供者淋巴細胞輸注治療無效的移植后復(fù)發(fā)患者過繼性回輸NK細胞的免疫學(xué)變化和臨床療效①

曹勛紅 王志東 韓 偉 陳育紅 唐菲菲 孫于謙 王景枝 許蘭平 張曉輝 王 昱 劉開彥 黃曉軍 趙翔宇（北京大學(xué)人民醫(yī)院，北京大學(xué)血液研究所，國家血液系統(tǒng)疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，北京 100044）

異基因造血干細胞移植（allogeneic hematopoietic stem cell transplantation，allo-HSCT）是治療惡性血液病有效甚至唯一的手段，但移植后復(fù)發(fā)仍是移植后主要并發(fā)癥，影響移植療效。目前移植后復(fù)發(fā)常規(guī)治療方式包括化療、聯(lián)合供者淋巴細胞回輸（donor lymphocyte infusion，DLI）等，但DLI雖能明顯緩解移植后復(fù)發(fā)，卻增加了回輸后移植物抗宿主病（graft versus host disease，GVHD）發(fā)生風險。

NK細胞是機體重要的天然免疫細胞，在免疫監(jiān)視和腫瘤清除過程中起重要作用。RUGGERI等［1］證實殺傷免疫球蛋白（KIR）配體不相合的異基因NK細胞在急性髓系白血?。╝cute myelogenous leukemia，AML）患者中可發(fā)揮促進植入、抗急性移植物抗宿主病（acute graft versus host disease，aGVHD）和抗腫瘤作用。MILLER等［2］研究報道，異基因NK細胞治療在難治復(fù)發(fā)AML患者體內(nèi)有較好的安全性和一定療效。但受限于人體NK細胞數(shù)較少，NK細胞臨床應(yīng)用受到限制。MASUYAMA等［3］建立了CD3聯(lián)合CD52單抗體外誘導(dǎo)供者來源NK細胞的擴增方法，臨床前研究證實其具有抗腫瘤作用。本研究采用CD3聯(lián)合CD52單抗體外誘導(dǎo)移植供者來源NK細胞擴增，并將其回輸給DLI無效的移植后復(fù)發(fā)急性白血病患者，初步研究NK細胞回輸至移植后復(fù)發(fā)患者體內(nèi)的免疫學(xué)變化及臨床療效。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 入組病例及標準 入組患者8例，入組條件為2011年2月至2014年1月于北京大學(xué)血液病研究所進行allo-HSCT且移植后復(fù)發(fā)患者，患者主要臨床特點見表1。

1.1.2 預(yù)處理方案 全部采用常規(guī)改良BU/CY（白消安/環(huán)磷酰胺）方案，HLA配型不合移植預(yù)處理中加用抗胸腺細胞球蛋白（ATG）［4］。

1.1.3 干細胞動員和采集 全部患者采用骨髓聯(lián)合外周血干細胞移植，所有患者均以G-CSF動員5～6 d（-3 d開始），劑量為5μg/kg［5-6］。

1.1.4 aGVHD預(yù)防 采用環(huán)孢素（CsA）聯(lián)合霉酚酸酯（MMF）及短程甲氨蝶呤（MTX）方案［7］。

1.1.5 植活標準 連續(xù)3 d中性粒細胞絕對值（ANC）≥0.5×109L-1為粒細胞植活，連續(xù)7 d PLT≥20×109L-1為血小板植活［8］。

1.1.6 主要試劑 6色抗體組合：CD3-Percpcy5.5、CD62L-FITC（美國Becton Dickinson公司）；CD56-APCCY7、CD57-Pacific Blue（美國Biolegend公司）；CCR7-PECY7、NKG2C-PE（美國RD$systems公司）；8色抗體組合：CD3-Amcyan、CD56-APCCY7、CD57-Pacific Blue、KIR-FITC、NKG2A-PE、NKG2D-Percpcy5.5、NKp30-APC，NKp46-PECY7（美國BD Bioscience公司）；CD107a-藻紅蛋白（phycoerythrin，PE）及莫能霉素、Cytofix/Cytoperm試劑盒（美國Becton Dickinson公司）。

