Pif1維持基因組穩(wěn)定性在腫瘤中發(fā)揮的作用

陳波，李志杰

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院醫(yī)學(xué)研究中心，遼寧省環(huán)境與代謝疾病動(dòng)物模型研究與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，沈陽 110004）

解旋酶是生物體內(nèi)核酸代謝中必不可少的酶，能將遺傳物質(zhì)傳遞給后代［1］。解旋酶被稱為分子運(yùn)動(dòng)蛋白，沿著DNA磷酸二酯主鏈單向轉(zhuǎn)移，利用核苷三磷酸（nucleoside triphosphate，NTP）水解的能量將穩(wěn)定的DNA雙鏈分離成單鏈或改造核酸蛋白復(fù)合物［2］。解旋酶參與多種細(xì)胞功能的調(diào)控，與肝癌、乳腺癌和卵巢癌等腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［3-5］。

基于解旋酶序列的保守性，可分為6個(gè)不同的超家族（superfamily 1-6，Sf1-Sf6）。根據(jù)在核酸中移位的方向性，這些家族又被分為A（典型代表為PcrA和Srs2）和B（典型代表為RecD2和Pif1）2組［6］。Pif1屬于超家族ⅠB解旋酶，在核酸上沿5’-3’方向轉(zhuǎn)位［6］。文獻(xiàn)［7］報(bào)道，Pif1可抑制DNA損傷，防止G4四鏈體的復(fù)制停頓和雙鏈斷裂（double strand breaks，DSBs），并通過調(diào)節(jié)端粒酶在DSBs上的作用抑制總?cè)旧w重排（gross chromosomal rearrangement，GCR），提示Pif1在維持基因組穩(wěn)定性方面具有不可或缺的作用。本文對(duì)Pif1在DSBs修復(fù)相關(guān)DNA復(fù)制中發(fā)揮的作用進(jìn)行綜述，利于對(duì)Pif1在維持基因組完整性上所發(fā)揮作用的理解。

1 Pif1與基因組穩(wěn)定性

Pif1在不同生物體中有單個(gè)或多個(gè)亞族。目前，已知釀酒酵母基因組編碼2個(gè)Pif1同源基因（Pif1和Rrm3），裂殖酵母、小鼠和人類基因組只編碼1個(gè)Pif1同源基因（分別為Pfh1，mPif1和hPif1）［8］。作為DNA解旋酶家族中的典型成員，Pif1在線粒體基因組維護(hù)中發(fā)揮多種作用，包括線粒體基因組維持、端粒形成的抑制和岡崎片段處理等［2-9］。

1.1 線粒體基因組的維持

在正常細(xì)胞中，線粒體是主要細(xì)胞器，對(duì)內(nèi)環(huán)境的調(diào)控至關(guān)重要。由線粒體DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）突變引起的功能障礙，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［10］。釀酒酵母Pif1最初在基因篩檢中分離出，其突變會(huì)影響線粒體基因組的重組頻率［11］。Rrm3基因編碼另外5’-3’方向的DNA解旋酶，最初是因其在核糖體DNA（ribosomal DNA，rDNA）中引起重組升高而被識(shí)別，后經(jīng)蛋白質(zhì)組分析也發(fā)現(xiàn)其位于線粒體［12］。盡管Pif1和Rrm3在結(jié)構(gòu)上相似，并通過作用于共同的靶點(diǎn)來促進(jìn)基因組的完整性，但它們?cè)诰€粒體中具有不重疊和甚至有時(shí)相反的作用［2-13］。

在Pif1缺乏的細(xì)胞中，mtDNA的重組減少，這提示Pif1對(duì)mtDNA復(fù)制和重組至關(guān)重要［14］。在Pif1突變體中，細(xì)胞對(duì)溴化乙錠（ethidium bromide，EtBr）誘導(dǎo)的DNA損傷敏感，mtDNA易碎裂并隨之丟失［15］。此外，在Pif1缺乏的細(xì)胞中，在特定位點(diǎn)發(fā)生mtDNA的斷裂，這意味著Pif1可以阻止或修復(fù)mtDNA中的DSBs［15］。研究［16］表明，下調(diào)Pif1基因可降低結(jié)腸癌細(xì)胞存活率，但對(duì)正常細(xì)胞沒有影響，這可能是由于其在重新啟動(dòng)停滯的復(fù)制叉方面的作用。

