脫細胞技術(shù)在氣管組織工程構(gòu)建中的應(yīng)用展望

王堯，錢軍 綜述孫云浩，季明明，朱敏，許建寧 審校

南京大學醫(yī)學院附屬鹽城第一醫(yī)院(鹽城市第一人民醫(yī)院)胸心外科，江蘇鹽城 224005

氣管切除并端端吻合是當前氣管重建的金標準，但僅限于病變氣管段不超過成人總氣管長度的1/2或小兒的1/3[1-4]。當病變氣管超過最大限度時，進行氣管重建有一定難度，因為氣管不僅僅是一個簡單的圓柱狀通氣管道，而是由復雜的多層結(jié)構(gòu)組成[5]。氣管是由15～20個“C”形軟骨構(gòu)成，在氣管內(nèi)表面覆有纖毛上皮，外表面含有平滑肌、血管等結(jié)締組織。氣管軟骨維持著氣管圓柱狀形態(tài)，防止氣管塌陷；而氣管內(nèi)表面呼吸上皮中的纖毛對氣管的清潔有著重要作用；氣管軟骨周圍的結(jié)締組織則保證了氣管的曲伸及收縮、擴張等機械運動[6-7]。因此，還沒有辦法完全重建這樣復雜的多層結(jié)構(gòu)以及完全模擬其功能。目前在氣管組織工程構(gòu)建中常用技術(shù)是脫細胞與3D打印技術(shù)，本文主要對脫細胞技術(shù)在組織工程氣管中的研究進展進行綜述。

1 脫細胞技術(shù)

通過化學和生物酶、物理或組合方法去除組織/器官內(nèi)的細胞成分，有效地保留組織/器官的細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)及三維結(jié)構(gòu)，同時誘導并促進細胞的增殖、分化、黏附，最終重建或修復組織/器官原本的功能[8-9]。

2 脫細胞方法

2.1 化學方法該方法原理為利用去污劑、酸堿溶液等化學試劑處理組織/器官，通過溶解細胞膜和解離細胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)，同時完整保留細胞外基質(zhì)，從而達到脫細胞的目的[10]。理想的化學脫細胞試劑應(yīng)具有毒性低、清除細胞效率高及最大程度保留基質(zhì)生物力學特性等優(yōu)點。Triton X-100、十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulphate，SDS)與脫氧膽酸鈉(deoxycholate，SD)是脫細胞過程中最常用的脫細胞試劑[11]。SDS是最廣泛使用的離子型去污劑，它通過溶解細胞膜和核膜起作用，能完全去除細胞及消除至少90%的宿主DNA。但SDS在脫細胞同時使基質(zhì)血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和糖胺聚糖(glycosaminoglycan，GAG)含量減少，彈性模量減低，且SDS具有細胞毒性，組織脫細胞后需要進行反復的清洗后才能接種細胞[12-13]。SD是另一種離子型去污劑，通過溶解細胞膜起作用，與SDS相比，SD不會破壞基質(zhì)結(jié)構(gòu)且毒性低，但會導致DNA凝集在組織表面[14]。Triton X-100是一種非離子型去污劑，可以通過其分子上的親水基團溶解細胞而達到清除血管壁細胞成分的目的。相比SDS，Triton X-100對組織結(jié)構(gòu)完整性的損害及細胞毒性較小，但清除細胞能力欠佳[15]。三種常用化學脫細胞試劑都有各自不足，須與物理方法及酶等方法聯(lián)合使用才能達到理想的脫細胞效果。

2.2生物方法該方法原理為用胰蛋白酶、核酸酶等來處理組織/器官，清除細胞DNA及細胞外基質(zhì)中的某些成分來達到脫細胞效果[16]。酶處理時間過長或濃度過高，可顯著改變基質(zhì)結(jié)構(gòu)，破壞層黏連蛋白并去除GAG，嚴重損害基質(zhì)的生物力學性能[17]。因此，為了制備優(yōu)質(zhì)的脫細胞基質(zhì)，酶常與化學脫細胞試劑聯(lián)合使用。ZHANG等[18]聯(lián)合使用胰蛋白酶、SDS、Triton X-100對豬腹直肌進行脫細胞處理后發(fā)現(xiàn)細胞和DNA被充分去除，層黏連蛋白、Ⅳ型膠原和纖連蛋白得以完整保留。同時，脫細胞肌肉顯示出與天然肌肉相似的機械強度，超微結(jié)構(gòu)、脈管系統(tǒng)和神經(jīng)通道也完好無損。同樣，先用Triton X-100及SD對人肺進行脫細胞處理后再用脫氧核糖核酸酶處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)殘留DNA被完全清除，從而避免了體內(nèi)潛在的免疫反應(yīng)[19]。

