唑草酮對斑馬魚和非洲爪蟾的急性毒性評價*

廖朝選，李 俊，魏 杰，宋光林▲，龍安祿

(1貴州省分析測試研究院，貴州 貴陽 550014；2貴州省檢測技術(shù)研究應(yīng)用中心，貴州 貴陽 550002)

農(nóng)藥是為人們守護作物生長和糧食安全的重要幫手，沒有農(nóng)藥，糧食安全無從談起[1]。然而，農(nóng)藥在實際使用過程中，僅有少部分作用于靶標(biāo)生物，仍有大量的農(nóng)藥進入環(huán)境，對生態(tài)系統(tǒng)產(chǎn)生破壞[2-3]。據(jù)報道，在我國重要的小麥、玉米和水稻產(chǎn)區(qū)，土壤即農(nóng)產(chǎn)品中均存在多種農(nóng)藥殘留[4]。我國新疆沙雅縣不同植物類型農(nóng)田環(huán)境中部分區(qū)域處于中等風(fēng)險，六六六、毒死蜱、氯氟氰菊酯、氟胺氰菊酯、甲霜靈、苯醚甲環(huán)唑和腐霉利是主要的殘留農(nóng)藥[5]。江蘇省10個市的茶園及表層土壤廣泛檢出擬除蟲菊酯類農(nóng)藥，在全國范圍內(nèi)處于中等水平等[6]。由此可知，農(nóng)藥殘留引起風(fēng)險問題普遍存在，但糧食生產(chǎn)離不開農(nóng)藥使用，此無意的傷害仍將繼續(xù)，科學(xué)合理使用才能趨利避害，將農(nóng)藥的風(fēng)險降到最低[1]。

唑草酮(Carfentrazone-ethyl)是由美國富美實公司(FMC)開發(fā)的三唑啉酮類觸殺型除草劑，可在植物葉綠素生物合成過程中抑制原卟啉原氧化酶從而導(dǎo)致有毒中間物的積累，進而破壞雜草的細(xì)胞膜，使葉片干枯、死亡[7]。相關(guān)產(chǎn)品具有殺草活性高、低溫與沖刷耐受性好的特點[8]，在溫度較低的環(huán)境中具有很大的優(yōu)勢，被登記用于水稻、小麥、甘蔗的一年生闊葉雜草及莎草科雜草防治[9]。目前，對于唑草酮產(chǎn)品的配方篩選[10]、工藝合成[11]方面有了一定的報道，在單劑或復(fù)配制劑對小麥、水稻等田間雜草防效方面也有了相當(dāng)?shù)难芯縖12-13]，而對于唑草酮施用后的環(huán)境生物暴露風(fēng)險報道較少?？茖W(xué)合理地使用農(nóng)藥離不開產(chǎn)品應(yīng)用后的環(huán)境暴露風(fēng)險評估，通過室內(nèi)模擬試驗暴露，測試唑草酮對斑馬魚和非洲爪蟾蝌蚪的急性毒性，可為唑草酮的風(fēng)險評估提供魚類、兩棲類生物的生態(tài)毒性基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

電子天平：梅特勒-托利多(中國)有限公司，TLE204E/02，0.0001 g；溶解氧測定儀：美國哈希公司，HQ30d；pH計：上海精密儀器儀表有限公司，PHB-4；魚缸：一體成型玻璃方缸，體積(V)=8 L。

95%唑草酮原藥：江蘇瑞東農(nóng)藥有限公司提供；丙酮：分析純，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；試驗水：經(jīng)活性炭過濾并脫氯24 h的自來水，pH≈7.2，硬度(以CaCO3計)為173 mg/L，溶解氧為102%ASV(空氣飽和值)。

1.2 試驗生物

斑馬魚(Brachydaniorerio)：購自上海宏業(yè)觀賞魚養(yǎng)殖場，全長2.0～2.5 cm，體重0.12～0.17 g，引入后于實驗室預(yù)養(yǎng)14 d，試驗前7 d的死亡率為0，在試驗前已禁食24 h。