1.2 端粒形成的抑制

Pif1作為從頭端粒形成和延伸的負(fù)調(diào)控因子，以檢測失去亞端粒基因表達(dá)的突變體。在Pif1缺失的情況下，端粒長度增加約75個(gè)堿基對(duì)［17］。Pif1蛋白的過量產(chǎn)生可恢復(fù)mtDNA重組能力，并適度縮短端粒長度［18］。Pif1的過表達(dá)導(dǎo)致CDC13-1和Ku缺陷菌株的活力降低，且該表型被EXO1的突變抑制，該突變編碼端粒降解外切核酸酶，表明Pif1去除端粒酶會(huì)降低端粒末端保護(hù)功能［19］。

在釀酒酵母中，DNA損傷會(huì)導(dǎo)致Pif1的磷酸化，從而阻斷DSBs端粒酶的活性，但不會(huì)阻斷染色體末端的活性［20］。Pif1和Rrm3由不同的框架翻譯起始密碼子表達(dá)，與Pif1突變體表現(xiàn)出的端粒酶活性依賴的高GCR率不同，Rrm3基因突變既不影響GCR率，也不影響從頭端粒的添加［21］。然而，Rrm3在體內(nèi)仍然與端粒相關(guān)，并在端粒DNA的及時(shí)復(fù)制中發(fā)揮重要作用，影響端粒的長度［21］。hPif1的氨基酸序列與釀酒酵母Pif1和Rrm3具有同源性［22］，在體內(nèi)外，與端粒酶的催化亞基hTERT相互作用，并在過表達(dá)時(shí)縮短端粒長度，這表明其在功能上與釀酒酵母Pif1具有相似性。

1.3 岡崎片段的成熟

基于雙鏈體DNA的反向平行結(jié)構(gòu)，當(dāng)前導(dǎo)鏈不斷向復(fù)制叉延伸時(shí)，后隨鏈DNA復(fù)制是一系列連續(xù)的過程，這些過程連接形成岡崎片段［23］。在釀酒酵母中，DNA聚合酶δ（DNA polymerase δ，Polδ）在每個(gè)細(xì)胞周期內(nèi)產(chǎn)生約十萬個(gè)岡崎片段，且每個(gè)片段都需要以高保真度連接到DNA鏈中，以避免未修復(fù)缺口的積累導(dǎo)致DSBs和細(xì)胞致死性［24］。

通過對(duì)裂殖酵母的研究，發(fā)現(xiàn)Pif1在岡崎片段的加工中起重要作用。其中，對(duì)溫度敏感的Cdc24等位基因被Pfh1+（釀酒酵母的同系物）內(nèi)的突變體抑制，而Pif1和Dna2-C2突變體對(duì)溫度敏感的生長缺陷被Pfh1-R20（Pfh1的冷敏感突變體等位基因）抑制［25］。在釀酒酵母中觀察到了類似的作用，Pif1突變體在30 ℃時(shí)抑制了Dna2突變體的致死表型，但在更高的溫度下卻沒有［26］。即使在37 ℃時(shí)，Pif1-Dna2雙重突變體仍然存在，但DNA聚合酶32（DNA polymerase 32，Pol32）會(huì)額外缺失，而Pol32缺失編碼Polδ的非必需亞基，提示Pif1和Pol32通過持續(xù)性刺激有助于下游岡崎片段的置換和更長的鏈瓣產(chǎn)生Polδ［6］。綜上，在后隨鏈合成過程中，Pif1和Pol32產(chǎn)生了需要Dna2活性才能完成DNA復(fù)制的中間底物，有利于岡崎片段的形成。

1.4 DNA合成的修復(fù)

在裂殖酵母中，Pfh1不僅需要完成DNA復(fù)制，還需要對(duì)DNA破壞劑作出反應(yīng)。對(duì)冷敏感的Pfh1-R20突變細(xì)胞在特定溫度下對(duì)甲磺酸甲酯（methyl methanesulfonate，MMS）和羥基脲（hydroxyurea，HU）高度敏感，表明其在DNA損傷修復(fù)中的作用［27］。在釀酒酵母中，與裂殖酵母Pfh1突變體相比，Pif1突變體對(duì)MMS和HU僅有中等敏感性。然而，Pif1在γ射線照射后與Rad52（同源重組蛋白）共定位在核內(nèi)，從而修復(fù)了病灶，表明Pif1對(duì)DSB的修復(fù)和重組具有特異性作用［28］。據(jù)文獻(xiàn)［29］報(bào)道，Pif1在通過斷裂誘導(dǎo)復(fù)制（break-induced replication，BIR）途徑產(chǎn)生DSB修復(fù)產(chǎn)物中具有重要作用。