2.3 物理方法該方法原理為借助超聲波、凍融、高壓與超臨界二氧化碳等方法來脫細胞，通過溶解細胞和破壞細胞基質(zhì)黏附蛋白來達到消除細胞的目的。凍融法是最常用的物理方法，其通過冷凍組織，形成細胞內(nèi)結(jié)晶，破壞細胞膜，導致細胞溶解。但該方法必須控制溫度變化速率，控制形成冰晶的大小，防止對ECM的過度損傷[20-21]。高壓法是通過對組織施加壓力來達到溶解細胞的目的，但這種方法只對ECM致密的組織或器官有效(如肝和肺)[22]。超聲波法是運用超聲波在液體中的空化作用以及強烈的振動與攪拌作用將細胞擊碎[23-24]。但是，目前尚未研究出破壞細胞時超聲波的最佳幅度和頻率。超臨界二氧化碳法是一種有前景的方法，由于超臨界二氧化碳具有類液體的密度和類氣體的擴散率，其臨界溫度為31.1℃，臨界壓力為7.40 MPa，與生物系統(tǒng)兼容[25-26]。該方法優(yōu)點在于二氧化碳不會留在組織內(nèi)，因此不需要大量清洗。然而，二氧化碳是非極性的，需要加入極性夾帶劑(如乙醇)來去除細胞的極性磷脂膜，從而清除細胞核和膜。所有的物理方法優(yōu)點在于可以避免化學試劑或酶的毒性，減少對ECM的損害，但缺點在于需要反復清洗才能去除殘留的細胞碎片及DNA，避免免疫排斥反應(yīng)。因此，物理方法需要結(jié)合化學或生物方法才能進一步提高脫細胞效率。

3 脫細胞技術(shù)在氣管組織工程構(gòu)建中的應(yīng)用

脫細胞氣管基質(zhì)不僅具有無免疫原性、無毒性、良好的生物相容性，同時還保留原生氣管的三維結(jié)構(gòu)和細胞外基質(zhì)，是長段氣管缺損修復的理想支架材料。

