山柰酚調(diào)控Wnt/β-catenin途徑對前列腺癌小鼠T細胞的影響及作用機制

瞿小祥 孔東波 魯小紅 江波濤 鄒 偉 查文良 （咸寧市中心醫(yī)院泌尿外科，咸寧 437100）

前列腺癌是男性最常被診斷出的惡性腫瘤之一，也是癌癥相關(guān)死亡的第二大誘因［1］。研究顯示部分患者會發(fā)展為去勢抵抗性前列腺癌（castrationresistant prostate cancer，CRPC），CRPC對化療藥物具有較高的抗性和較強的轉(zhuǎn)移能力，這是導致治療失敗和死亡的重要因素，且目前尚無治療CRPC的有效方法［2］。免疫抑制在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，臨床表現(xiàn)為CD4+/CD8+降低，使腫瘤細胞免受機體免疫系統(tǒng)清除。最新研究顯示調(diào)控T淋巴細胞亞群可延長CRPC患者生存期［3］。山柰酚（Kaempferol）是一種天然類黃酮類化合物，廣泛存在于水果、蔬菜和傳統(tǒng)草藥中，最近有報道稱山柰酚具有多種癌癥的抗癌作用，如胃癌、乳腺癌和直腸癌等［4-6］，但其在前列腺癌中的作用和機制尚不明確。研究已經(jīng)證實Wnt/β-catenin通路的激活不但參與前列腺癌的進展和轉(zhuǎn)移，還與CRPC密切相關(guān)，而抑制Wnt/β-catenin通路會提高CRPC對化療藥物的敏感性，抑制CRPC的進展［7-8］。近期也有報道顯示山柰酚可通抑制Wnt/β-catenin通路抑制口腔癌細胞的增殖并誘導凋亡［9］。ZENG等［10］研究表明，山柰酚可通過調(diào)控T淋巴細胞的分化調(diào)控免疫。本文主要分析山柰酚調(diào)控Wnt/β-catenin途徑對CRPC小鼠T細胞的影響，為臨床治療前列腺癌提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 人CRPC細胞系PC3（CRL-1435，ATCC公司，美國）；DMEM培養(yǎng)基血清和抗體（Invitrogen公司，美國）；BALB/c裸鼠（上海斯萊克實驗動物中心，中國）；山柰酚、TRIzol（Sigma公司，美國）；一抗和二抗（Abcam公司，美國）；PVDF膜（Bio-Rad公司，美國）；ECL顯色試劑盒（Thermo Fisher公司，美國）；PrimeScript-RT試劑盒和SYBR Premix Ex Taq試劑盒（TaKaRa公司，日本）；蛋白酶K和TUNEL凋亡試劑盒（Roche公司，中國）；ELISA試劑盒（碧云天公司，中國）；流式細胞儀及小鼠CD4+、CD8+表型抗體試劑（Becton Dickinson公司，美國）。

1.2 方法

1.2.1 分組和建模 通過皮下注射的方式構(gòu)建CRPC裸鼠模型，將DMEM培養(yǎng)基中處于對數(shù)生長期的各組PC3細胞重新配制成濃度為1×107個/ml的細胞溶液，所有小鼠于左側(cè)前肢皮下注射細胞溶液0.2 ml，在建模后第7天有瘤體生成提示建模成功。隨機選擇30只建模成功的小鼠，隨機分為對照組、山柰酚低劑量組和山柰酚高劑量組（n=10）。建模后第8天，山柰酚低劑量組和山柰酚高劑量組小鼠使用山柰酚灌胃，劑量分別為15 mg/kg和30 mg/kg［11］。1次/d。在建模后第28天，小鼠稱重，取眼眶血，然后處死小鼠。

1.2.2 腫瘤生長情況觀察 每天觀察腫瘤生長情況，在第28天統(tǒng)計腫瘤體積，用游標卡尺測量皮下腫瘤體積并使用下式計算：腫瘤體積=［（長度×寬度）/2］3×0.523 6。在建模后28 d脫頸處死小鼠，取出腫瘤組織，檢測質(zhì)量。

