超細SiO2改性殼聚糖膜的制備、表征及蛋白質分離性能研究

龍 騰，陳義強，柯文林，唐 旭，徐長安，吳 鵬*

(1.福建中煙工業(yè)有限責任公司技術中心，福建 廈門 361021；2.自然資源部第三海洋研究所，福建 廈門 361005)

海洋中存在豐富的植物多糖、動物多糖和微生物多糖，其中作為動物多糖的甲殼質最為豐富，從蝦、蟹等海產(chǎn)品加工廢棄物中可以提取20%～30%的甲殼素，是目前僅次于纖維素的第二大多糖類物質[1-3]。殼聚糖是甲殼素脫去乙酰基形成的衍生物，是一種天然的陽離子型海洋生物多糖，與甲殼素不同，殼聚糖可在稀酸條件下溶解，擴大了其應用范圍[4]。殼聚糖具有廣譜抗菌性、生物可降解性、成膜性等特點，科學家們以殼聚糖為原料在海洋膜材料方面做了大量的研究，在生物醫(yī)學、食品化工、環(huán)境保護等領域拓展其應用潛力[5]。殼聚糖是矩陣規(guī)則排列的聚合物大分子，與水分子形成氫鍵能力強，能在膜表面形成一層水化層可阻止蛋白質、多糖等生物質膜污染物在表面吸附，抗膜污染能力強[6-7]，因此殼聚糖在膜材料的應用，尤其在超濾膜和納濾膜的制備方面發(fā)揮著重要作用[8-9]。以臭氧處理過的聚丙烯無紡布為基材，涂覆殼聚糖醋酸溶液制備復合膜，具有抗蛋白質和細菌粘度的功能，在膜生物反應器中使用具有通量高和抗膜污染性能等優(yōu)點[10]。殼聚糖/硅膠/聚乙烯醇的有機-無機雜化超濾膜可用于蛋白質分離[11]，該膜具有非對稱結構和相對致密的表面層和多孔層，對牛血清白蛋白和溶菌酶溶液分離中表現(xiàn)出較高的通量、較好的選擇性和抗膜污染性能。以殼聚糖為膜材料，通過京尼平交聯(lián)成功制備的自支撐殼聚糖膜用于微藻細胞分離的研究發(fā)現(xiàn)，通過改變聚乙二醇的分子量可實現(xiàn)膜微結構的調控，并且小分子聚乙二醇結構改性的殼聚糖膜比大分子聚乙二醇結構改性的殼聚糖膜對小球藻細胞本身及其代謝產(chǎn)物形成的膜污染具有更好的抑制作用[12]。目前應用殼聚糖膜制備復合膜的研究比較多，主要以商用超濾膜(聚偏氟乙烯、聚醚砜等)為支撐層，通過涂覆、界面聚合等方法制備[13-14]。雖然殼聚糖本身是生物可降解材料，但是支撐層材料為石化產(chǎn)品，直接丟棄對環(huán)境仍然會造成一定程度的污染。自支撐殼聚糖膜主要通過流延法制備[15-16]，其缺點主要是膜厚度大而造成膜通量低。所以，如何在自支撐膜基礎上做一定的改性既要保證分離精度，又要改善膜通量而且能保持一定的力學強度成為當前主要的研究課題。本研究利用殼聚糖在堿性條件下穩(wěn)定，超細SiO2在堿性條件下能溶解的特殊結合，通過在殼聚糖鑄膜液中添加一定量的超細SiO2使其自然沉淀，采用“凝膠成膜-溶解脫除”方法成功制備出具有致密層和多孔層的非對稱結構的自支撐殼聚糖膜，并對該自支撐殼聚糖膜的結構和純水通量進行表征，并考察其對蛋白質的分離效果。本研究以殼聚糖為原料制備改性殼聚糖膜對海洋生物產(chǎn)業(yè)，尤其是生物酶制劑產(chǎn)業(yè)發(fā)展及環(huán)境保護等均有重要參考價值和指導意義。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