1.2 方法

1.2.1 NK細胞富集、擴增 采集健康供者來源外周血40 ml，提取單個核細胞，經(jīng)抗CD3（0.1μg/ml）和抗CD52單克隆抗體（20μg/ml）于T-225瓶中共同刺激4 d，轉(zhuǎn)至新開發(fā)的含自體血漿和IL-2的NKGM-1培養(yǎng)基培養(yǎng)14 d，每3 d更換1次含IL-2的新鮮培養(yǎng)基［3］。流式分選擴增后的CD3-CD56+平均活率為94.475%，擴增后NK細胞平均占比為44.35%，8例患者NK細胞及T細胞擴增占比及回輸給患者的細胞數(shù)量見表2。

表2 入組患者NK細胞擴增活率、比例及回輸數(shù)量Tab.2 Expansion rates，ratio and number of NK cellsinfused into enrolled patients

1.2.2 標本留取 ①留取供者培養(yǎng)前及擴增后的NK細胞，流式監(jiān)測NK細胞擴增前后數(shù)目、比例、凋亡及表型變化；②留取回輸后5周內(nèi)外周血，1次/周，流式細胞術(shù)分別檢測CD3-CD56+NK細胞亞群動力學(xué)變化，同時檢測NK細胞IFN-γ分泌水平及殺傷活性。

1.2.3 流式細胞術(shù)檢測

1.2.3.1 NK細胞表型檢測 ①取全血100～200μl，加入6色抗體組合：CD3-Percpcy5.5、CD62L-FITC、CD56-APCCY7、CD57-Pacific Blue、CCR7-PECY7、NKG2C-PE，避光孵育30 min，溶血，PBS洗滌后上機檢測；②取全血100～200μl，加入8色抗體組合：CD3-Amcyan、CD56-APCCY7、CD57-Pacific Blue、KIR-FITC、NKG2A-PE、NKG2D-Percpcy5.5、NKp30-APC，NKp46-PECY7，避光孵育30 min，溶血，PBS洗滌后上機檢測；③NK細胞擴增前后表型抗體組合見文獻［9］。

1.2.3.2 NK細胞抗白血病功能檢測 采用淋巴細胞分離液提取外周血單個核細胞（mononuclear cells of peripheral blood，PBMC）計數(shù)，調(diào)整細胞濃度為1×106個/ml，設(shè)實驗孔及對照孔各2個，200μl/孔接種于96孔板，給予IL-2 1 000 U/ml孵育過夜，實驗孔加入K562細胞（與PBMC比例為5∶1），對照孔加入等體積RPMI1640培養(yǎng)基，同時每孔加入CD107a-PE及莫能霉素0.14μl孵育4 h后終止孵育，采用5色熒光標記技術(shù)標記膜表面標記及細胞內(nèi)抗原表達。所用細胞膜表面免疫熒光包括CD56-APCCY7、CD57-Pacific Blue、KIR-FITC，按照Cytofix/Cytoperm試劑盒說明固定破膜后標記細胞內(nèi)免疫因子IFN-γ。

