耐碳青霉烯類腸桿菌的實驗室快速檢測方法研究進展*

張鴻娟 綜述，單 斌△ 審校

1.昆明醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院醫(yī)學檢驗科，云南昆明 650032；2.云南省醫(yī)學檢驗臨床研究中心，云南昆明 650032；3.云南省檢驗醫(yī)學重點實驗室，云南昆明 650032

細菌耐藥(AMR)是全球公共健康領域的重大挑戰(zhàn)，世界衛(wèi)生組織(WHO)要求各國積極行動，采取系統(tǒng)性措施遏制AMR，否則感染性疾病將成為嚴重威脅人類健康與生命安全的首要因素?？刂艫MR是醫(yī)療機構主要的工作內容之一，是醫(yī)療機構質量評價和評級的指標之一。近年來多重耐藥細菌檢出率，尤其是革蘭陰性菌的檢出率呈快速上升趨勢，且革蘭陰性菌中腸桿菌目細菌占比非常高，超過60%[1-2]。腸桿菌目細菌中應重點關注對第三代頭孢菌素或碳青霉烯類抗菌藥物耐藥的細菌[3]。碳青霉烯類抗菌藥物具有良好的通透性和光譜抗菌活性，被認為是治療腸桿菌目細菌感染的最后一道防線[4]。隨著碳青霉烯類藥物的廣泛運用，耐碳青霉烯類腸桿菌(CRE)檢出率不斷升高。2020年中國細菌耐藥監(jiān)測網(CHINET)結果顯示，肺炎克雷伯菌對美羅培南的耐藥率為24.2%，對亞胺培南的耐藥率為23.2%，雖然與2018年相比呈下降趨勢，但是與2005年3.0%和2.9%的耐藥率相比，增長率高達7倍[2]。 不恰當?shù)目垢腥局委煏绊懟颊叩闹委熃Y局。根據(jù)不同碳青霉烯酶的特征開展聯(lián)合藥敏試驗，有助于精準的抗感染治療方案的制訂。因此，準確、快速地對CRE產生的碳青霉烯酶進行檢測分型，在抗感染方案的制訂、醫(yī)院感染防控方面具有重要的價值。碳青霉烯酶酶型/耐藥基因檢測的方法按檢測的結果分為表型檢測和基因型檢測。本文主要介紹可以在2 h以內完成碳青霉烯酶酶型/耐藥基因檢測的方法。

1 CRE概述

CRE導致的感染病死率高。我國CRE血流感染30 d內的病死率為46.2%[5]。在血液病患者中，CRE導致的血流感染病死率甚至高達77.3%[6]。編碼碳青霉烯酶的基因通常位于可移動的元件上，如質粒、整合子、插入序列等，易在細菌間橫向傳播[7]。CRE菌株常同時攜帶其他的耐藥基因，導致多重耐藥菌株，甚至全耐藥菌株的出現(xiàn)。目前，我國的CRE菌株主要分離自住院患者，但是該類菌株存在社區(qū)播散的可能性，需要高度重視。CRE的流行病學特征是醫(yī)院獲得性病原體傳播的典型模式。醫(yī)療器械的使用、碳青霉烯酶類抗菌藥物的使用、侵入性醫(yī)療操作、ICU入住史等均為醫(yī)院獲得性CRE的風險因素[8]。CRE定植或感染患者的流動造成了醫(yī)療機構的CRE暴發(fā)。對ICU患者進行進入病房前篩查，同時對產碳青霉烯酶菌株(CPO)檢測陽性的患者分區(qū)隔離，能夠有效地降低CPO的感染率[9]。在器官移植中，對移植受者在接受移植或化療前進行CRE直腸定植篩查，對供者進行CRE直腸定植篩查，能夠有效地降低移植后CRE的感染率[10]。目前，臨床醫(yī)生只能通過藥敏結果判定腸桿菌目細菌是否為CRE，但不能對其耐藥機制做出判定。

產碳青霉烯酶是腸桿菌目細菌對碳青霉烯類藥物耐藥最主要的機制[11]，其他耐藥機制包括產超廣譜β內酰胺酶(ESBL)和(或)產AmpC酶合并外膜孔蛋白表達下調或缺失，但占比較低。碳青霉烯酶是一種能水解碳青霉烯類抗菌藥物(如厄他培南、多尼培南、亞胺培南和美羅培南)的β內酰胺酶。通常情況下，碳青霉烯酶也可水解β內酰胺類抗菌藥物，如青霉素類、β內酰胺類/酶抑制復合制劑、單酰胺環(huán)類和頭孢菌素類等，所以CPO對所有β內酰胺藥物均耐藥[11]。

