超聲靶向微泡破壞技術(shù)介導(dǎo)自殺基因在惡性腫瘤中的研究進展

吳 桐 黃 馳 杜兆林 姚懿染 劉治軍

惡性腫瘤在全球的發(fā)病率和死亡率逐年上升，其治療被認為是臨床和科研問題中最關(guān)鍵和最重要的課題之一。盡管醫(yī)學(xué)在化學(xué)治療、放射治療和外科手術(shù)方面進步斐然，但腫瘤的治療效果并未達到同等程度的預(yù)期?；虔煼ㄈ諠u成為一種全新的腫瘤治療模式，包括免疫基因治療、反義基因治療、溶瘤病毒治療和自殺基因治療在內(nèi)的多種基因治療方法已經(jīng)取得了重大進展。其中自殺基因療法因其獨特的作用機制而備受關(guān)注，其利用基因工程技術(shù)將前藥轉(zhuǎn)換酶基因（自殺基因）轉(zhuǎn)導(dǎo)入腫瘤細胞進行表達，編碼產(chǎn)生的酶類將無毒或低毒的前藥轉(zhuǎn)化成毒性產(chǎn)物，隨后通過凋亡或非凋亡機制導(dǎo)致細胞死亡［1］。自殺基因系統(tǒng)主要包括單純皰疹病毒胸苷激酶基因/丙氧鳥苷（HSV-TK/GCV）系統(tǒng)、大腸桿菌胞嘧啶脫氨酶基因/5-氟胞嘧啶（CD/5-FC）系統(tǒng)，以及大腸桿菌尿嘧啶磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（UPRT）和硝基還原酶（NTR）等。達到特定的目的需要封裝自殺基因的載體，并將其傳遞給指定的腫瘤細胞或腫瘤局部環(huán)境。超聲靶向微泡破壞（ultrasound-targeted microbubble destruction，UTMD）技術(shù)將超聲與各種功能性微泡載體相結(jié)合，可增強靶基因的轉(zhuǎn)染和表達，已成為一種極具前景的無創(chuàng)定位基因轉(zhuǎn)移方法，廣泛應(yīng)用于癌癥的基因治療。本文就UTMD 技術(shù)介導(dǎo)下自殺基因的轉(zhuǎn)染在惡性腫瘤治療中的研究進展綜述如下。

一、微泡載體系統(tǒng)及UTMD技術(shù)概述

1.微泡載體系統(tǒng)：作為非病毒表達載體，微泡具備安全性能高、制備成本低、易于快速代謝、可主動靶向腫瘤受體等獨特的優(yōu)勢，成為惡性腫瘤治療方法中更為安全有效的替代方案。微泡在發(fā)展過程中經(jīng)歷了豐富多樣的存在形式，從微氣泡、相變液滴、固體空化核到回聲脂質(zhì)體、納米微粒及從細菌中提取的蛋白質(zhì)包被的氣體囊泡［2］，不僅性能得到了優(yōu)化，而且粒徑實現(xiàn)了從微米級到納米級的飛躍。與微米級造影劑相比，納米級造影劑具有更好的生物相容性、穩(wěn)定性及易修飾性，可以提供優(yōu)越的循環(huán)時間和組織滲透，以獨特的優(yōu)勢成為新型的基因載體［3］。在微泡外殼加以特異性的配體修飾，形成能夠與腫瘤中的過表達受體特異性結(jié)合的靶向超聲造影劑，從而限制治療基因負載載體局部傳遞到腫瘤，提高療效，避免脫靶副作用。Johansen 等［4］合成了一種以受體蛋白酪氨酸磷酸酶mu（PTPmu）衍生的癌癥生物標記物為作用位點的靶向納泡，并與非靶向納泡進行了對比評估。結(jié)果表明，與非靶向?qū)φ占{泡相比，PTPmu靶向納泡利用超聲分子成像識別腫瘤效果更強、更快，且在體內(nèi)外均表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性。Wu 等［5］制備了均勻的陽離子納泡，實驗表明其在超聲下顯示明顯的對比度增強，尤其對低頻超聲非常敏感；且?guī)в刑禺愋耘潴w的納泡對裸鼠前列腺特異性膜抗原陽性細胞和異種移植腫瘤較陰性對照組具有較高的親和力和特異性，說明靶向微泡可使基因?qū)崿F(xiàn)更有效的轉(zhuǎn)染。

