重視結(jié)核分枝桿菌抗原檢測技術(shù)研發(fā)

孫照剛

結(jié)核病疫情防控面臨的新形勢需要考慮新的快速、便捷的早期篩查或診斷技術(shù)。該技術(shù)既要脫離分枝桿菌培養(yǎng)，又要避免核酸檢測所需要的較為復(fù)雜的核酸提取和擴(kuò)增技術(shù)，還要注重生物安全性。因此，簡便、快速和廉價(jià)的免疫學(xué)診斷技術(shù)是結(jié)核病研究人員重點(diǎn)關(guān)注并且堅(jiān)持不懈的努力方向。

由于機(jī)體被結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)感染后，體內(nèi)首先出現(xiàn)的是MTB特異性抗原。MTB抗原的檢測不受宿主免疫功能狀態(tài)的影響，可以作為MTB感染的直接證據(jù)。盡管世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)在2011年基于更早的10年間的數(shù)據(jù)指出：目前市面上商業(yè)性血液(血清學(xué))檢測手段診斷活動性結(jié)核病，常導(dǎo)致誤診和不當(dāng)治療[1]。如今，隨著MTB抗原檢測新技術(shù)在敏感度和特異度等方面的提高，使得結(jié)核病快速確診技術(shù)更為可靠。并且，對于菌陰肺結(jié)核、難以診斷的肺外結(jié)核，以及對免疫功能低下患者等特定群體而言，MTB抗原檢測具有更重要的積極意義，應(yīng)成為優(yōu)先考慮的技術(shù)研究方向。筆者就MTB抗原檢測的現(xiàn)有進(jìn)展及未來發(fā)展方向進(jìn)行闡述。

一、目前檢測的MTB抗原靶標(biāo)

(一)單一抗原檢測

與抗體檢測相對應(yīng)，抗原檢測是直接檢測患者標(biāo)本中MTB抗原成分，單一抗原檢測的靶標(biāo)主要是相對分子質(zhì)量為14 000、31 000和38 000的蛋白，以及MPT64蛋白、熱休克蛋白65(Hsp65)、Ag85蛋白復(fù)合物和脂阿拉伯甘露聚糖(lipoarabinomannan，LAM)等單一組分。這些單一抗原組分的檢測結(jié)果表現(xiàn)出明顯的特異度和敏感度的差異，僅有個(gè)別研究顯示的其檢測特異度和敏感度都超過了80%。

Silva等[2]采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測結(jié)核病患者對相對分子質(zhì)量為14 000蛋白的體液應(yīng)答，發(fā)現(xiàn)該蛋白的體液應(yīng)答與非活動性結(jié)核病相關(guān)，其對非活動性結(jié)核病患者的體液反應(yīng)(平均陽性率：0.18%)低于活動性結(jié)核病患者(0.21%)，對結(jié)核分枝桿菌潛伏感染(latent tuberculosis infection，LTBI)有一定的診斷價(jià)值。同樣采用ELISA方法，對結(jié)核性腦膜炎(tuberculous meningitis, TBM)患兒腦脊液和血清樣本中的相對分子質(zhì)量為31 000蛋白抗原的檢測結(jié)果證明，其敏感度分別為90%和80%，特異度均為96%[3]；對結(jié)核病患者血清中相對分子質(zhì)量為38 000蛋白抗原檢測的總敏感度為55.2%，陽性預(yù)測值為93.5%[4]。唐宇龍等[5]研究表明，MPT64制備的抗體檢測血清標(biāo)本陽性率不高，但特異度較好，用于檢測臨床診斷的肺結(jié)核患者血清標(biāo)本陽性率為41.2%，檢測非結(jié)核病患者和健康對照組血清標(biāo)本的假陽性率分別為7.1%和53.1%。一項(xiàng)采用間接ELISA方法對TBM患者腦脊液中的Hsp65蛋白抗原進(jìn)行的前瞻性評估發(fā)現(xiàn)，其診斷敏感度和特異度分別為84%和90%[6]。

Ag85蛋白復(fù)合物包括Ag85A、Ag85B和Ag85C，是MTB培養(yǎng)液中最常見的分泌蛋白，能誘導(dǎo)體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)[7]。Khan等[8]采用間接免疫PCR(I-PCR)和實(shí)時(shí)定量PCR(RT-I-PCR)方法檢測骨關(guān)節(jié)結(jié)核患者臨床標(biāo)本(組織活檢、滑膜液和膿液)中Ag85蛋白復(fù)合物表達(dá)，發(fā)現(xiàn)I-PCR檢測骨關(guān)節(jié)結(jié)核確診患者(8例)和臨床疑似患者(51例)的敏感度分別為87.5%和70.5%，特異度均為93.9%(33例非結(jié)核病對照者)。值得注意的是，I-PCR/RT-I-PCR檢測敏感度明顯高于ELISA法和GeneXpert法(30例骨關(guān)節(jié)結(jié)核患者)。因此，該檢測方法有望成為一種有潛力的結(jié)核病診斷試劑盒。