根據(jù)β內酰胺酶底物譜、抑制劑譜、序列同源性的不同，建立了兩個內酰胺酶分類系統(tǒng)，將其分為Ambler類(即基于氨基酸序列同源性的A、B、C和D類)和Bush-Jacoby-Medeiros組(即基于底物和抑制劑譜的第1、2、3和4組)，其中Ambler 分子分類方法更常用。按照 Ambler 分子分類方法，碳青霉烯酶可分為A、B、D 3類[12]。A類為絲氨酸碳青霉烯酶，B類為金屬β內酰胺酶，D類為絲氨酸碳青霉烯酶。目前，我國臨床分離的CRE菌株產生的碳青霉烯酶以A類KPC型、B類NDM型和D類OXA-48 型為主。不同種類的抗菌藥物對不同CPO的抗菌活性不同[5]，如頭孢他啶-阿維巴坦對產 KPC和OXA-48型絲氨酸CPO具有高度抗菌活性，但對產金屬β內酰胺酶菌株無抗菌活性[13]。

2 表型檢測法

表型檢測法通過對CRE產生的碳青霉烯酶酶型進行檢測，常用的膠體金免疫層析法與基質輔助激光解析電離飛行時間質譜法(MALDITOF MS) 能夠在2 h內完成碳青霉烯酶酶型檢測。

2.1膠體金免疫層析法 膠體金免疫層析法是近年發(fā)展起來的一種快速檢測CRE中碳青霉烯酶酶型的方法[14]。該技術體外定性檢測培養(yǎng)后可獲取細菌標本產KPC、OXA-48、VIM、IMP和NDM型碳青霉烯酶的情況。方法為將待測菌落和提取緩沖液在EP管中進行混合，混合液加入檢測卡的標本孔后，待測菌落中的KPC、OXA-48、VIM、IMP和NDM型碳青霉烯酶與膠體金結合墊上的碳青霉烯酶單克隆抗體反應，形成相應的“抗原-金標抗體復合物”，在層析作用下沿著硝酸纖維素膜移動，被固定在檢測卡檢測線上的 KPC、OXA-48、VIM、IMP和NDM型碳青霉烯酶單克隆抗體捕獲，形成“抗體-抗原-金標抗體復合物”，并在測試區(qū)相應檢測線上出現(xiàn)一條或多條紅線。混合物中多余的金標抗體移至檢測卡質控線(C線)被連接生物素-BSA的羊抗鼠多克隆抗體捕獲，形成質控信號，即在C線上出現(xiàn)一條紅線。該方法具有檢測速度快、不需要特殊儀器、結果容易判讀的優(yōu)點。該技術能夠在30 min內快速準確地給出 KPC、OXA-48、VIM、IMP 和 NDM 結果，操作方便，結果可靠，同時能夠快速直接檢測血培養(yǎng)陽性標本的CPO感染情況。有助于加速由CPO引起的血流感染的診斷和治療。該方法的不足之處為只能檢測靶向酶，對某些亞型及罕見酶型無法檢出。

2.2MALDI-TOF MS MALDI-TOF MS 是近年發(fā)展起來的一種微生物種屬鑒定技術，該技術具有快速、準確、成本低的優(yōu)勢。該方法根據(jù)不同細菌間質譜峰強度，通過質譜儀采集待檢標本質譜圖與數(shù)據(jù)庫中已知菌種的圖譜進行統(tǒng)計學聚類分析，獲得鑒定結果[15]。在碳青霉烯酶酶型檢測中，通過待檢菌株與碳青霉烯類抗菌藥物(如亞胺培南和美羅培南)共同孵育，待測菌株如果產碳青霉烯酶，將會水解抗菌藥物，造成抗菌藥物的相對分子質量發(fā)生變化，隨后使用MALDITOF MS進行抗菌藥物的相對分子質量的檢測，間接證明該菌株是否產碳青霉烯酶。該方法操作方便、通量高、耗時短，而且特異度和靈敏度較高，但是該方法對實驗室的條件要求高，不僅需要質譜儀，而且不能使用常規(guī)的微生物種屬鑒定分析軟件，需要專用的分析軟件，軟件價格昂貴，同時使用的碳青霉烯類抗菌藥物的種類、質量、濃度及培養(yǎng)過程均會影響檢驗結果。該方法可以檢測目前已知的碳青霉烯酶，也可檢測尚未被發(fā)現(xiàn)的碳青霉烯酶，但是無法分辨碳青霉烯酶的具體類型，而且只能檢出產碳青霉烯酶的耐藥菌，可能會造成漏檢。

3 基因型檢測

基因型檢測方法通過對產碳青霉烯酶的耐藥基因進行檢測，如blaKPC、blaNDM、blaIMP、blaVIM、blaOXA-48耐藥基因，常用的方法有多重聚合酶鏈式反應(PCR)、環(huán)介導恒溫擴增技術(LAMP)、實時熒光PCR一體化平臺等。