2.UTMD 技術(shù)：將超聲波與各種功能性微泡載體相結(jié)合形成了UTMD 技術(shù)，這是一種新的非病毒基因運輸方式。一方面，攜載基因的超聲微泡本身可作為良好的顯像對比劑實現(xiàn)在腫瘤部位成像；另一方面，在不同強度超聲波輻照下，微泡被逐一擊破，從而釋放基因到腫瘤部位。此外，在UTMD 作用過程中產(chǎn)生的聲孔效應(yīng)及空化效應(yīng)使得膜屏障作用減弱［6］，進而增加了治療基因向胞內(nèi)運輸，使得治療效果大幅提升。UTMD 技術(shù)克服了病毒載體相關(guān)的免疫原性，并具有高時空分辨率的特點，能夠?qū)崟r地監(jiān)測和捕獲基因，在惡性腫瘤的治療中發(fā)揮了優(yōu)勢。Li等［7］在一項研究下調(diào)miR-767抑制非小細胞肺癌的實驗中發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用UTMD 轉(zhuǎn)染miR-767 抑制劑的細胞與單獨轉(zhuǎn)染miR-767 抑制劑的細胞相比，其增殖、侵襲和遷移能力被進一步抑制，說明腫瘤的進展受UTMD介導(dǎo)的影響。

二、UTMD技術(shù)介導(dǎo)自殺基因在惡性腫瘤中的研究進展

UTMD 技術(shù)介導(dǎo)自殺基因形成了一種更有針對性、更為安全有效的自殺基因傳遞系統(tǒng)，以腫瘤特異性受體或組織特異性啟動子為作用位點，可在一定程度上避免由于缺乏腫瘤特異性而導(dǎo)致的治療失敗，實現(xiàn)更精準的基因治療。

1.UTMD 技術(shù)介導(dǎo)HSV-TK/GCV 系統(tǒng)：目前在實驗?zāi)Ｐ椭袘?yīng)用的各種自殺基因，以HSV-TK/GCV 系統(tǒng)研究最為透徹。HSV-TK 可催化無毒性抗病毒藥物更昔洛韋（GCV）磷酸化反應(yīng)，通過阻止DNA合成而發(fā)揮對腫瘤細胞的毒性殺傷作用。此外，旁觀者效應(yīng)將GCV 轉(zhuǎn)導(dǎo)到鄰近細胞，從而引起周圍未轉(zhuǎn)染細胞的死亡。UTMD 技術(shù)介導(dǎo)HSV-TK/GCV 系統(tǒng)進行的實驗研究領(lǐng)域包括肝癌［8-11］、胃癌［12-13］、卵巢癌［14］、腦膠質(zhì)瘤［15-16］、視網(wǎng)膜母細胞瘤［17］等；證明UTMD 技術(shù)不僅能夠提高TK 基因的轉(zhuǎn)染效率，同時腫瘤細胞和異種移植物的殺傷效果也進一步增強，為未來的臨床研究奠定了基礎(chǔ)。Wu 等［8］研究表明，UTMD技術(shù)介導(dǎo)HSV-TK 自殺基因系統(tǒng)不僅提高了基因靶向性，而且增強了基因轉(zhuǎn)染效率，在體內(nèi)和體外均表現(xiàn)出顯著的抗癌活性。修陽陽等［18］研究表明，UTMD 技術(shù)介導(dǎo) HSV-TK/GCV 系統(tǒng)還可作為高強度聚焦超聲（HIFU）治療后的一種新的輔助療法。HIFU 依據(jù)超聲波能夠穿透軟組織的原理，將高能量超聲聚焦于病變組織，憑借產(chǎn)生的瞬時機械效應(yīng)和熱效應(yīng)殺滅腫瘤細胞，但在肝癌治療中存在因消融不完全而導(dǎo)致癌組織殘留等問題。謝輝等［19］通過建立異種移植肝癌裸鼠模型，結(jié)果表明載HSV-TK 的液態(tài)氟碳納米粒聯(lián)合UTMD 技術(shù)可降低HIFU 治療后殘瘤組織中的血管內(nèi)皮生長因子、缺氧誘導(dǎo)因子-1α 及微血管密度水平，破壞腫瘤生長的血供條件，進而抑制腫瘤生長，提高HIFU 的治療效果。因此，UTMD 技術(shù)介導(dǎo)HSV-TK/GCV 系統(tǒng)聯(lián)合HIFU對癌癥的治療有協(xié)同作用。