1.2.3 Western blot檢測增殖和轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白 通過Western blot檢測增殖和轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白CyclinD1、Ki67、MMP2、MMP9，分析細胞增殖和轉(zhuǎn)移能力。將腫瘤組織研磨后收集總蛋白并通過BCA試劑盒檢測濃度。應用SDS-PAGE（110 V，100 min）分離30μg總蛋白。分離后，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜，并在膜上添加1∶500稀釋的anti-CyclinD1、anti-Ki67、anti-MMP2和anti-MMP9抗體并孵育過夜。然后在室溫下加入1∶5 000稀釋的HRP標記的二抗，4℃下孵育2 h。通過ECL檢測蛋白印跡帶。以GAPDH為內(nèi)參，通過檢測灰度定量分析目標蛋白的表達水平。

1.2.4 TUNEL染色檢測凋亡 小鼠經(jīng)過頸椎脫臼處死，收集腫瘤組織并置于多聚甲醛中固定48 h。將固定好的組織樣本利用梯度濃度的乙醇脫水，然后加入二甲苯進行透明處理并以石蠟包埋，使用切片機切成4μm厚的切片。切片水化后制成玻片標本，加入蛋白酶K（20μg/ml）消化，然后按照試劑盒說明書加入TUNEL試劑，于37℃孵育1 h。最后加入蘇木精復染。在顯微鏡下觀察細胞，隨機選擇5個高倍視野，計算每個視野的凋亡指數(shù)，取平均值。凋亡指數(shù)（%）=凋亡染色陽性細胞數(shù)目/總細胞數(shù)目×100%。

1.2.5 RT-qPCR檢測mRNA TRIzol提取腫瘤組織總RNA，分別利用PrimeScript-RT試劑盒和SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄（60 min/42℃，5 min/70℃，4℃下保存）和qPCR實驗（95℃/10 min，40個循環(huán)，94℃/15 s，60℃/1 min，60℃/1 min，4℃下保存），以GAPDH為內(nèi)參。通過比較循環(huán)閾值（ΔΔCt）分析RNA表達水平。

1.2.6 Western blot檢測Wnt/β-catenin信號通路

根據(jù)1.2.3方法檢測腫瘤組織中Wnt3a和β-catenin蛋白表達水平。

1.2.7 流式細胞術(shù)檢測 通過眼眶取血法收集小鼠外周血，外周血中細胞分別利用CD4+和CD8+標記并分別加入細胞中，在黑暗中孵育2 h后通過流式細胞儀檢測小鼠外周血中CD4+和CD8+淋巴細胞亞群的百分比。

1.2.8 ELISA檢測外周血中細胞因子水平 將小鼠外周血以2 000 r/min離心20 min后收集上層血清，通過ELISA檢測IFN-γ和IL-2濃度，按照試劑盒說明書方法加入抗體和顯色劑。使用酶標儀檢測450 nm下吸光度，根據(jù)標準曲線計算濃度。

1.3 統(tǒng)計學處理 統(tǒng)計分析使用SPSS19.0軟件。數(shù)據(jù)以±s表示，進行ANOVA方差分析，兩兩比較通過SNK-q檢驗。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 山柰酚對前列腺癌裸鼠模型的抑制作用 建模后第28天三組的腫瘤體積和質(zhì)量比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），山柰酚低劑量組和山柰酚高劑量組的腫瘤體積和質(zhì)量均顯著低于對照組（P＜0.05），且山柰酚高劑量組的腫瘤體積和質(zhì)量顯著低于山柰酚低劑量組（P＜0.05），見表1。

表1 山柰酚對腫瘤體積和質(zhì)量的影響（±s）Tab.1 Effect of Kaempferol on tumor volume and quality（±s）

表1 山柰酚對腫瘤體積和質(zhì)量的影響（±s）Tab.1 Effect of Kaempferol on tumor volume and quality（±s）

Note：Compared with control group，1）P＜0.05；compared with Kaempferol low-dosegroup，2）P＜0.05.