1.2.4 患者移植后微小殘留病（minimal residual disease，MRD）監(jiān)測 伴有重現(xiàn)性染色體異常的急性白血病患者，以其特征性標志基因（如ETO）作為監(jiān)測指標，＞0.4%為陽性［9］；無特征性標志基因的急性白血病患者，采用WT1基因作為監(jiān)測指標，＞0.6%為陽性［10］。同時采用流式細胞術(shù)檢測白血病相關(guān)免疫表型（leukemia-associated aberrant immune phenotypes，LAIPs）。于移植后1個月、2個月、3個月、4.5個月、6個月、9個月、12個月監(jiān)測MRD，出現(xiàn)1次基因或LAIPs陽性的患者需在2周后復(fù)查。間隔2周連續(xù)2次出現(xiàn)基因/LAIPs陽性或同時出現(xiàn)基因和LAIPs陽性為MRD陽性，即分子生物學(xué)復(fù)發(fā)；骨髓中原始細胞＞5%為血液學(xué)復(fù)發(fā)。入組標準：復(fù)發(fā)患者（血液學(xué)復(fù)發(fā)和/或分子生物學(xué)復(fù)發(fā)）可給予DLI，DLI后療效不滿意患者給予NK細胞回輸治療。給予DLI和NK細胞回輸治療后繼續(xù)監(jiān)測MRD。所有患者知情同意。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用GraphPad Prism 8.0及R軟件分析數(shù)據(jù)，采用非配對T檢驗進行單因素分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 入組患者臨床特點 本研究中4例接受了同胞HLA全相合allo-HSCT，4例接受了同胞HLA單倍型相合allo-HSCT，男5例，女3例。7例移植時處于完全緩解狀態(tài)；1例移植前為復(fù)發(fā)狀態(tài)?；颊呓邮艿?次供者來源NK細胞回輸?shù)闹形粫r間為移植后745.5 d。2020年5月隨訪終止時，共有5例患者死亡：患者1的直接死因為中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染，患者2死于移植后血栓性微血管?。╰hrombotic microangiopathy，TMA），患者7為重癥肺炎導(dǎo)致的呼吸衰竭，患者6和8為血液學(xué)復(fù)發(fā)。

2.2 預(yù)后 4例治療有反應(yīng)。病例3：難治復(fù)發(fā)AML患者，同胞全合移植后18月余再次出現(xiàn)骨髓MRD陽性，伴髓外復(fù)發(fā)（皮膚），右大腿后側(cè)結(jié)節(jié)持續(xù)20余天，因放化療不耐受，接受NK細胞回輸治療，共計回輸NK細胞5次，前2次NK細胞回輸前聯(lián)合HAA化療，每次間隔時長為3～5個月，回輸后序貫IL-2一百萬單位注射2周，第1次NK細胞，回輸后結(jié)節(jié)消退，MRD轉(zhuǎn)陰，無其他不良反應(yīng)，至今患者無白血病長期生存；病例4：單倍型移植后6個月AML患者骨穿MLL-MLL基因持續(xù)陽性，NK細胞回輸治療共計1次，回輸前無化療，回輸后MLL-MLL基因轉(zhuǎn)為陰性，無其他不良反應(yīng)，至今患者無白血病長期生存；病例5：單倍型移植后26月骨髓增生異常綜合征（MDS）患者，MRD由陰性轉(zhuǎn)為陽性，為異常髓系幼稚細胞，經(jīng)過化療（AA方案）聯(lián)合供者淋巴細胞回輸治療后2個月復(fù)查骨髓仍FCM陽性，因此接受NK細胞治療，共計回輸3次，每次間隔2個月，第1次回輸后骨髓FCM即轉(zhuǎn)陰，無其他不良反應(yīng)，至今患者無白血病長期生存；病例7：同胞全合移植后13月余B-ALL患者，骨穿WT1由陰性轉(zhuǎn)為陽性，F(xiàn)CM結(jié)果提示有異常髓系幼稚細胞，經(jīng)過化療聯(lián)合供者淋巴細胞回輸2個月復(fù)查骨穿WT1仍為1.1%，接受NK細胞治療，共計回輸5次，前3次回輸前聯(lián)合COPD方案化療，每次間隔2個月左右，第2次回輸后WT1為0.23%，但第3次回輸后骨髓FCM表型異常且WT1為0.88%，因WT1和免疫殘留持續(xù)陽性，DLI后隨之行第4、5次NK細胞回輸，第5次回輸后WT1為0.17%，骨髓FCM轉(zhuǎn)陰，回輸過程中無其他不良反應(yīng)，但在allo-HSCT后1年死于重癥肺炎導(dǎo)致的呼吸衰竭；4例治療無反應(yīng)：病例1、2、6、8，其中1例為持續(xù)MRD陽性，3例為血液學(xué)復(fù)發(fā)，經(jīng)過NK細胞聯(lián)合化療或DLI治療后分子學(xué)及血液學(xué)復(fù)發(fā)指標均未得到緩解?；颊?：難治復(fù)發(fā)AML患者，同胞全合移植后30個月，腦脊液（cerebrospinal fluid，CSF）-FCM陽性，骨髓FCM表型異常，第1次FLAG化療序貫NK細胞回輸治療后CSF-FCM轉(zhuǎn)陰，骨髓FCM轉(zhuǎn)陰，回輸后2個月骨髓FCM復(fù)陽，行HAA方案化療聯(lián)合2次NK細胞回輸，此后骨髓及腦脊液FCM仍復(fù)陽，回輸期間無不良反應(yīng)，最終因中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染死亡；患者2：單倍型移植后24個月B-ALL患者，回輸前骨髓原始細胞占7%，增生V級，DLI治療后2個月共計回輸NK細胞2次，回輸后因持續(xù)粒缺未評估，最終因重度GVHD及TMA死亡；患者6：MRD持續(xù)陽性AML患者，單倍型移植后15月余AML1-ETO為98.7%，接受NK細胞回輸治療，回輸前無化療，共計回輸1次，回輸后降至3.5%，無其他不良反應(yīng)，最終死于血液學(xué)復(fù)發(fā)；患者8：難治復(fù)發(fā)AML患者，同胞全合移植后4月余ETO為56%，外周原始細胞占50%，DLI后行NK細胞回輸治療，共計回輸1次，回輸前未接受化療，回輸后再次給予化療，無其他不良反應(yīng)，肝臟GVHD未加重，但最終死于血液學(xué)復(fù)發(fā)。