2.UTMD 技術(shù)介導(dǎo)CD/5-FC 系統(tǒng)：CD 基因可將無毒的前藥5-FC 轉(zhuǎn)化為有毒的代謝物5-氟尿嘧啶（5-FU）。由于體積小和中性電荷，5-FU 可以很容易地擴散到細胞中［20］。因此，與HSV-TK/GCV 系統(tǒng)相比，CD/5-FC 系統(tǒng)具有遠程旁觀者效應(yīng)的獨特優(yōu)勢，從而達到更大范圍的殺傷效果。研究［21］表明，在UTMD 技術(shù)作用下，攜載CD 基因的陽離子納泡能夠?qū)⒆詺⒒虺晒D(zhuǎn)染并有效表達，提高殺滅膀胱癌T-24 細胞的效率，且恢復(fù)縫隙連接蛋白Cx26 表達，可改善細胞縫隙連接通訊并加強CD/5-FC 的旁觀者效應(yīng)，在增強殺傷效應(yīng)的同時又能夠預(yù)防和降低復(fù)發(fā)可能。

3.UTMD 技術(shù)介導(dǎo)雙自殺基因系統(tǒng)：隨著研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)當(dāng)2 個自殺基因聯(lián)合后，各自不同的作用機制可以互相補充，進而大大提高腫瘤的殺傷效率［22］。由于載體轉(zhuǎn)載容量的限制，目前大多數(shù)為雙自殺基因系統(tǒng)，其中以CD/TK 雙自殺基因系統(tǒng)最為常用。UTMD 介導(dǎo)CD/TK 雙自殺基因系統(tǒng)在惡性腫瘤中的研究包括肝癌［22-23］、膀胱癌［24-26］、肺癌［27］、宮頸癌［28］等。Hu 等［26］發(fā)現(xiàn)，CD/TK 雙自殺基因負載納泡結(jié)合 UTMD 能夠抑制體外膀胱腫瘤細胞和裸鼠體內(nèi)膀胱癌的增殖，而雙前藥較單前藥具有更顯著的作用。同時這項研究在肺癌模型中也得到了相同的結(jié)論［27］。除了上述的雙自殺基因，有學(xué)者對UTMD 技術(shù)介導(dǎo)CD/UPRT 和TK/NTR 雙自殺基因?qū)θ橄侔┑闹委熞策M行了相應(yīng)的研究。Paris 等［29］開發(fā)了一種新型的介孔二氧化硅納米粒用于制備超聲納泡，進而負載CD/UPRT 融合自殺基因，聯(lián)合UTMD 技術(shù)轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細胞（DMSCs）。實驗結(jié)果表明轉(zhuǎn)染了自殺基因的DMSCs，當(dāng)暴露于無毒的前藥物5-FC時，會產(chǎn)生一種有毒藥物，這種有毒物質(zhì)從DMSCs源擴散，到達周圍的癌細胞，從而能夠誘導(dǎo)共培養(yǎng)的大鼠乳腺癌細胞死亡。Devulapally 等［30］合成了聚乙二醇（PEG）?；廴樗?乙醇酸/聚乙烯亞胺納米粒（PLGA/PEI NP），并與TK/NTR 融合基因結(jié)合。結(jié)果表明，UTMD 技術(shù)介導(dǎo)TK-NTR-DNA-NP 復(fù)合物轉(zhuǎn)染后，在體外三陰性乳腺癌細胞中用GCV/CB1954前藥處理顯示出有效的細胞殺傷作用；體內(nèi)實驗結(jié)果表明，UTMD 技術(shù)可以成功地將TK/NTR 基因轉(zhuǎn)移到小鼠腫瘤中，并顯示出TK/NTR 蛋白的高表達水平，且其腫瘤體積顯著減?。≒＜0.05）。表明UTMD技術(shù)介導(dǎo)TK/NTR 基因可作為三陰性乳腺癌患者的潛在臨床治療選擇。除了自殺基因之間的相互聯(lián)合，自殺基因還可與其他介導(dǎo)腫瘤凋亡的基因形成融合基因，在UTMD 技術(shù)作用下，對腫瘤的抑制起到協(xié)同作用。Kumar 等［31］合成了一種三重治療基因TK-p53-NTR，結(jié)果表明TK、NTR 自殺基因與P53 抑癌基因?qū)θ幮匀橄侔?、肝癌細胞及裸鼠模型均有協(xié)同抗癌效果，且聯(lián)合miRNAs 使得前藥GCV 和CB1954 對腫瘤細胞有效致敏，增強細胞凋亡。此外，UTMD 技術(shù)顯著增加了體內(nèi)負載miRNAs 和TK-p53-NTR 納泡的腫瘤內(nèi)傳遞，從而增加了治療效果，可以實現(xiàn)較傳統(tǒng)治療方法更有效的抗癌治療。

