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    乙醇-硫酸銨雙水相體系萃取蝦殼中蝦青素研究

    2023-07-04 16:23:32馮金華何梓淵劉紅英李麗娜
    安徽農(nóng)業(yè)科學(xué) 2023年5期
    關(guān)鍵詞:分離

    馮金華 何梓淵 劉紅英 李麗娜

    摘要 ?采用乙醇-硫酸銨雙水相制備蝦殼中的蝦青素,探索蝦殼中蝦青素提取的條件。結(jié)果表明:采用乙醇溶液,料液比1 ∶15,每次提取3 h,提取2次,提取效果較好。采用乙醇-硫酸銨雙水相萃取蝦青素,蝦青素主要集中在上下兩相之間,最佳條件:20%硫酸銨∶蝦青素乙醇提取液(v/v)=2.5 ∶2.0,沉淀率為89.09%。經(jīng)薄層色譜法和高效液相色譜法檢測,雙水相萃取可使蝦青素提取液中的各類型蝦青素都沉淀。

    關(guān)鍵詞 ?蝦青素;雙水相體系;分離

    中圖分類號 ?TS 254.9 ??文獻標識碼 ?A ??文章編號 ?0517-6611(2023)05-0176-05

    doi: 10.3969/j.issn.0517-6611.2023.05.040

    開放科學(xué)(資源服務(wù))標識碼(OSID):

    Extraction of Astaxanthin from Shrimp Shells by Ethanol /(NH4)2SO4 Aqueous Two-phase System

    FENG Jin-hua, HE Zi-yuan, LIU Hong-ying et al

    (Hebei Agriculture University, Qinhuangdao, Hebei 066003)

    Abstract ?Astaxanthin in shrimp shell was prepared by ethanol/(NH4)2SO4 aqueous two-phase method. The extraction conditions of astaxanthin from shrimp shell were explored. It was determined that ethanol solution was used, the solid-liquid ratio was 1 ∶15, extracted for 3h and twice, and the extraction effect was better. Astaxanthin was extracted by ethanol/(NH4)2SO4 aqueous two-phase extraction. Astaxanthin was mainly concentrated between the upper and lower phases. The optimum condition was that 20% (NH4)2SO4 ∶ astaxanthin ethanol extract(v/v) = 2.5 ∶2.0, and the precipitation rate was 89.09%. By TLC and HPLC examination, all kinds of astaxanthin in astaxanthin extract can be precipitated by aqueous two-phase extraction. This environmentally friendly method has potential application prospects in the large-scale separation of astaxanthin.

    Key words ?Astaxanthin;Aqueous two-phase system;Separation

    蝦青素又稱變胞藻黃素,英文習(xí)慣命名為Astaxanthin,全反式蝦青素的中文系統(tǒng)命名為全反式3,3′-二羥基-4,4′-二酮基-β,β′胡蘿卜素,相對分子質(zhì)量為596.86,純蝦青素是暗紅紫色粉末,熔點224 ℃,不溶于水,能溶解于大多數(shù)有機溶劑[1]。蝦青素天然產(chǎn)物多數(shù)以酯的形式存在,有些是一元酯,有些是二元酯,存在于自然界中的大部分蝦青素及其酯為全反式異構(gòu)體[2]。

    蝦青素具有獨特的著色功能,進入動物體內(nèi)后可以不經(jīng)修飾或生化轉(zhuǎn)化而直接貯存、沉積在組織中[3]。蝦青素在保護細胞膜磷酸酯和其他脂類的超氧化方面表現(xiàn)突出。蝦青素在淬滅活性氧的活性及清除自由基方面能力比β-胡蘿卜素高10倍以上,比VE強百倍以上。同時,蝦青素具有抑制脂質(zhì)過氧化作用,具有顯著降低脂質(zhì)過氧化物累積的作用[4]。蝦青素還具有一定的抗癌特性。Tanaka等[5]在用硝基喹啉-1-氧化物誘發(fā)大鼠口腔癌的類似試驗中,觀察到蝦青素能顯著降低口腔腫瘤的發(fā)生率。這些決定了蝦青素的應(yīng)用價值及商業(yè)價值。

