為主，綜合防治”的植保方針，農(nóng)業(yè)防治與化學(xué)防治相結(jié)合，注意改善蕉園土壤排水系統(tǒng)，加強(qiáng)肥水管理，發(fā)現(xiàn)病株時按照說明書推薦使用的濃度，合理交替使用這4種藥劑進(jìn)行噴淋防治。