3.1多重PCR法 PCR是一項DNA體外合成放大技術，能夠短時間內、特異地擴增任何目的DNA。多重PCR又稱多重引物PCR或復合PCR，與普通PCR法相比，多重PCR反應體系有兩對以上引物，可以同時擴增多個核酸片段，操作過程與普通PCR相同。碳青霉烯酶基因檢測主要使用多重PCR法，該方法可以實現(xiàn)同時對多個編碼碳青霉烯酶基因進行檢測。多重PCR檢測碳青霉烯酶基因時，通過一次擴增多個常見耐藥基因，不僅提高了檢測效率，而且降低了檢測成本。同時有研究表明，使用多重PCR可有效減少非特異性擴增，提高了檢測的特異性[16]。多重PCR能夠在2 h左右檢測出常見的5個編碼碳青霉烯酶的基因，但是對實驗室條件、工作人員要求高，不能檢測其他的碳青霉烯酶基因，可能會造成漏檢。

3.2LAMP LAMP是一種新的核酸體外擴增技術，已廣泛用于檢測病毒、細菌和寄生蟲。該技術可以在恒溫條件下實現(xiàn)核酸的體外擴增[17]。LAMP通過針對目的基因設計3對特異性引物(FIP和BIP、F3和B3、LF和LB)，65 ℃擴增30 min，通過比色變化觀察放大產物，或通過副產物(焦磷酸鎂)濁度的存在目測放大產物。在碳青霉烯酶基因檢測中，LAMP通過與凝膠電泳、濁度、SYBR green或calcein等方法結合測量副產物，從而實現(xiàn)碳青霉烯酶基因的檢測[18]。LAMP具有效率高、特異性強、速度快，以及在等溫條件下不需要使用復雜的精密熱循環(huán)器進行溫度循環(huán)等優(yōu)點，但不能檢測碳青霉烯酶基因的變體，在產物檢測方面只有擴增和不擴增兩種結果，對靶序列長度要求高，不能進行長鏈DNA的擴增。

3.3實時熒光PCR一體化平臺 實時熒光PCR一體化平臺采用PCR 技術對主要的碳青霉烯酶基因進行檢測，實現(xiàn)了標本制備、核酸提取和擴增等功能為一體的自動分析，檢測時間一般在1 h左右，檢測靈敏度和特異度均在96%以上。平臺設計了引物和探針用于檢測與革蘭陰性菌對碳青霉烯類藥物不敏感有關的blaKPC、blaoxa-48、blaIMP、blaNDM、blaVIM基因序列中的特有序列，以及用于監(jiān)測目標細菌是否被正確處理，監(jiān)測PCR反應中是否存在抑制劑的標本處理質控(SPC)是否在控，如GeneXper、Verigene和 Filmarray等系統(tǒng)[19]。該方法可以直接檢測臨床標本，如直腸拭子、肛周拭子、純菌落，以及經過簡單處理的痰標本，具有檢測快速(可直接從標本中檢測)和結果容易判讀的優(yōu)點，但缺點是價格昂貴，需要特殊的試劑和設備，檢測特異性靶基因，若待測基因與目標基因不同，則呈假陰性結果。這些基因序列的檢出不代表存在活的微生物，不能進行細菌鑒定。該類試劑盒在國內上市時間較晚，市面上價格較高，而且需要購買特殊的儀器，可用于對特殊人群，如危重癥患者、移植患者的檢測。

4 小 結

碳青霉烯類抗菌藥物的抗菌譜廣、抗菌活性強，對產ESBL腸桿菌科細菌具有很強的抗菌活性，被認為是治療腸桿菌目細菌感染的最后一道防線[20]。隨著碳青霉烯類抗菌藥物的廣泛應用，CRE在全球范圍內的流行播散已成為公共健康領域的重大挑戰(zhàn)。CRE所致感染具有“三高一快”的特點，即高病死率、高耐藥性、高傳播性、快速增長。同時碳青霉烯酶耐藥基因可以通過質粒介導，在不同種之間高度傳播，導致醫(yī)院、社區(qū)感染的暴發(fā)。國家、地區(qū)、醫(yī)院、人群及細菌的不同，檢出的碳青霉烯酶種類均有差異[21]。不同種類的抗菌藥物對不同CPO抗菌活性不同。有效而規(guī)范的治療方案是提高CRE感染救治率的關鍵[22]。面對這樣的“超級細菌”，快速診斷在控制院內感染方面具有重要意義。在標準預防的基礎上，通過檢測對確定或高度疑似多重耐藥菌感染患者或定植患者實施接觸隔離措施，可以有效遏制CRE在不同患者和不同區(qū)域間的流行播散。同時，應開展耐藥性監(jiān)測，定期分析院內CRE檢出率變化，為院內感染控制提供數(shù)據(jù)和技術支持。因此，快速進行CRE碳青霉烯酶酶型或耐藥基因檢測，對于院內感染預防控制、臨床抗感染治療方案制訂、改善患者結局具有重要的價值。