Groups Control Kaempferol low-dose Kaempferol high-dose FP n 10 10 10 Volume/mm3 316.46±28.43 241.92±26.971）180.56±21.561）2）36.643 0.000 Quality/g 0.36±0.05 0.28±0.041）0.21±0.03 1）2）25.117 0.000

2.2 山柰酚對前列腺癌裸鼠模型細胞增殖的影響 Western blot結(jié)果顯示，三組Cyclin D1和Ki67蛋白水平比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），山柰酚低劑量組和山柰酚高劑量組的Cyclin D1和Ki67蛋白水平均顯著低于對照組（P＜0.05），且山柰酚高劑量組Cyclin D1和Ki67蛋白水平均顯著低于山柰酚低劑量組（P＜0.05），見圖1、表2。

表2 山柰酚對前列腺癌裸鼠模型中Cyclin D1和Ki67蛋白的影響（±s）Tab.2 Effect of Kaempferol on Cyclin D1 and Ki67 protein in nude mice model of prostate cancer（±s）

表2 山柰酚對前列腺癌裸鼠模型中Cyclin D1和Ki67蛋白的影響（±s）Tab.2 Effect of Kaempferol on Cyclin D1 and Ki67 protein in nude mice model of prostate cancer（±s）

Note：Compared with control group，1）P＜0.05；compared with lowdose Kaempferol group，2）P＜0.05.

Groups Control Kaempferol low-dose Kaempferol high-dose FP n 10 10 10 Cyclin D1 3.36±0.28 1.97±0.281）1.06±0.091）2）82.694 0.000 Ki67 3.04±0.26 1.82±0.161）0.95±0.081）2）80.275 0.000

圖1 Western blot檢測山柰酚對前列腺癌裸鼠模型中Cyclin D1和Ki67蛋白的影響Fig.1 Western blot to detect effect of Kaempferol on Cyclin D1 and Ki67 protein in nude mice model of prostate cancer

2.3 山柰酚對前列腺癌裸鼠模型細胞轉(zhuǎn)移能力的影響 Western blot結(jié)果顯示，三組MMP2和MMP9蛋白水平比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），山柰酚低劑量組和山柰酚高劑量組的MMP2和MMP9蛋白水平均顯著低于對照組（P＜0.05），且山柰酚高劑量組的MMP2和MMP9蛋白水平顯著低于山柰酚低劑量組（P＜0.05），見圖2、表3。

圖2 Western blot檢測山柰酚對前列腺癌裸鼠模型中MMP2和MMP9蛋白的影響Fig.2 Western blot to detect effect of Kaempferol on MMP2 and MMP9 protein in nude mice model of prostate cancer

表3山柰酚對前列腺癌裸鼠模型中MMP2和MMP9蛋白的影響（±s）Tab.3 Effect of Kaempferol on MMP2 and MMP9 protein in nude mice model of prostate cancer（±s）

表3山柰酚對前列腺癌裸鼠模型中MMP2和MMP9蛋白的影響（±s）Tab.3 Effect of Kaempferol on MMP2 and MMP9 protein in nude mice model of prostate cancer（±s）

Note：Compared with control group，1）P＜0.05；compared with Kaempferol low-dosegroup，2）P＜0.05.

Groups Control Kaempferol low-dose Kaempferol high-dose FP n 10 10 10 MMP2 2.79±0.24 1.43±0.121）0.65±0.061）2）82.694 0.000 MMP9 2.54±0.23 1.21±0.111）0.73±0.071）2）80.275 0.000

2.4 山柰酚對前列腺癌裸鼠模型細胞凋亡的影響 如圖3所示，藍色為被染色的細胞核，棕色為凋亡細胞，如紅色箭頭所示。結(jié)果顯示三組的凋亡指數(shù)比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。山柰酚低劑量組和山柰酚高劑量組腫瘤細胞凋亡指數(shù)顯著高于對照組，且山柰酚高劑量組腫瘤細胞凋亡指數(shù)顯著高于山柰酚低劑量組，見圖3、表4。

表4 山柰酚對前列腺癌裸鼠模型細胞凋亡的影響（±s）Tab.4 Effect of Kaempferol on cell apoptosis in nude mice model of prostate cancer（±s）

表4 山柰酚對前列腺癌裸鼠模型細胞凋亡的影響（±s）Tab.4 Effect of Kaempferol on cell apoptosis in nude mice model of prostate cancer（±s）

Note：Compared with control group，1）P＜0.05；compared with Kaempferol low-dose，2）P＜0.05.