2.3 體外擴增NK細胞的生物學(xué)特性 采用CD3聯(lián)合CD52單抗方法體外擴增健康供者外周血來源NK細胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，供者來源NK細胞擴增后表型以早期不成熟亞群為主，主要表現(xiàn)為NKG2A+NK細胞培養(yǎng)后明顯增加，而CD57+亞群明顯下降，CD3-CD56dimCD57+KIR+擴增前后差異無統(tǒng)計學(xué)意義（圖1A）。NK細胞功能發(fā)揮取決于活化型及抑制性受體平衡，采用流式細胞術(shù)監(jiān)測擴增前后NK細胞活化型受體及抑制性受體變化（圖1B、C），擴增后NK細胞表面NKG2D、DNAM-1及NKP30平均熒光強度明顯上調(diào)，同時，抑制性受體CTLA-4、PD-1、Tim-3及Tigit平均熒光強度表達擴增后也明顯增強。由于CD69及CD25在NK細胞高表達可分別指示NK細胞殺傷能力及增殖水平提升，本研究對此進行評估并發(fā)現(xiàn)擴增后NK細胞表面CD25及CD69平均熒光強度明顯高于擴增前，提示擴增后NK細胞被活化（圖1E、F）。NK細胞組織異質(zhì)性高且在不同組織臟器中發(fā)揮重要作用，其體內(nèi)循環(huán)與表面趨化型因子表達密切相關(guān)，本研究發(fā)現(xiàn)擴增后NK細胞表面CXCR3、CX3CR1及4-1BB平均熒光強度較擴增前明顯增強，說明擴增的NK細胞組織趨化能力提升（圖1D）。

圖1 NK細胞擴增前后表型變化Fig.1 Phenotype changes before and after expansion of NK cells

2.4 NK細胞體內(nèi)回輸后淋巴細胞數(shù)量動力學(xué)變化 所有接受NK細胞回輸后的病例白細胞總數(shù)及淋巴細胞總數(shù)恢復(fù)動態(tài)規(guī)律如圖2A、B所示，其在有反應(yīng)患者與無反應(yīng)患者中恢復(fù)規(guī)律無明顯差異。而有反應(yīng)組患者（病例3、4、5、7）T細胞比例（占淋巴細胞百分比）在與無反應(yīng)患者相比無明顯規(guī)律，但回輸后第2周除病例8外，無反應(yīng)組T細胞比例均低于有反應(yīng)組（圖2C），尤其是回輸后前3周無反應(yīng)組T細胞比例低于有反應(yīng)組（圖2D），說明回輸后T細胞也可能參與抗腫瘤作用。