4.多模態(tài)成像介導(dǎo)的自殺基因治療：目前的診斷成像方法，如超聲成像、光聲成像、熒光成像，均有其自身的局限性。隨著多功能造影劑的快速發(fā)展，超聲成像與其他成像方法相結(jié)合可以實現(xiàn)多模態(tài)成像。因而UTMD 技術(shù)與其他先進的治療技術(shù)相結(jié)合，使得自殺基因以更為完善的方式發(fā)揮療效。Wang 等［32］設(shè)計了一種雙模態(tài)的超聲/近紅外熒光（NIRF）造影劑，并將其應(yīng)用從圖像對比度增強擴展到超聲定向和部位特異性靶向的聯(lián)合診斷和治療。通過體外和體內(nèi)實驗評估聚乙烯亞胺和DNA 復(fù)合物偶聯(lián)的近紅外熒光金納泡（PEI-DNA/NIR797/AuMBs）作為雙模態(tài)造影劑的潛力，結(jié)果表明所開發(fā)的治療性AuMB 復(fù)合物不僅可以提供良好的超聲和NIRF 成像以檢測腫瘤，而且可以作為一種有效的超聲觸發(fā)載體，用于異種移植裸鼠腫瘤的基因傳遞和光熱消融。與單基因治療或單次暴露組（超聲或NIRF）比較，超聲+NIRF 暴露組細胞抑制率、細胞凋亡和壞死率，以及Bel-7402 異種移植物抑制率均較高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。表明超聲聯(lián)合近紅外熒光成像介導(dǎo)的雙融合自殺基因?qū)τ谔峁└娴脑\斷信息，以及指導(dǎo)更準確、有效的協(xié)同癌癥治療具有重要價值。

三、總結(jié)與展望

總之，UTMD 技術(shù)介導(dǎo)自殺基因轉(zhuǎn)染是一種極具臨床應(yīng)用潛力的無創(chuàng)靶向基因轉(zhuǎn)移方法，大量的臨床前研究不僅證明了基因傳遞的可行性，而且還有可量化的治療效果。然而，這項技術(shù)研究多停留在細胞、動物實驗階段，在向臨床轉(zhuǎn)化的道路上仍存在挑戰(zhàn)。酶和前藥的開發(fā)、轉(zhuǎn)染效率的優(yōu)化、微泡造影劑的安全性及靶向性等問題仍需進一步探索。優(yōu)勢互補的多模態(tài)成像是UTMD 技術(shù)應(yīng)用于腫瘤治療的發(fā)展趨勢，有望實現(xiàn)惡性腫瘤的診療一體化。相信在國內(nèi)外學(xué)者的共同努力下，UTMD 技術(shù)介導(dǎo)自殺基因治療惡性腫瘤終將從實驗研究過渡到臨床應(yīng)用，以更全面、更實際的方式服務(wù)于人類健康。