Groups Control Kaempferol low-dose Kaempferol high-dose FP n 10 10 10 Apoptosisindex（%）2.27±0.42 10.05±1.051）17.43±1.891）2）94.822 0.000

圖3 TUNEL染色檢測山柰酚對前列腺癌裸鼠模型細胞凋亡的影響Fig.3 TUNEL staining to detect effect of Kaempferol on cell apoptosis in nude mice model of prostate cancer

2.5 山柰酚對前列腺癌裸鼠模型腫瘤細胞Wnt/βcatenin基因轉(zhuǎn)錄水平的影響 三組腫瘤組織中Wnt/β-catenin基因轉(zhuǎn)錄水平比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），山柰酚低劑量組和山柰酚高劑量組Wnt3a和β-catenin mRNA水平均顯著低于對照組（P＜0.05），且山柰酚高劑量組的Wnt3a和β-catenin mRNA水平均顯著低于山柰酚低劑量組（P＜0.05），見表5。

表5 山柰酚對前列腺癌裸鼠模型腫瘤細胞中Wnt3a和βcatenin mRNA水平的影響（±s）Tab.5 Effect of Kaempferol on levels of Wnt3a andβcatenin mRNA in tumor cells of a nude mice model of prostate cancer（±s）

表5 山柰酚對前列腺癌裸鼠模型腫瘤細胞中Wnt3a和βcatenin mRNA水平的影響（±s）Tab.5 Effect of Kaempferol on levels of Wnt3a andβcatenin mRNA in tumor cells of a nude mice model of prostate cancer（±s）

Note：Compared with control group，1）P＜0.05；compared with Kaempferol low-dose group，2）P＜0.05.

Groups Control Kaempferol low-dose Kaempferol high-dose FP n 10 10 10 Wnt3a 5.84±0.52 3.46±0.351）1.78±0.191）2）162.259 0.00 β-catenin 6.41±0.55 3.75±0.361）1.82±0.201）2）167.522 0.000

2.6 山柰酚對前列腺癌裸鼠模型腫瘤細胞Wnt/βcatenin中蛋白表達水平的影響 三組腫瘤組織中Wnt/β-catenin中蛋白表達比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），山柰酚低劑量組和山柰酚高劑量組Wnt3a和β-catenin蛋白表達均顯著低于對照組（P＜0.05），且山柰酚高劑量組的Wnt3a和β-catenin蛋白表達均顯著低于山柰酚低劑量組（P＜0.05），見圖4、表6。

表6 山柰酚對前列腺癌裸鼠模型腫瘤細胞Wnt/β-catenin中蛋白表達水平的影響（±s）Tab.6 Effect of Kaempferol on protein expression levels of Wnt/β-catenin in tumor cells of nude mice model of prostate cancer（±s）

表6 山柰酚對前列腺癌裸鼠模型腫瘤細胞Wnt/β-catenin中蛋白表達水平的影響（±s）Tab.6 Effect of Kaempferol on protein expression levels of Wnt/β-catenin in tumor cells of nude mice model of prostate cancer（±s）

Note：Compared with control group，1）P＜0.05；compared with Kaempferol low-dosegroup，2）P＜0.05.