圖2 NK細胞回輸后體內(nèi)各細胞數(shù)量動力學(xué)變化Fig.2 Dynamic changes of other cell number in vivo after NK cell infusion

2.5 NK細胞回輸后體內(nèi)亞群動力學(xué)變化 有反應(yīng)組（病例3、4、7）CD56brightNK細胞亞群整體恢復(fù)水平明顯高于無反應(yīng)組（病例1、2、6），而無反應(yīng)組患者8的CD56brightNK細胞亞群恢復(fù)效果中整體水平高于有反應(yīng)組病例5（圖3A），各病例CD56dimNK細胞亞群恢復(fù)趨勢與CD56brightNK細胞相反（圖3B）。NK細胞表面NKG2A表達與NK細胞治療后反應(yīng)無明顯相關(guān)性，治療無反應(yīng)組病例6及病例1NKG2A亞群分布在NK細胞回輸治療后始終處于較低水平，雖然病例1治療1周后NKG2A表達約達60%，但治療后第2周迅速下降，而后在3、4周維持在30%左右，其他病例則在回輸治療后5周內(nèi)維持相對較高水平，變化趨勢也較為平穩(wěn)（圖3C）。CD57+NK細胞亞群的病例恢復(fù)趨勢與KIR+NK細胞一致，即有反應(yīng)組（病例4、5、7）亞群水平明顯高于無反應(yīng)組，提示NK回輸治療后對腫瘤細胞的殺傷可能依賴于成熟NK細胞亞群功能發(fā)揮；進一步亞群成熟度分析也提示無反應(yīng)組（病例1、2、8）CD56dimNKG2A-CD57-KIR-比例明顯高于有反應(yīng)組（病例3、4、5、7），兩組間其他亞群趨勢變化無規(guī)律（圖4A、B）。

圖3 NK細胞回輸后體內(nèi)亞群動力學(xué)變化Fig.3 Dynamic changes of NK subsets in vivo post NK cells refusion

圖4 回輸后無反應(yīng)和有反應(yīng)患者不同時間點不同成熟度NK細胞亞群（CD56bright、CD56dimNKG2A+、CD56dimNKG2AKIR-CD57+、CD56dimNKG2A-KIR-CD57-、CD56dimNKG2AKIR+CD57-、CD56dimNKG2A-KIR+CD57+）動態(tài)變化Fig.4 Different maturity levels of NK subsets（CD56bright，CD56dimNKG2A+，CD56dimNKG2A-KIR-CD57+，CD56dim NKG2A-KIR-CD57-，CD56dim NKG2A-KIR+CD57-，CD56dimNKG2A-KIR+CD57+）at different time points between patients with response to NK infusion and those without response

2.6 NK細胞回輸后的活化型受體及功能動力學(xué)變化 NK細胞回輸后治療反應(yīng)良好病例3、4、5、7的NKG2D、NKp30及NKp46占NK細胞比例均明顯高于無反應(yīng)治療患者，均在60%以上，且隨著移植時間推移，治療反應(yīng)良好病例上述水平呈上升趨勢。而NKG2C占NK細胞的比例在治療反應(yīng)良好組與無反應(yīng)治療組未顯示差異性趨勢。NK細胞治療有反應(yīng)病例（病例3、4、5、7）CD107a在NK細胞中的表達趨勢明顯高于治療無反應(yīng)患者。而NK細胞IFN-γ分泌水平在NK細胞治療后趨勢并不明顯，NK細胞分泌IFN-γ的水平除病例4在第3周達到峰值，且明顯高于其他患者分泌水平，但其在第4周又驟降至基線水平，基本恢復(fù)至其他7例在NK細胞治療過程中的基準（圖5）。