    雙水相萃取技術(shù)是一種操作簡單、易于放大的分離方法,自20世紀60年代提出以來受到廣泛關(guān)注。該技術(shù)的原理是生物物質(zhì)在雙水相體系中的選擇性分配。當生物物質(zhì)進入雙水相體系后,在上相和下相間進行選擇性分配,表現(xiàn)出一定的分配系數(shù)。不同的物質(zhì)在特定的體系中有著不同的分配系數(shù)[6]。近30年來,雙水相萃取已涉及酶、核酸、 生長激素、病毒、色素、生物堿等有效成分的分離及提純。但是有關(guān)該技術(shù)應(yīng)用于蝦青素的提取和分離尚鮮見相關(guān)研究報道。

    目前,已有的萃取體系有高聚物-高聚物-去離子水、高聚物-鹽-去離子水、離子液體-鹽-去離子水、小分子有機溶劑-鹽-去離子水等??紤]到蝦青素易溶于有機溶劑不溶于水的性質(zhì),筆者選擇小分子有機溶劑-鹽-水體系,采用乙醇-硫酸銨雙水相體系對蝦青素進行分離研究,旨在為蝦青素雙水相制備的可行性提供科學(xué)依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料與儀器

    1.1.1 ???原材料。冷凍南美白對蝦,購于河北省秦皇島市海港區(qū)市場。

    1.1.2 ???主要儀器。721型可見光分光光度計,上海舜宇恒平科技有限公司;Sigma 3-30k實驗室高速冷凍離心機,塞維斯科技(北京)有限公司;FA2104N型精密分析電子天平,上海菁海儀器有限公司;FM100型高速萬能粉碎機,天津市泰斯特儀器有限公司;HH-8型恒溫水浴鍋,江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司;H185OR型臺式高速冷凍離心機,湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司;D2F-6050AB型電熱真空干燥箱,天津工興實驗室儀器有限公司;LC-20A型島津高效液相色譜儀,Shimadzu島津公司。

    1.1.3 ???主要試劑。蝦青素標準品(S13036-250 mg >98.0%),上海源葉生物科技有限公司;硅膠板(規(guī)格50 mm×100 mm;厚度0.20~0.25 mm),青島海洋化工有限公司;甲醇(色譜純)、四氫呋喃(色譜純),天津康科德科技有限公司;無水乙醇(AR)、硫酸銨(AR),天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

    1.2 試驗方法

    1.2.1 ???蝦殼中蝦青素的提取。將新鮮的蝦殼用5%稀鹽酸浸沒,攪拌,靜置1 h,至不再有氣泡產(chǎn)生,然后用清水洗至中性,60 ℃下烘干,-10 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

    為檢測提取時間對蝦青素提取效果的影響,取干燥的蝦殼,粉碎,設(shè)置料液比為1 ∶ 8、1 ∶ 10、1 ∶ 15、1 ∶ 20,在室溫下,用乙醇分別浸提蝦殼,檢測提取1、2、3、4、5、9 h,用每組提取液在476 nm處的吸光度來判斷提取液中蝦青素的含量。每組設(shè)置3個平行。

    為檢測提取次數(shù)對蝦青素提取的影響,分別檢測了料液比分別為1 ∶5、1 ∶8、1 ∶10、1 ∶15、1 ∶20,在分別提取1、2、3次(每次提取3 h)時,蝦青素提取液在476 nm的吸光度,并計算蝦青素的提取量。每組3個平行。

    樣品液中蝦青素含量的計算根據(jù)Beer-Lamben定律[7],計算公式:

    m= A×V×106 A1%1 cm×100

    式中,m為類胡蘿卜素含量,μg;

    A為溶液吸光度;

    V為溶液體積,mL。

    其中,吸光系數(shù)A1%1 cm為在1 cm光程長的比色杯中1 g/L濃度溶質(zhì)的理論吸收值。蝦青素標準樣品在乙醇中的吸光系數(shù)為2 365 L/(g·cm)。

    1.2.2 ???乙醇-硫酸銨雙水相體系的配制。配制質(zhì)量體積分數(shù)分別為10%、20%、30%(w/v)的硫酸銨溶液,取2.0 mL無水乙醇溶液,分別與不同體積的硫酸銨溶液混合,在25 ℃下靜置30 min,觀察并記錄成相情況。