Groups Control Kaempferol low-dose Kaempferol high-dose FP n 10 10 10 Wnt3a 3.54±0.33 1.92±0.171）0.91±0.091）2）148.504 0.000 β-catenin 3.42±0.31 2.18±0.201）0.96±0.091）2）146.123 0.000

圖4 Western blot檢測山柰酚對前列腺癌裸鼠模型腫瘤細胞中Wnt3a和β-catenin蛋白水平的影響Fig.4 Western blot to detect effect of Kaempferol on levels of Wnt3a andβ-catenin protein in tumor cells in nude mice model of prostate cancer

2.7 山柰酚對前列腺癌裸鼠模型T淋巴細胞亞群的影響 三組小鼠的CD4+和CD4+/CD8+水平比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），CD8+水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。山柰酚低劑量組和山柰酚高劑量組的CD4+和CD4+/CD8+水平均顯著高于對照組（P＜0.05），且山柰酚高劑量組的CD4+和CD4+/CD8+水平均顯著高于山柰酚低劑量組（P＜0.05），見表7。

表7 山柰酚對前列腺癌裸鼠模型T淋巴細胞亞群的影響（±s，n=10）Tab.7 Effect of Kaempferol on T lymphocyte subsets in nude mice modelsof prostate cancer（±s，n=10）

表7 山柰酚對前列腺癌裸鼠模型T淋巴細胞亞群的影響（±s，n=10）Tab.7 Effect of Kaempferol on T lymphocyte subsets in nude mice modelsof prostate cancer（±s，n=10）

Note：Compared with control group，1）P＜0.05；compared with Kaempferol low-dosegroup，2）P＜0.05.

Groups Control Kaempferol low-dose Kaempferol high-dose FP CD4+（%）14.52±1.18 19.45±1.241）23.81±1.361）2）24.068 0.000 CD8+（%）16.97±1.06 16.21±1.30 15.72±1.44 0.542 0.685 CD4+/CD8+0.86±0.07 1.20±0.111）1.51±0.131）2）31.280 0.000

2.8 山柰酚對前列腺癌裸鼠模型血清中IFN-γ和IL-2水平的影響 三組前列腺癌裸鼠模型血清中IFN-γ和IL-2水平比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），山柰酚低劑量組和山柰酚高劑量組的IFN-γ和IL-2蛋白水平均顯著高于對照組（P＜0.05），且山柰酚高劑量組的IFN-γ和IL-2水平均顯著高于山柰酚低劑量組（P＜0.05），見表8。

表8 山柰酚對前列腺癌裸鼠模型血清中IFN-γ和IL-2水平的影響（±s，ng/ml）Tab.8 Efect of Kaempferol on serum IFN-γand IL-2levelsin nudemicewith prostatecancer（±s，ng/ml）

表8 山柰酚對前列腺癌裸鼠模型血清中IFN-γ和IL-2水平的影響（±s，ng/ml）Tab.8 Efect of Kaempferol on serum IFN-γand IL-2levelsin nudemicewith prostatecancer（±s，ng/ml）

Note：Compared with control group，1）P＜0.05；compared with Kaempferol low-dosegroup，2）P＜0.05.

Groups Control Kaempferol low-dose Kaempferol high-dose FP n 10 10 10 IFN-γ 4.78±0.62 7.23±0.871）9.15±1.121）2）47.198 0.000 IL-2 1.12±0.07 1.40±0.091）1.78±0.111）2）34.275 0.000

3 討論

前列腺癌是男性最常見的惡性腫瘤之一，盡管前列腺癌通?？梢栽谠缙陔A段治愈，但轉(zhuǎn)移的患者必須進行雄激素剝奪治療，而這會使患者發(fā)展為CRPC［12-13］。現(xiàn)階段，治療轉(zhuǎn)移性CRPC的方法主要為基于多西他賽的化療，但由于CRPC具有對藥物的抗性，且轉(zhuǎn)移能力提高，化療對患者的生存的益處極為有限，尋找能有效治療CRPC的藥物和方法具有重要的現(xiàn)實意義［14］。