殼聚糖(高分子量，分子量為310～375 kDa)購自西格瑪奧德里奇公司；高純SiO2超細粉(規(guī)格5～15 μm，純度大于99.99%)購自連云港瑞創(chuàng)新材料有限公司；醋酸、氫氧化鈉、甘油，均為分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司；溶菌酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、雞卵清蛋白和牛血清白蛋白均為生化試劑，購自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 改性殼聚糖膜的制備與結構表征 準確稱取1 g的殼聚糖粉末溶解于99 g的醋酸水溶液，在室溫下攪拌12 h至其完全溶解，制備質量分數(shù)為1%殼聚糖水溶液。所得殼聚糖溶液用濾紙進行減壓過濾以除去溶液中的非溶解性雜質。本研究所使用的超細SiO2的粒徑主要分布在5～15 μm之間，粒徑分布詳見圖1。將含殼聚糖30%(質量分數(shù))的甘油添加到過濾后的殼聚糖溶液后，再添加不同質量的超細SiO2(0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 g)，將超細SiO2在殼聚糖溶液中充分分散。取配好的殼聚糖鑄膜液(30 g，約25 mL)倒入內徑為90 mm的玻璃培養(yǎng)皿中，超細SiO2通過自由沉降至鑄膜液底部，從Stokes公式可知，顆粒沉降速度、顆粒密度和流體密度相關，在顆粒密度和流體密度不變的情況下，顆粒直徑越大，沉降速度就越大。經(jīng)過12 h的沉降，超細SiO2堆積在鑄膜液底部，將培養(yǎng)皿置于電熱鼓風恒溫干燥箱中并保持水平放置，在60 ℃下干燥12 h。干燥后將事先配好的1.5 mol/L的NaOH水溶液倒入玻璃培養(yǎng)皿中讓殼聚糖膜在堿性條件下凝固成膜。然后將殼聚糖/SiO2復合膜從玻璃培養(yǎng)皿中取出并移至70 ℃、1.5 mol/L NaOH水溶液中浸泡，同時緩慢攪拌5 h，以溶解并去除殼聚糖膜內的SiO2。采用數(shù)碼相機和美國產(chǎn)的Quanta 450型掃描電子顯微鏡(scanning electron microscope,SEM)對殼聚糖膜的形貌及表面微觀結構進行觀察。

圖1 超細SiO2的粒徑分布Fig.1 Size distribution of the ultrafine SiO2 particles

1.2.2 殼聚糖膜的含水率及機械性能測試 殼聚糖膜樣品含水率的測試方法：將殼聚糖膜樣品切成4 cm×4 cm的小片，在純水中浸泡24 h后，用濾紙小心擦去樣品表面的水滴，置于電熱鼓風恒溫干燥箱中，60 ℃干燥12 h。其計算公式如下：

(1)

式(1)中：Wt為殼聚糖膜的含水率(%)，ws為干燥前質量(g)，wd為干燥后質量(g)。

殼聚糖膜樣品機械性能的測試方法：將殼聚糖膜片裁剪成10 mm×40 mm的規(guī)格，膜厚使用測厚儀(7301系列，日本)測試。準備好膜片固定在萬能試驗機(5900系列，美國)上進行拉伸測試。最初的夾具間距設置為20 mm，拉伸速率為1 mm/s。

1.2.3 殼聚糖膜水通量測試 平板超濾系統(tǒng)由超濾杯(KS-90，日本)、氮氣瓶、減壓閥和計算機組成，膜樣品的水通量測試按恒壓力死端過濾模式進行。殼聚糖膜放置于超濾杯底部，杯中裝400 mL的純水在恒定氮氣壓力(0.1 MPa)的驅動下，透過殼聚糖膜，有效測試膜面積為45.3 cm2。通過殼聚糖膜的純水流入放置在電子天平上的燒杯內，計算機實施采集并記錄電子天平數(shù)據(jù)及其對應時間。殼聚糖膜水通量由公式(2)計算得出。

(2)

式(2)中：J為水通量[L/(m2·h)]，ΔV為透過液體積(L)，Am為有效膜面積(m2)，t為膜過濾時間(h)。

1.2.4 殼聚糖膜內蛋白質傳質通量測定 采用自制的玻璃擴散膜池開展蛋白質擴散實驗，如圖2所示，將殼聚糖膜夾在兩個圓柱型的玻璃擴散池之間，為了容易辨認，將左邊進料端裝入帶有顏色的水溶液，右邊的擴散端裝入無色透明的純水，擴散面積為50.2 cm2。一個玻璃擴散池裝有0.1 g/L的蛋白質溶液600 mL[溶菌酶 (14 kDa)、胰蛋白酶 (20 kDa)、胃蛋白酶 (34 kDa)、雞卵清蛋白 (43 kDa) 或牛血清白蛋白 (65 kDa)]，另一個擴散池裝有純水600 mL。每個擴散池各配有1臺小型電動攪拌器，保持池內溶液處于湍流狀態(tài)以減少濃差極化對蛋白質自由擴散的影響。實驗過程中，每隔30 min分別從兩個擴散池中取樣1 mL，采用考馬斯亮藍法測定樣品中蛋白質含量。