非洲爪蟾(Xenopuslaevis)蝌蚪：引自中國科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心初孵蝌蚪，引入后于實驗室預(yù)養(yǎng)3 d，試驗前1 d停止進食。

1.3 試驗方法

1.3.1 魚類急性毒性試驗

以GB/T 31270.12—2014《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評價試驗準(zhǔn)則》第12部分：魚類急性毒性試驗[15]為參考，先用丙酮將95%唑草酮原藥制備為100 mg a.i./mL的儲備液，然后依次添加入3 L試驗水制備為3.00 mg a.i./L、3.60 mg a.i./L、4.32 mg a.i./L、5.18 mg a.i./L、6.22 mg a.i./L、7.46 mg a.i./L和8.96 mg a.i./L的梯度濃度試驗液。試驗中設(shè)置不加任何外源物的空白對照和僅添加丙酮的助溶劑對照(助溶劑濃度為90 μL/L)，每個處理設(shè)3個重復(fù)，每個重復(fù)10尾魚。試驗采用半靜態(tài)試驗法進行，每12 h更換試驗液一次，周期96 h，試驗中溫度保持在24 ℃±1 ℃，光照條件為光暗比16 h∶8 h。

1.3.2 天敵兩棲類急性毒性試驗

以GB/T 31270.18—2014《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評價試驗準(zhǔn)則》第18部分：天敵兩棲類急性毒性試驗[15]為指導(dǎo)，先用丙酮將95%唑草酮原藥制備為200 mg a.i./mL的儲備液，然后依次添加入3 L試驗水制備為5.50 mg a.i./L、6.60 mg a.i./L、7.92 mg a.i./L、9.50 mg a.i./L、11.40 mg a.i./L和13.69 mg a.i./L的梯度濃度試驗液。試驗中設(shè)置空白對照和助溶劑對照(助溶劑濃度為丙酮，濃度為68.5 μL/L)，每個處理設(shè)3個重復(fù)，每個重復(fù)10尾蝌蚪。試驗液制備前先將試驗水溫調(diào)節(jié)至25 ℃左右，試驗液制備后置于溫度24 ℃±1 ℃的大型恒溫水浴鍋中恒定1 h后放入蝌蚪開始試驗。整個試驗采用半靜態(tài)試驗法在自然光照條件下進行，每12 h更換試驗液一次，周期為96 h。

1.4 數(shù)據(jù)處理

根據(jù)觀察的毒性測試結(jié)果，采Orgin 2019b進行濃度-死亡情況曲線擬合，采用SPSS 19.0軟件統(tǒng)計分析LC50與95%置信限。

2 結(jié)果與分析

2.1 毒性效應(yīng)

魚類急性毒性試驗顯示，在唑草酮的影響下，試驗魚不同程度的毒性效應(yīng)，隨濃度增高，癥狀越明顯；而在空白對照和助溶劑對照組中斑馬魚均未發(fā)生死亡及其他異常效應(yīng)，表明了試驗系統(tǒng)滿足受試生物的正常生長，各處理組發(fā)生毒性效應(yīng)和異常行為與唑草酮有關(guān)。在梯度濃度處理組中，3 h后即觀察到部分試驗魚頻繁換氣、進而游動側(cè)翻；6 h后還觀察到試驗魚游動側(cè)翻或無法正常游動；12 h后出現(xiàn)試驗魚死亡，部分存活試驗魚體色變深、游動無力；直至試驗結(jié)束，所有存活斑馬魚均反應(yīng)遲鈍、身體消瘦、體色變黑。

在天敵兩棲類毒性試驗中，空白對照和助溶劑對照的非洲爪蟾蝌蚪均未發(fā)生死亡及中毒癥狀；各梯度濃度處理組的蝌蚪發(fā)生了與斑馬魚相類似的中毒癥狀和趨勢。試驗中6 h觀察到蝌蚪的游動失調(diào)，12 h后出現(xiàn)反應(yīng)遲鈍，24 h開始發(fā)生死亡，至試驗結(jié)束時，所有存活蝌蚪均呈現(xiàn)游動無力癥狀。