圖5 NK細胞回輸后活化型受體NKG2D、NKp30、NKp46、NKG2C動力學(xué)變化及細胞脫顆粒、IFN-γ因子分泌能力變化Fig.5 Dynamic changes of activated receptors NKG2D，NKp30，NKp46，NKG2C and degranulation and secretion of IFN-γafter NK adoptivetransfer

2.7 安全性評價 病例2接受NK細胞治療前有活動性GVHD和TMA，NK細胞治療后GVHD和TMA無明顯變化，病例3、6的GVHD癥狀在NK細胞回輸治療后明顯緩解，其中1例回輸前全身皮膚菲薄，雙上肢散在紅色皮疹，口腔內(nèi)多發(fā)潰瘍，回輸后cGVHD活動性癥狀緩解；另一例移植后慢性GVHD肝臟表現(xiàn)，回輸后癥狀緩解，提示NK細胞治療可能發(fā)揮抗GVHD功能，需進一步研究。

3 討論

NK細胞是機體重要的天然免疫細胞，無需預(yù)先致敏便可識別殺傷腫瘤細胞和病毒感染的細胞，在免疫監(jiān)視和腫瘤清除過程中起重要作用。HLA半相合健康供者由于缺少部分NK細胞免疫球蛋白受體，部分減弱了抑制性受體對NK細胞功能的影響，可更好發(fā)揮腫瘤殺傷能力，因此增強NK細胞功能或過繼性回輸NK細胞療法已逐漸成為造血干細胞移植中抗白血病治療的重要觀念［11］。目前研究認為，體內(nèi)NK細胞與腫瘤細胞效靶比越高，清除腫瘤能力越強。健康人群獲取的NK細胞數(shù)有限，越來越多體外擴增技術(shù)興起彌補了NK細胞數(shù)不足的問題。MASUYAMA等［3］通過CD3聯(lián)合CD52單抗體外刺激人外周血單核細胞后發(fā)現(xiàn)，NK細胞擴增效率高，抗腫瘤功能增強，該體系的建立摒棄了耗時的去T細胞步驟及體外飼養(yǎng)層細胞準備，但該技術(shù)擴增的NK細胞在保證安全性前提下是否對人類具有一定治療效果尚無報道。基于此，課題組對移植后復(fù)發(fā)或持續(xù)MRD陽性患者過繼性回輸體外供者來源NK細胞，并監(jiān)測了回輸后5周內(nèi)NK細胞亞群及功能動力學(xué)變化，初步探討以CD3聯(lián)合CD52單擴增的NK細胞在體內(nèi)的動態(tài)變化及臨床療效。

本研究提示，以CD3聯(lián)合CD52單抗對NK細胞的體外擴增效率高，殺傷功能強，從目前8例結(jié)果來看，有3例MRD陽性患者于NK細胞回輸治療后轉(zhuǎn)陰，1例髓外（皮膚）緩解，但對血液學(xué)復(fù)發(fā)無效，對中樞神經(jīng)系統(tǒng)白血病復(fù)發(fā)有待進一步研究。提示NK細胞主要優(yōu)勢是清除體內(nèi)微小殘留病，而對血液學(xué)復(fù)發(fā)患者療效不佳。ZHAO等［12］在小鼠NCG血液瘤模型中過繼性回輸經(jīng)mbIL-21/4-1BBL擴增的NK細胞證實，大劑量和連續(xù)多次回輸NK細胞有利于腫瘤清除，臨床研究也證實，對鞏固治療期間持續(xù)微小殘留病陽性患者接受氟達拉濱聯(lián)合環(huán)磷酰胺預(yù)處理或常規(guī)鞏固治療聯(lián)合單倍型供者來源NK細胞回輸可誘導(dǎo)50%～60%微小殘留病轉(zhuǎn)陰，且無明顯不良反應(yīng)。雖然MILLER等［2］研究表明過繼性NK細胞回輸治療難治復(fù)發(fā)患者取得了一定療效，但誘導(dǎo)難治復(fù)發(fā)白血病患者緩解率也僅有20%～30%，提示NK細胞抗白血病治療仍有較大提升空間，通過改造NK細胞提高其體內(nèi)存活時間，或通過多次、高劑量NK細胞回輸有望提高NK細胞抗腫瘤能力。