1為玻璃擴散池(進料端),2為小型葉片式電動攪拌器，3為殼聚糖膜，4為玻璃擴散池(擴散端)。圖2 擴散膜池Fig.2 Diffusion membrane cells

基于擴散單元濃度的質量平衡，總傳質系數(shù)和膜內傳質系數(shù)可由公式(3)和(4)分別計算得出。

(3)

(4)

由于實驗過程中始終保持兩個擴散單元中的完全湍流條件，可以忽略總傳質阻力中的殼聚糖膜兩側傳質阻力，因此蛋白質分子在殼聚糖膜內傳質系數(shù)可以用有效擴散系數(shù)(effective diffusion coefficients,Deff)與膜厚度的比值表示，即km=Deff/l。其中，Deff為蛋白質分子在殼聚糖膜中的有效擴散系數(shù)(m2/s)，l為膜的厚度(m)。

2 結果與討論

2.1 殼聚糖膜的結構表征與性能研究

圖3(a)為超細SiO2改性殼聚糖膜的示意圖。均勻分散在殼聚糖鑄膜液中的超細SiO2顆粒隨著時間的推移緩慢沉降在玻璃培養(yǎng)皿的底部，當殼聚糖凝膠成膜后再溶解脫除超細SiO2顆粒，殼聚糖膜的結構形態(tài)從兩面均勻變成一面致密和一面多孔的非對稱結構。圖3(b)和圖3(c)為超細SiO2改性前和改性后的殼聚糖膜的數(shù)碼照片。如圖可見，改性前殼聚糖膜為透明膜片，經(jīng)過超細SiO2改性后的殼聚糖膜透明度有所降低。這是因為殼聚糖膜內的超細SiO2在堿性條件下溶解以后留下的超細多孔結構產(chǎn)生光散射效應所致。

圖3 超細SiO2改性殼聚糖膜形成機制圖及其數(shù)碼照片F(xiàn)ig.3 Mechanism of chitosan membrane modified with ultrafine SiO2 particles and its digital photographs(a)為超細SiO2改性殼聚糖膜示意圖，(b)為純殼聚糖膜的數(shù)碼照片，(c)為改性后殼聚糖膜的數(shù)碼照片。

超細SiO2改性殼聚糖膜的表面及橫斷面SEM分析結果如圖4所示。從圖4(a)和圖4(b)可以看出超細SiO2顆粒在有限的薄層內構建出了非對稱結構，由于致密層(或稱之為分離層)的厚度大大降低，將在提高膜滲透通量方面發(fā)揮關鍵作用。圖4(c)和圖4(d)分別為鑄膜液與玻璃培養(yǎng)皿底部接觸面和空氣接觸面所形成的膜結構圖。鑄膜液與玻璃培養(yǎng)皿底部接觸面也就是超細SiO2沉降堆積側，經(jīng)過堿處理后呈現(xiàn)多孔結構，而與空氣接觸側則呈現(xiàn)致密的膜結構。

圖4 超細SiO2改性殼聚糖膜SEM圖Fig.4 SEM image of chitosan membrane surface modified by ultrafine SiO2

2.2 殼聚糖膜的含水率與機械性能

為了驗證在殼聚糖膜中溶解脫除超細SiO2顆粒形成偏心定位的空隙，我們比較了殼聚糖膜和改性殼聚糖膜的含水率變化，如圖5(a)所示，改性殼聚糖膜的含水率比殼聚糖膜有一定程度的增大。該結果表明，改性殼聚糖膜內含有一些微尺度空隙，這對膜通量的提高具有一定作用。另一方面，圖5(b)對比了殼聚糖膜和改性殼聚糖膜在承受最大應力方面的表現(xiàn)，結果顯示，經(jīng)過超細SiO2改性對殼聚糖膜的機械性能幾乎沒有產(chǎn)生影響，雖然改性殼聚糖膜存在多孔微結構，但是在力學性能上與殼聚糖膜相比略有下降，其影響不大，具備實際應用中所需的機械強度。