LAM是一種由多糖和脂類組成的復(fù)合物，是MTB細(xì)胞壁的重要成分，具有較強(qiáng)的免疫原性[9]。LAM是MTB抗原檢測中最常見的靶向抗原，F(xiàn)lores等[10]系統(tǒng)綜述了LAM抗原在不同類型結(jié)核病中的診斷價(jià)值，發(fā)現(xiàn)各項(xiàng)研究的質(zhì)量參差不齊。對肺結(jié)核診斷敏感度和特異度的范圍分別為2%～100%和33%～100%。對合并HIV感染的肺結(jié)核患者尿液LAM檢測發(fā)現(xiàn)其敏感度高于未合并HIV感染者。對肺外結(jié)核診斷敏感度和特異度的范圍分別為0～100%和62%～100%。五項(xiàng)針對LAM、早期分泌抗原靶6(ESAT-6)、Ag85 復(fù)合物和腦脊液中相對分子質(zhì)量為65 000蛋白抗原檢測TBM的研究合并后顯示，產(chǎn)生的最高敏感度為87%，但特異度低(84%)。因此，仍需要進(jìn)一步研究以確定LAM檢測對HIV高流行環(huán)境中TBM的診斷價(jià)值。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，尿液LAM抗原對兒童結(jié)核病有較好的診斷價(jià)值，其檢測的敏感度和特異度分別為83%和85%[11]。

由于體液中抗原含量較低，單一抗原檢測的方法較適合應(yīng)用于腦脊液和支氣管灌洗液等抗原含量相對高的體液標(biāo)本[4,6,8]，不提倡用于血清等標(biāo)本的檢測。WHO不提倡活動性結(jié)核病的血清抗原檢測。一方面，MTB特異性抗原的發(fā)現(xiàn)存在一定難度；另一主要原因在于，血清中抗原含量少，使用目前常規(guī)信號放大技術(shù)增加了檢測的不準(zhǔn)確性。因此，多種抗原同時(shí)檢測的方法能夠在一定程度上克服敏感度差的問題，同時(shí)也有助于提升特異度。

(二)多種抗原同時(shí)檢測

由于患者狀態(tài)、菌載量和感染階段的不同，結(jié)核病患者對不同MTB抗原的應(yīng)答反應(yīng)具有異質(zhì)性，單一的抗原檢測可能會造成假陽性結(jié)果的產(chǎn)生。此外，患者標(biāo)本抗原含量較低，其用于MTB檢測敏感度低。因此，多種特異性MTB抗原聯(lián)合檢測能夠在一定程度上克服敏感度差的問題，同時(shí)可以有效提高檢測的特異度[12]。

目前，已有一些較為成熟的蛋白芯片在臨床結(jié)核病診斷中得以應(yīng)用。蛋白芯片主要檢測LAM和相對分子質(zhì)量為16 000、38 000的蛋白等主要抗原，但其檢測敏感度較低，檢測肺結(jié)核和肺外結(jié)核患者的陽性率分別為66.4%和35.8%，檢測慢性消耗的肺外結(jié)核患者的陽性檢出率明顯低于肺結(jié)核患者[13]。Zhou等[14]通過谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶蛋白融合技術(shù)針對MTB分泌蛋白和跨膜蛋白成功構(gòu)建了一個(gè)含有Rv0934、Rv1411c、Rv1566c、Rv1623c、Rv1980c和Rv2031c等6個(gè)具有強(qiáng)免疫反應(yīng)性的抗原組合。多抗原聯(lián)合檢測試劑盒與市售試劑盒的對比研究顯示，聯(lián)合檢測試劑盒對活動性肺結(jié)核患者血清檢測敏感度明顯高于市售試劑盒(66.3%與31.6%)。兩種檢測方法的特異度相似，分別為89.6%和90.6%。賀仁忠等[15]共篩選了8種MTB蛋白抗原(Rv1860、Rv2031c、Rv1441c、Rv0494、Rv3301c、Rv0351、Rvl821和Rv0280)，設(shè)計(jì)了一款新型蛋白芯片，發(fā)現(xiàn)其組合檢測LTBI的特異度和敏感度分別達(dá)90.9%和83.1%，顯示了較好的診斷效能。Kasempimolporn等[16]從MTB休眠調(diào)節(jié)單元(DosR)中篩選出Rv2029c、Rv2031c、Rv2032、Rv2627c、Rv3133c、Rv3716c等6種蛋白抗原，制備成檢測試紙，用于檢測患者血清標(biāo)本，發(fā)現(xiàn)檢測LTBI 者的敏感度為75.0%，檢測非LTBI者的特異度為88.1%。在不同臨床情況下(如LTBI、活動性肺結(jié)核、結(jié)核病患者密切接觸者和其他非結(jié)核病患者的血清)，此檢測試紙的陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值分別為77.4%和86.7%。由此說明，這6種具有較強(qiáng)免疫原性的聯(lián)合抗原提高了LTBI檢測的敏感度。