NK細胞活化功能可分為兩方面：一是基于NK細胞成熟度而定，隨著NK細胞發(fā)育分化成熟，細胞殺傷能力逐漸增強；二是取決于其表面活化型受體與抑制型受體平衡。本研究中，NK細胞成熟指標CD57及KIR表達在有反應(yīng)組均明顯高于無反應(yīng)組，提示腫瘤個體異質(zhì)性對NK細胞影響不一，也從側(cè)面反映腫瘤負荷減低可能與回輸后NK細胞成熟度有關(guān)［13］。同時，NK細胞表面活化型受體NKp30、NKp46及NKG2D表達在有反應(yīng)組均明顯高于無反應(yīng)組，說明NK殺傷能力指標CD107a分泌水平也在有反應(yīng)組趨勢較高，進一步說明回輸后活化型受體占比更多的NK細胞在腫瘤細胞患者中預(yù)后更好［14-15］。提示腫瘤清除可能與NK細胞功能恢復(fù)相關(guān)，與KHAZNADAR等［16］報道一致，即NK細胞采用免疫調(diào)節(jié)劑恢復(fù)部分功能后，與AML細胞系接觸增多，殺傷作用增強。

移植后復(fù)發(fā)患者采用過繼性NK細胞回輸治療，無不良反應(yīng)，且2例患者慢性GVHD癥狀緩解，提示安全性良好，但由于樣本量較少，且CD3聯(lián)合CD52體外擴增NK細胞的策略與目前其他飼養(yǎng)層細胞的擴NK細胞策略是否有明顯優(yōu)越性尚不可知。YANG等［17］通過RNA-seq技術(shù)探究兩種不同擴增體系的NK細胞轉(zhuǎn)錄本差異，發(fā)現(xiàn)221-mIL-21飼養(yǎng)層細胞擴增的NK細胞相較K562-mIL-21擴增的NK細胞分化程度更低，記憶性更高，說明不同擴增體系除影響NK細胞擴增效率，也影響擴增NK細胞自身生物學(xué)功能。提示后續(xù)評估NK細胞治療效率時，應(yīng)考慮不同擴增體系對NK細胞的影響。本研究擴增體系提示NK細胞明顯活化且組織趨化能力上調(diào)，NK細胞表面抑制性受體PD-1、Tim-3、CTLA4及Tigit熒光表達強度明顯上調(diào)。PD-1、Tim-3、CTLA-4及Tigit是阻斷T細胞及NK細胞免疫功能的重要耗竭性受體［18-20］。但也有研究認為Tim-3及Tigit在NK細胞的表達是NK細胞功能活化及成熟的重要指標，因此，需綜合評估擴增后NK細胞表面耗竭性受體表達上調(diào)對NK細胞功能的影響［21-22］。另外，本研究未充分評估對NK細胞回輸后其他免疫細胞如T細胞、B細胞、DC及巨噬細胞等表型及功能，已有研究發(fā)現(xiàn)T細胞、DC及巨噬細胞能直接或間接影響NK細胞發(fā)育成熟、細胞毒因子分泌功能［23-24］。NK細胞回輸后其他免疫細胞是否參與增強有反應(yīng)組NK細胞功能值得進一步研究。

總之，本研究對CD3聯(lián)合CD52單抗體外擴增NK細胞后，過繼性回輸治療移植復(fù)發(fā)患者后的免疫學(xué)變化進行了初步探討，臨床應(yīng)用的安全性和有效性尚需擴大樣本量及重新設(shè)計臨床研究進一步探討。