圖5 表面改性前后殼聚糖膜的含水率和機械性能Fig.5 Water content and mechanical properties of chitosan membranes before and after surface modification

2.3 殼聚糖膜的純水通量

水是最常用的介質，一般用純水通量來評價膜材料的滲透能力。如圖6所示，隨著超細SiO2添加量的增加，改性殼聚糖膜的純水通量越來越大，這是因為超細SiO2的溶解脫除形成多孔結構會增加殼聚糖膜多孔層的比表面積，一些文獻也報道了增加的比表面積會增大氣體分離[17]、滲透蒸發(fā)[18]和反滲透[19]中的滲透通量。另外，由于改性殼聚糖膜為非對稱結構，其致密層的厚度比殼聚糖膜小，水分子擴散通過致密層的時間短，因此純水通量會提高。當殼聚糖與超細SiO2的質量比為1∶1時，改性膜純水通量比殼聚糖膜高出1.5倍，超細SiO2的添加量超過1.0 g時，純水通量呈現(xiàn)了下降的趨勢，可能是因為在本研究實驗條件(在1.5 mol/L的NaOH、70 ℃處理5 h)下，不能完全溶解脫除殼聚糖膜內的超細SiO2，使得分子在擴散過程中受到阻礙導致純水通量下降。另一方面，也有關于滲透通量與表面粗糙度之間關系的研究提出了相互矛盾的結果，其中水滲透通量并不總是隨著表面粗糙度的增加而增加[20-21]，因為膜比表面積不隨SiO2顆粒的添加量成比例變化。例如，殼聚糖膜本身的傳質通道可能被過多的SiO2顆粒所影響，導致水滲透通量下降。因此，加入過量的SiO2顆?？赡軙е峦杆氏陆?。

圖6 超細SiO2的添加對膜純水通量的影響Fig.6 Effect of ultrafine SiO2 addition on pure water flux of membrane

2.4 殼聚糖膜對蛋白質分子傳質能力評價

圖7為模式蛋白質分子量大小對膜傳質的影響，所使用膜為未處理殼聚糖膜和改性殼聚糖膜(殼聚糖和超細SiO2的質量比為1∶1)。通過測量溶菌酶(14 kDa)、胰蛋白酶(20 kDa)、胃蛋白酶(34 kDa)、雞卵清蛋白(43 kDa)和牛血清白蛋白(65 kDa)在殼聚糖膜內的傳質通量來研究殼聚糖膜對蛋白質分子的分子篩能力。結果表明，雖然所用模式蛋白質從最高分子量(牛血清蛋白65 kDa)到最低分子量(溶菌酶14 kDa)的變化約4.6倍，但是這些模式蛋白在改性殼聚糖膜中Deff變化達330倍，并且改性殼聚糖膜中雞卵清蛋白和牛血清蛋白之間Deff出現(xiàn)了急劇變化，因此，我們認為傳質通道的大小幾乎等于雞卵清蛋白的分子大小[22]。另一方面，圖7還顯示了殼聚糖膜和改性殼聚糖膜Deff的對比，改性殼聚糖膜中蛋白質分子的Deff比殼聚糖膜大，尤其是在相對較小的分子范圍內的蛋白質，說明經(jīng)過改性后的殼聚糖膜對較小分子量范圍的蛋白質分子有更大影響。

圖7 蛋白質分子在膜內的有效擴散系數(shù)Fig.7 Effective diffusion coefficients of protein molecules in membranes圖中坐標系為對數(shù)坐標系。

3 結論

在本研究中，超細SiO2被成功地應用于制作具備非對稱結構的改性殼聚糖膜。SEM觀察顯示，超細SiO2沉積在鑄膜液底部，因此溶解脫除后的改性殼聚糖膜頂部表面致密、光滑且平坦，而底部則呈現(xiàn)多孔結構。該結構一方面可降低殼聚糖膜致密層的厚度，另一方面可增大膜內部物質擴散的有效面積。在純水通量方面，改性殼聚糖膜的滲透性比原殼聚糖膜高1.5倍。當殼聚糖與超細SiO2的質量比為1∶1時，其純水通量達到最大。模式蛋白質自由擴散實驗結果顯示，改性殼聚糖膜對蛋白質的分子尺寸篩選具有較高的靈敏度。本研究為具有自支撐且非對稱結構的殼聚糖膜材料的研究提供了參考，本研究成果在生物酶制劑制備等富含蛋白質料液的處理方面具有廣泛的研究和應用前景。