近年來，植物源性藥物在全世界引起了越來越多的關(guān)注，其具有安全性好、有效性強和副作用小等特點。山柰酚是一種從蔬菜和水果中分離出來的類黃酮化合物，具有廣泛的藥理活性，例如抗炎、抗氧化、抗糖尿病和心臟保護作用［15-16］。近年來，山柰酚的抗腫瘤活性引起了廣泛關(guān)注，并且發(fā)現(xiàn)其可能具有抑制前列腺癌的作用，一項體外研究顯示，在雙氫睪酮存在的條件下，山柰酚能以劑量依賴性方式促進前列腺癌細胞及CRPC細胞凋亡，并可抑制體外血管生成能力［17］。也有體外研究發(fā)現(xiàn)山柰酚可抑制前列腺癌骨轉(zhuǎn)移，但關(guān)于山柰酚對CRPC的體內(nèi)抑制作用尚不明確［18］。本研究利用CRPC細胞系PC3構(gòu)建了荷瘤裸鼠模型，并以低劑量和高劑量的山柰酚干預，結(jié)果顯示山柰酚可劑量依賴性地抑制腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白Cyclin D1、Ki67、MMP2和MMP9表達，誘導細胞凋亡，抑制腫瘤生長。此外，本研究結(jié)果還顯示山柰酚可劑量依賴性地抑制Wnt3a和β-catenin的轉(zhuǎn)錄和翻譯。大量研究已經(jīng)證實Wnt/β-catenin通路在CRPC發(fā)展中的關(guān)鍵作用，Wnt3a是Wnt配體的關(guān)鍵蛋白，其可通過誘導β-catenin活化，從而直接促進Cyclin D1等促癌基因的轉(zhuǎn)錄［19-20］。近年來也有研究表明山柰酚具有調(diào)控Wnt/β-catenin信號的作用，如山柰酚可通過調(diào)控Wnt/β-catenin信號促進牙周膜干細胞的成骨分化［21］。李紅等［9］研究表明山柰酚可通過抑制Wnt/βcatenin通路抑制腔癌KB細胞增殖并誘導其凋亡。黃茂莘等［22］研究發(fā)現(xiàn)山柰酚抑制肝癌細胞增殖和轉(zhuǎn)移的能力與Wnt/β-catenin信號通路密不可分。本研究結(jié)果和既往文獻報道提示山柰酚可抑制CRPC細胞中Wnt3a和β-catenin的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平，從而減少入核的β-catenin蛋白，抑制Cyclin D1、Ki67、MMP2、MMP9等基因的轉(zhuǎn)錄水平，從而調(diào)控增殖和轉(zhuǎn)移相蛋白表達，抑制CRPC細胞的生長和轉(zhuǎn)移并誘導凋亡。

近年來免疫抑制在腫瘤治療中備受重視，在正常生理情況下，T細胞亞群保持在一定的平衡范圍內(nèi)，腫瘤的發(fā)射管會導致CD4+水平降低和CD8+水平升高，從而使腫瘤細胞逃離免疫系統(tǒng)的監(jiān)控，并避免被機體清除［23］。CD4+會分泌IFN-γ和IL-2等提高機體免疫能力并誘導巨噬細胞活化，從而抑制腫瘤的進展和轉(zhuǎn)移［24］。本研究進一步分析山柰酚對CRPC裸鼠模型免疫水平的影響，結(jié)果顯示山柰酚可劑量依賴性地提高前列腺癌裸鼠模型外周血中CD4+細胞比例及CD4+/CD8+，并提高血清中IFN-γ和IL-2的水平。既往也有研究顯示山柰酚具有調(diào)控免疫和T細胞亞群的作用，有體內(nèi)研究顯示山柰酚具有提高機體免疫能力的作用［25］。LIU等［26］研究結(jié)果顯示山柰酚可在體外調(diào)控T淋巴細胞的分化和增殖，從而緩解牛皮癬。提示在前列腺癌裸鼠模型中，山柰酚可能通過提高CD4+/CD8+水平并誘導IFN-γ和IL-2的水平促進T細胞的生長和分化，激活和招募巨噬細胞和自然殺傷細胞在腫瘤中的增殖聚集，從而有利于腫瘤的清除［27-28］。

綜上所述，在前列腺癌裸鼠模型中，山柰酚不僅可以誘導前列腺癌細胞的凋亡，抑制增殖和轉(zhuǎn)移，還可提高CD4+/CD8+水平，促進IFN-γ和IL-2表達，緩解免疫抑制狀態(tài)。但關(guān)于山柰酚在前列腺癌中的作用和調(diào)控T淋巴細胞的分子機制仍需要進一步研究。