    1.2.3 ???乙醇-硫酸銨雙水相溶液萃取蝦殼中的蝦青素。利用“ 1.2.1 ”中的制備方法提取蝦殼中蝦青素,并適當濃縮。然后向一定體積的蝦青素乙醇提取液中(A476 nm=1.694,7.163 μg/mL)加入一定體積的20%、30%的(NH4)2SO4溶液,配制成雙水相,檢測雙水相上相中蝦青素在476 nm處的吸光度。

    1.2.4 ???蝦青素的薄層色譜測定。50 mm×100 mm的硅膠板,展開劑為25%丙酮和75%正己烷,完成薄層分離后測Rf值。

    1.2.5 ???蝦青素的高效液相色譜檢測。色譜柱為C18:250.0 mm×4.6 mm,采用甲醇(B)和四氫呋喃(A)梯度洗脫的方式(表1),流速0.8 mL/min,檢測波長476 nm,進樣量10 μL,柱溫20 ℃。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 乙醇浸提時間對蝦青素提取的影響

    在室溫下,通過對4組料液比進行蝦殼中蝦青素提取的研究發(fā)現(xiàn)(圖1),4組在提取3 h之前,隨著提取時間的延長,提取液中蝦青素均逐漸增大;提取時間在3 h左右,蝦青素在溶液中濃度達到較高值;3 h以后,隨著浸提時間的延長,蝦青素的濃度反而變得不穩(wěn)定,除料液比1 ∶ 8組外,基本未出現(xiàn)持續(xù)增加的情況,主要趨勢是在3~5 h蝦青素濃度變化不大,5~9 h,除料液比1 ∶ 8組基本呈現(xiàn)下降趨勢,但下降速度不快。這說明在室溫下,提取蝦青素的過程中,3 h左右易達到溶解平衡,提取時間繼續(xù)延長,溶解的蝦青素可能發(fā)生分解,反而開始下降。因此,在提取蝦殼中蝦青素時,可以設(shè)定提取時間為3 h左右。

    2.2 乙醇浸提料液比及提取次數(shù)對蝦青素提取的影響

    稱取0.5 g蝦皮,選擇料液比1 ∶ 5、1 ∶ 8、1 ∶ 10、1 ∶ 15、1 ∶ 20進行提取,每次提取3 h。從圖2可以看出,提取1次,所獲得提取液蝦青素的吸光度均在0.3以上,對蝦殼提取第2次時,蝦青素的吸光度明顯降低;1 ∶ 5料液比組第2次提取后,吸光度仍較高,1 ∶ 8和1 ∶ 10組提取液的吸光度基本在0.2左右;1 ∶ 15和1 ∶ 20提取液的吸光度較低;提取第3次,1 ∶ 5組提取液中蝦青素的吸光度仍較高。這說明采用1 ∶ 5料液比提取3次,蝦青素有較多的剩余量。

    由表2可知,5個料液比下,以1 ∶ 15料液比組提取蝦青素量最多。因此在提取蝦青素時,采用1 ∶ 15料液比較合適。

    2.3 乙醇-硫酸銨雙水相溶液的配制

    先用10%、20%、30%(w/v) 的硫酸銨溶液和無水乙醇進行混合試驗,以配制25 ℃乙醇-硫酸銨雙水相體系,試驗結(jié)果見表3~5。由表3可知,采用10%硫酸銨溶液進行雙水相配制不易形成雙水相。

    由表4可知,采用20%硫酸銨溶液進行雙水相配制,無水乙醇 ∶ 20%硫酸銨(v/v)=1 ∶ 1、1 ∶ 1.25、1 ∶ 1.50,可以形成雙水相,且不會出現(xiàn)硫酸銨沉淀,且上相比下相體積大得多。

    由表5可知,采用30%硫酸銨溶液進行雙水相配制,較易形成雙水相,在無水乙醇 ∶ 30%硫酸銨(v/v)=1 ∶ 1.50、1 ∶ 1.75、1 ∶ 2、 1 ∶ 2.25、1 ∶ 2.50可 以形成較清晰的雙水相,且上下相比例逐漸減小。

    綜上,選擇表4、5中成相體系進行蝦青素的萃取試驗。

    2.4 乙醇-硫酸銨雙水相體系萃取蝦青素

    采用表4、5中的雙水相萃取蝦青素,發(fā)現(xiàn)乙醇-硫酸銨雙水相體系可將蝦青素溶液分為3相,蝦青素主要以沉淀的形式集中于中間相,部分蝦青素存在于上相,下相澄清(圖3)。