3.1 脫細胞技術(shù)在動物實驗中的應(yīng)用楊文龍等[27]利用去污劑聯(lián)合酶法制備脫細胞氣管支架，隨后與京尼平交聯(lián)后進行動物體內(nèi)移植實驗。研究結(jié)果顯示移植后15 d未出現(xiàn)嚴重的免疫排斥及炎癥反應(yīng)，效果與自體氣管移植無明顯差異。但長時間移植后脫細胞氣管支架的穩(wěn)定性及生物相容性有待進一步研究。王志豪等[28]采用兩個周期的改良去污劑聯(lián)合酶法制備的兔脫細胞氣管基質(zhì)，生物力學性能較原生氣管僅輕微下降，組織學結(jié)果顯示上皮及黏膜層細胞被完全去除，免疫原性下降。改良的去污劑聯(lián)合酶法雖然縮短了脫細胞周期，節(jié)約成本，但未進行動物體內(nèi)實驗，移植效果尚不確定。蔣媛等[29]采用2%TritonX-100聯(lián)合脫氧核糖核酸酶Ⅰ和核糖核酸酶對兔氣管進行脫細胞處理，組織學分析表明黏膜上皮細胞成分基本被去除，軟骨細胞少量殘留；掃描電鏡結(jié)果顯示氣管內(nèi)表面無細胞殘留，基底膜光滑，有輕微破壞。同樣，ZHANG等[30]分別使用1%、2%、3%、4%TritonX-100和核酸酶對兔氣管進行脫細胞處理，組織學與掃描電鏡結(jié)果顯示經(jīng)2%TritonX-100和核酸酶處理的氣管纖毛上皮細胞完全消失，軟骨細胞大量保留，基底膜完整。異體皮下埋植實驗證實了脫細胞氣管基質(zhì)無免疫原性，具有良好的生物相容性。細胞共培養(yǎng)實驗表明脫細胞氣管基質(zhì)提供的微環(huán)境有利于細胞增殖。因此，2%TritonX-100處理制備的脫細胞氣管基質(zhì)具有良好的力學性能和生物相容性，可幫助氣管損傷的修復重建。KAJBAFZADEH等[31]將十二烷基硫酸鈉制備的脫細胞氣管植入裸鼠體內(nèi)，利用其自身作為天然生物反應(yīng)器，結(jié)果證實了脫細胞氣管基質(zhì)的組織結(jié)構(gòu)得以保留，并具有良好的生物力學性能。移植后3個月、6個月和12個月獲取的活檢樣品中軟骨成分和結(jié)締組織中的細胞播種程度均較高。AOKI等[32]提出了一種使用雙室生物反應(yīng)器使氣管移植物去上皮化并隨后用外源細胞重新填充移植物的新穎方法。他們首先用十二烷基硫酸鈉通過內(nèi)室灌注3 h可有效去除大部分氣管上皮細胞，同時經(jīng)生長培養(yǎng)基灌注的外室可使大部分軟骨細胞存活，最后使氣管移植物重新上皮化。這項研究將脫細胞技術(shù)與生物反應(yīng)器結(jié)合制備氣管移植物，既保留了移植物的結(jié)構(gòu)和機械性能，同時保持了軟骨的活力，并實現(xiàn)了細胞附著和再填充。上述研究都為進一步原位氣管移植提供了一些基礎(chǔ)，但仍需要長期的實驗研究，將來才有望應(yīng)用于臨床。GIRALDO-GOMEZ等[33]使用胰蛋白酶法對長段豬氣管進行脫細胞處理，HE染色與DNA殘留含量定量分析表明氣管腔內(nèi)無細胞成分及DAN含量明顯減少；抗原性消失；掃描電鏡顯示膠原纖維在軟骨周圍組織中保留下來；生物力學結(jié)果證實脫細胞氣管基質(zhì)與正常氣管兩者的機械性能無顯著性差異；細胞跟蹤和活力分析顯示軟骨細胞在接種8 d后依然保持軟骨細胞特征形態(tài)及活力。該研究表明胰蛋白酶制備的脫細胞氣管基質(zhì)可作為氣管替代物，但體內(nèi)移植效果需要進一步的實驗研究來驗證。OHNA等[34]利用高靜水壓技術(shù)對豬氣管進行脫細胞處理后進行體內(nèi)移植，術(shù)后6個月和12個月研究發(fā)現(xiàn)氣管腔被脫細胞氣管補片修復，周圍有再生軟骨，部分均勻地結(jié)合到脫細胞氣管補片中，誘導了氣管重構(gòu)。但是過高的壓力會導致蛋白質(zhì)變性，影響脫細胞氣管基質(zhì)的生物力學性能，因此，選擇合適的壓力至關(guān)重要。LANGE等[35]通過將真空脫細胞法制備的脫細胞豬氣管，與正常氣壓下制備的脫細胞豬氣管進行對比，結(jié)果顯示：與對照組相比，真空脫細胞法制備的脫細胞氣管完全清除纖毛上皮細胞和軟骨細胞，殘留的DNA少，膠原蛋白、糖胺聚糖含量及生物力學性能無明顯差異。隨后，他們將用真空脫細胞法制備的脫細胞人氣管埋植到大鼠體內(nèi)14 d，研究發(fā)現(xiàn)氣管支架均保持良好的形態(tài)，未出現(xiàn)免疫排斥反應(yīng)等不良反應(yīng)。BULTER等[36]將通過真空脫細胞法制備的脫細胞人氣管與去污劑聯(lián)合酶法所制的脫細胞人氣管進行比較，研究發(fā)現(xiàn)兩者脫細胞效果相似，雞絨毛尿囊膜和皮下植入實驗證實了脫細胞氣管基質(zhì)不僅促進血管向內(nèi)生長，同時具有較好的生物相容性。真空脫細胞法制備周期短(約9 d)，成本相對較低，但在負壓影響下組織結(jié)構(gòu)會發(fā)生膨脹，且細胞黏附情況、糖胺聚糖丟失影響、原位移植效果仍需要通過實驗來進一步研究，最終形成真空脫細胞法的標準程序以便將來應(yīng)用在臨床上解決氣管替代物缺乏的難題。