2.2 LC50與毒性等級

如圖1所示，斑馬魚和非洲爪蟾蝌蚪分別暴露于不同濃度的唑草酮溶液后，發(fā)生了不同程度的死亡現(xiàn)象。在96 h的試驗周期里，隨暴露時間的增加，死亡率均有所增加；同時隨暴露濃度的增加，其死亡率也呈現(xiàn)增加趨勢。

圖1 95%唑草酮原藥對斑馬魚和非洲爪蟾蝌蚪的濃度-死亡率效應(yīng)曲線

如表1所示，通過SPSS 19.0統(tǒng)計分析，95%唑草酮原藥對斑馬魚的24 h、48 h、72 h、96 h的半致死濃度LC50為6.62 mg a.i./L、5.09 mg a.i./L、4.86 mg a.i./L、4.40 mg a.i./L；對非洲爪蟾蝌蚪的24 h、48 h、72 h、96 h的半致死濃度LC50為14.7 mg a.i./L、10.6 mg a.i./L、7.52 mg a.i./L、7.14 mg a.i./L。

表1 95%唑草酮原藥對斑馬魚和非洲爪蟾蝌蚪的毒性試驗結(jié)果

根據(jù)導(dǎo)則[15]規(guī)定：農(nóng)藥對魚類和天敵兩棲類的毒性判定均以毒性終點LC50(96 h)確定。當(dāng)魚類和天敵兩棲類96 h的毒性終點分別為LC50>10、1.0

3 結(jié)論與討論

在實驗室條件下，利用半靜態(tài)試驗法測定了95%唑草酮原藥對斑馬魚、非洲爪蟾蝌蚪的急性毒性，結(jié)果顯示，95%唑草酮原藥對斑馬魚和非洲爪蟾蝌蚪96 h的LC50分別為4.40 mg a.i./L和7.14 mg a.i./L，毒性等級均為中等，表明了唑草酮對水生生物魚類和天敵兩棲類均有一定毒副作用。唑草酮在田間應(yīng)用時，不可避免的殘留于植物或土壤中，經(jīng)過土壤淋溶、雨水沖刷等進入水體，當(dāng)水環(huán)境中唑草酮含量達(dá)到一定濃度時，可能引起水生生物的毒性效應(yīng)，進而影響水生態(tài)系統(tǒng)。同時，唑草酮大量應(yīng)用于水稻田的一年生闊葉雜草及莎草科雜草防治[9]，在水稻生產(chǎn)中可能發(fā)生田水外溢的情況，農(nóng)田內(nèi)高濃度的唑草酮經(jīng)田水流至河流、湖泊等，可能產(chǎn)生較大風(fēng)險；而水稻生產(chǎn)期也是天敵兩棲類如青蛙、蟾蜍等活躍的時期，田水中大量的唑草酮也對其具有較大風(fēng)險。因此，在田間應(yīng)用唑草酮時，應(yīng)嚴(yán)格按照產(chǎn)品標(biāo)簽使用，加強田間管理，防止田水外溢，同時在天敵兩棲類自然保護區(qū)域，應(yīng)避免使用。但是，農(nóng)藥的毒性高，不等于風(fēng)險高，農(nóng)藥對水生態(tài)系統(tǒng)的風(fēng)險是農(nóng)藥自身理化性質(zhì)、環(huán)境中的行為特性和生態(tài)毒性等綜合作用的結(jié)果。而且急性毒性僅僅可表征短期暴露的毒性效應(yīng)，而對于長期的生物蓄積、生殖等毒性還缺少相關(guān)數(shù)據(jù)。為了更完善地評估唑草酮對水生生物的暴露風(fēng)險，還需結(jié)合農(nóng)藥環(huán)境暴露量與不同周期毒性測試開展進一步的研究。