    由表6可知,3個20%硫酸銨與無水乙醇形成的雙水相對蝦青素的沉淀率均較高,最高為乙醇 ∶ 20%硫酸銨(v/v)=2 ∶ 2.50體系,蝦青素沉淀率為89.09%。由表7可知,30%硫酸銨與無水乙醇形成的雙水相對蝦青素的沉淀率相對較低,上相中的殘留率較高。

    2.5 雙水相體系制備蝦青素的檢測

    采用蝦青素乙醇提取液 ∶ 20%硫酸銨(v/v)=2 ∶ 2.50體系提取液中的蝦青素,并對制備的蝦青素進行高效液相色譜分析和薄層色譜分析。

    2.5.1 ???高效液相色譜分析結(jié)果。

    蝦殼中蝦青素的高效液相色譜圖如圖4所示。其中出峰時間4.5 min處是游離蝦青素,出峰時間14.0~20.0 min處是蝦青素一酯,出峰時間29.5~45.0 min處是蝦青素二酯。由此可知,蝦殼中含有多種蝦青素一酯和多種蝦青素二酯,并且游離蝦青素、蝦青素一酯、蝦青素二酯的含量均很高。

    雙水相萃取蝦青素的高效液相色譜圖(圖5)與圖4基本相同,說明該雙水相體系可以將蝦殼中各種類型蝦青素萃取出來,可以起到很好地制備蝦青素的目的。

    2.5.2 ???薄層色譜分析結(jié)果。

    從圖6可以看出,雙水相萃取蝦青素與蝦殼中蝦青素提取液相比,游離蝦青素條帶沒有太大差別。蝦青素一酯和蝦青素二酯在雙水相萃取圖中更加清晰,推測可能是由于雙水相萃取不僅能夠?qū)⑽r青素沉淀出來,提高了蝦青素的濃度,同時還去除了一部分雜質(zhì),如去除了部分與蝦青素結(jié)合的蛋白質(zhì),使雙水相制備的蝦青素純度更高,蝦青素一酯和二酯的顯色更加清晰。

    3 討論

    蝦青素的制備一般采用有機溶劑萃取-旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮[8]、超臨界流體萃?。?]、堿提酸沉法[10]、 水沉法[11]等,這些方法不利于蝦青素的進一步分離,有些需要加熱則不利于蝦青素穩(wěn)定,有些需要比較昂貴的儀器,有些可能造成環(huán)境污染。

    一般雙水相主要基于物質(zhì)在上下兩相中的分配不同,來實現(xiàn)不同物質(zhì)間的分離。但研究發(fā)現(xiàn),在采用雙水相體系進行物質(zhì)分離時,可能會出現(xiàn)中間相。向不經(jīng)預(yù)處理的有機酸發(fā)酵液中加入可溶性無機鹽或有機鹽和萃取劑進行萃取操作,兩相之間會形成一個富含菌體和蛋白的固相層[12]。修志龍等[13]研究表明,向越桔果實殘渣中加入無機鹽溶液和?親水性低分子有機物,分層后,花青素被萃取到上相,殘渣分?配在下相或兩相之間。Li等[14]研究表明,采用乙醇/Na2CO3雙水相體系從培養(yǎng)的冬蟲夏草中分離冬蟲夏草菌絲體多糖時,99.1%的細胞碎片集中于上下兩相之間。

    該研究發(fā)現(xiàn),蝦青素在乙醇/硫酸銨雙水相體系中,可形成固相層集中于兩相之間。通過適當?shù)碾p水相體系可以使88.0%以上的蝦青素沉淀下來,同時可以去除一些可以溶于上相和下相中的雜質(zhì)成分,如一些蛋白質(zhì)、糖類、其他色素等,在使蝦青素形成沉淀的同時,還能提高蝦青素的品質(zhì),而且節(jié)省了蝦青素脫溶劑的步驟。該方法不需要大量的酸堿,乙醇和硫酸銨都可以回收使用,所以對環(huán)境危害性較小,而且該工藝還比較容易擴大生產(chǎn)。因此,該研究可以成為一種制備蝦青素的新方法。

    參考文獻

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