3.2 脫細胞技術(shù)在臨床中的應(yīng)用MACCHIARINI等[37]2008年在《柳葉刀》雜志上報道了首例由去污劑聯(lián)合酶法制備的脫細胞氣管移植病例?；颊咭蚍谓Y(jié)核浸潤導致左主支氣管塌陷引起嚴重的呼吸困難，他們將人供體氣管通過去污劑聯(lián)合酶法進行25個周期的脫細胞處理后，去除了細胞、HLA和MHC抗原并保留細胞外基質(zhì)，同時將患者自身上皮細胞與間充質(zhì)干細胞來源的軟骨細胞種植到脫細胞氣管內(nèi)表面，最后進行左主支氣管重建。術(shù)后第4天細胞學分析表明腔內(nèi)有大量上皮細胞，纖毛中見到軟骨細胞。術(shù)后4個月隨訪顯示：患者恢復可，未服用免疫抑制藥物，可進行正常生活，肺功能檢測在正常范圍內(nèi)，CT提示氣管通暢、無塌陷。該案例雖然取得了成功，但組織工程氣管的血供及如何在氣管內(nèi)外表面均勻且高效種植細胞等問題仍需要進一步研究。GONFIOTTI等[38]報道了該患者5年隨訪結(jié)果顯示：患者正常生活，肺功能檢測在正常范圍內(nèi)，未出現(xiàn)免疫排斥反應(yīng)及癌變等情況。1年后支氣管鏡檢查發(fā)現(xiàn)吻合口處出現(xiàn)進行性瘢痕狹窄，需要反復進行腔內(nèi)支架置入術(shù)。然而，組織工程化氣管仍保持開放，血管化良好，呼吸道上皮細胞重新形成，纖毛功能和黏液清除功能正常。因此，通過去污劑聯(lián)合酶法制備的人脫細胞氣管與自體上皮細胞和干細胞共培養(yǎng)后用于長段氣管病變的修復重建是可行的，但由于制備周期長，且移植后基質(zhì)機械性能下降容易導致狹窄、塌陷等并發(fā)癥，未能在臨床上廣泛推廣和應(yīng)用。ELLIOTT等[39]報道了一例12歲患兒因長段先天性氣管狹窄進行氣管移植的病例。術(shù)前他們將骨髓間充質(zhì)干細胞種植到脫細胞氣管上，隨后移植到患兒體內(nèi)。術(shù)后予以注射轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)促進軟骨生成及人類重組促紅細胞生成素(erythropoietin，EPO)促進血管生成。術(shù)后1周脫細胞氣管已重新血管化，1年后細胞學檢查提示氣管腔已上皮化，18個月后部胸部CT掃描和通氣-灌注掃描均正常。在隨訪的2年中，患者呼吸功能正常，已正常生活。之后研究者們陸續(xù)報道了兒童脫細胞氣管移植案例，但兒童脫細胞氣管移植的難點在于移植物需要適應(yīng)生長的需要及如何快速的血管化。因此，對所有年齡段的兒童進行氣管移植，移植物生長的實驗證據(jù)收集對臨床至關(guān)重要。

4 展望

組織工程學是一門結(jié)合工程學、材料學和生命科學相結(jié)合的的交叉學科，用于替代、修復或改善人體組織器官的形態(tài)和功能[40]。組織工程氣管旨在替換或再生人體氣管組織，以恢復長段氣管損傷患者正常的呼吸功能。組織工程氣管三個關(guān)鍵因素包括細胞外基質(zhì)、細胞和生物反應(yīng)器，其中細胞外基質(zhì)是氣管功能重建的基礎(chǔ)。利用脫細胞技術(shù)制備的脫細胞氣管基質(zhì)已得到廣泛認可，不僅可以保留細胞外基質(zhì)、去抗原性、具有良好的生物相容性和力學性能，且可支持種植細胞的黏附、增殖、分化，最終實現(xiàn)組織功能修復和結(jié)構(gòu)重塑。但目前脫細胞技術(shù)研究主要停留在動物實驗階段，應(yīng)用于臨床上仍需進一步的研究，氣管脫細胞過程中仍有許多問題亟待解決[9]，譬如：如何縮短脫細胞周期和降低成本；如何更好地清除細胞成分和維持基質(zhì)穩(wěn)定性和完整性；如何更好地促進種植細胞的黏附和生長；如何更好地將生物方法、化學方法與物理方法三者結(jié)合使用進一步提高脫細胞效率。目前有將脫細胞氣管支架與其他氣管支架聯(lián)合使用用于氣管移植。TAN等[41]將豬脫細胞真皮基質(zhì)與鎳鈦合金支架構(gòu)建成復合氣管支架，用于替代治療1例晚期肺癌侵犯左主支氣管的患者。術(shù)后患者恢復良好，支氣管鏡檢查及活檢結(jié)果顯示術(shù)后4個月復合氣管支架完全血運重建和再上皮化，未發(fā)生與氣管替代物植入的相關(guān)并發(fā)癥。

相信隨著組織工程氣管及脫細胞技術(shù)的進一步發(fā)展，其可以不斷改善氣管基質(zhì)的缺陷，優(yōu)化氣管基質(zhì)的性能，同時與其他氣管基質(zhì)結(jié)合使用，構(gòu)建出安全、高效的氣管基質(zhì)，為解決臨床上長段氣管替代物缺乏提供有效的途徑，減輕患者的痛苦，提高生活質(zhì)量。