2 Pif1與腫瘤的調(diào)控

基因組不穩(wěn)定性突變被認(rèn)為是癌癥發(fā)生和發(fā)展的重要誘因，而線粒體基因組維持、端粒形成的抑制和岡崎片段處理等對(duì)維持基因組的穩(wěn)定性至關(guān)重要。解旋酶被證明在保護(hù)細(xì)胞免受DNA損傷中起關(guān)鍵作用。與Pif1在維持復(fù)制叉完整性中的作用相一致，腫瘤細(xì)胞中Pif1的消耗可以防止從胸苷誘導(dǎo)的復(fù)制停滯釋放后進(jìn)入S期并減慢S期進(jìn)程［30］。研究［16］指出，Pif1具有在S期進(jìn)入和在新的復(fù)制位點(diǎn)上觸發(fā)起點(diǎn)的作用，為維持基因組穩(wěn)定性所必需。當(dāng)新的復(fù)制位點(diǎn)對(duì)起始點(diǎn)激發(fā)的需求增加時(shí)，尤其是在致癌基因誘導(dǎo)的復(fù)制應(yīng)激期間，這可能變得至關(guān)重要。據(jù)文獻(xiàn)［31］報(bào)道，致癌基因的活化和進(jìn)入S期的失控可能導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)慢性DNA復(fù)制應(yīng)激。在這種情況下，腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)出對(duì)Pif1的依賴性增加，以維持生存能力。研究［32］表明，細(xì)胞中Pfh1-L430P等位基因的表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞核和線粒體功能的喪失，而該變異體無法補(bǔ)充Pfh1在細(xì)胞核和線粒體中的基本功能，從而增加了乳腺癌的患病風(fēng)險(xiǎn)。

Pif1可以負(fù)調(diào)控端粒酶，促進(jìn)岡崎片段的處理。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)Pif1缺乏或失調(diào)時(shí)，岡崎片段的成熟受到抑制，加大了正常細(xì)胞向腫瘤轉(zhuǎn)變的可能性。據(jù)文獻(xiàn)［33］報(bào)道，Pif1能夠抑制DNA末端的端粒酶活性，端粒長度穩(wěn)態(tài)對(duì)維持基因組穩(wěn)定至關(guān)重要，端粒酶的激活和抑制是治療人類疾病的潛在療法。Pif1被證明在DSB修復(fù)中起關(guān)鍵作用，其中，BIR是主要的修復(fù)途徑，而Pif1可以通過控制核酸酶活性在端粒上啟動(dòng)DDR［34］。此外，必需的端?！懊薄钡鞍淄ㄟ^抑制DNA損傷反應(yīng)和調(diào)節(jié)端粒酶募集，將端粒與DSB區(qū)別開來，從而發(fā)揮抗癌的作用［35］。

3 總結(jié)

Pif1是一類高保守的解旋酶，涉及各類核酸的處理。盡管Pif1在酵母細(xì)胞中具有作為全能DNA代謝參與者的多功能性，但與裂殖酵母或更高等的真核生物中其直系同源物的作用不一致。mPif1缺失突變幾乎沒有可見的表型，包括端粒長度未出現(xiàn)改變。雖然hPif1的功能有很多未知，但保守的Pif1殘基的突變與乳腺癌易感性增加有關(guān)，這表明hPif1可能起到抑癌作用。即使釀酒酵母Pif1和Rrm3，以及hPif1表達(dá)定位于裂殖酵母的線粒體和細(xì)胞核中，這些同源物都不能提供Pif1的所有基本功能。

Pif1解旋酶家族的每個(gè)成員都具有自己獨(dú)特的活性，這是由于其結(jié)構(gòu)、寡聚狀態(tài)和底物選擇等方面的決定性差異。鑒于Pif1解旋酶家族在細(xì)胞中廣泛的獨(dú)特功能，隨著對(duì)Pif1解旋酶家族進(jìn)行更全面而深入的研究，將揭示Pif1在人類相關(guān)腫瘤疾病中所發(fā)揮作用的更多細(xì)節(jié)，也為抗癌新藥的設(shè)計(jì)等提供新的靶點(diǎn)和思路。