質(zhì)譜技術(shù)的高通量檢測具有同時(shí)檢測多種抗原的優(yōu)勢。Kruh-Garcia等[17]采用多反應(yīng)監(jiān)測質(zhì)譜(MRM-MS)技術(shù)鑒定的抗原85B、抗原85C、Apa、BfrB、GlcB、HspX、KatG和MPT64等外分泌蛋白聯(lián)合檢測可以用來判斷MTB的活躍狀態(tài)。Ma等[18]利用兩種仿生親和層析(biomimetic affinity chromatography，BiAC)培養(yǎng)基(At-23和A115-94)以選擇性的消耗血清中白蛋白和免疫球蛋白，然后分餾后的蛋白進(jìn)行電噴霧碰撞誘導(dǎo)串聯(lián)質(zhì)譜(ESI-CID-MS/MS)分析，分別鑒定出FbpA、FbpB和BfrB等3種抗原，并經(jīng)蛋白免疫印跡(Western Blot)驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)FbpA、FbpB和BfrB在經(jīng)BiAC分離的結(jié)核病患者血清標(biāo)本中具有較高的豐度，提示這3種抗原也可以作為結(jié)核病患者檢測潛在的生物標(biāo)志物，具有較好的應(yīng)用價(jià)值。但是這些研究成果均尚未在臨床實(shí)踐中得到應(yīng)用。其最主要的原因在于質(zhì)譜和色譜分析操作技術(shù)復(fù)雜，對操作人員要求較高，同時(shí)，設(shè)備較為昂貴，并且檢測所需血清標(biāo)本量較多。因此，尋找新的抗原檢測方法或抗原富集思路對于提高實(shí)驗(yàn)條件較差的基層醫(yī)院對各種類型MTB感染的陽性檢出率具有重要意義。有研究報(bào)道，采用人的蛋白SMAD2或核呼吸因子1(NRF1)作為配體，可以同時(shí)吸附多種MTB特異性抗原[19]。這種基于配體吸附的MTB抗原檢測技術(shù)或許是一種簡便、快捷、靈敏的抗原檢測技術(shù)。

二、MTB抗原檢測的實(shí)現(xiàn)方法

(一)免疫學(xué)方法

免疫學(xué)方法具有快捷、方便和標(biāo)準(zhǔn)化程度高等優(yōu)點(diǎn)，是目前MTB抗原檢測的常用方法。免疫學(xué)方法主要的技術(shù)手段包括ELISA、化學(xué)發(fā)光、時(shí)間分辨熒光免疫分析和側(cè)向?qū)游龅?。這些相應(yīng)技術(shù)的改進(jìn)提高了MTB抗原的檢出效率。張昆南等[20]應(yīng)用改進(jìn)的斑點(diǎn)酶聯(lián)免疫吸附法分別檢測TBM患者腦脊液中培養(yǎng)濾液蛋白10(CFP-10)和ESAT-6，發(fā)現(xiàn)CFP-10檢測的敏感度為93.1%，特異度為92.5%；ESAT-6檢測的敏感度為91.4%，特異度為94.3%。兩項(xiàng)檢測的敏感度和特異度均高于針對MTB菌體或菌體物質(zhì)進(jìn)行檢測的同類研究，如抗酸染色、MTB培養(yǎng)、PCR等。這表明應(yīng)用改進(jìn)的斑點(diǎn)酶聯(lián)免疫吸附法檢測腦脊液中CFP-10和ESAT-6能提高TBM的診斷效能。Broger等[21]建立了檢測下限為pg/ml范圍內(nèi)的LAM和ESAT-6的電化學(xué)發(fā)光(ECL)免疫分析方法，發(fā)現(xiàn)檢測尿液標(biāo)本中LAM和ESAT-6用于結(jié)核病診斷的總體敏感度分別為93%和65%，檢測血清標(biāo)本中LAM和ESAT-6用于結(jié)核病診斷的總體敏感度分別為55%和46%；在所有檢測的總體特異度為97%。而且無論HIV感染狀況如何，檢測敏感度的進(jìn)一步提高都可以通過優(yōu)化檢測技術(shù)和試劑成分來實(shí)現(xiàn)。這表明這種方法檢測肺結(jié)核患者尿液標(biāo)本的診斷準(zhǔn)確度較高。時(shí)間分辨熒光免疫法(TRFIA)是以鑭系元素標(biāo)記抗原或抗體，并與時(shí)間分辨測定技術(shù)結(jié)合而建立起來的一種新型非放射性微量免疫分析技術(shù)，具有高敏感度、可定量、線性范圍寬、穩(wěn)定性強(qiáng)、成本低等優(yōu)勢。王雪梅等[22]使用該法測定胸腔積液標(biāo)本CFP-10水平，取CFP-10表達(dá)水平臨界值為11.92 ng/ml時(shí)，其檢測結(jié)核性胸腔積液的敏感度和特異度分別為96.23%和94.00%，高于結(jié)核感染T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)(T-SPOT.TB)檢測血清標(biāo)本的敏感度和特異度(分別為82.08%和90.00%)。側(cè)向?qū)游黾夹g(shù)中最常見的實(shí)現(xiàn)方法是由膠體金標(biāo)記技術(shù)發(fā)展起來的膠體金免疫快速診斷技術(shù)，主要有快速斑點(diǎn)免疫金滲濾法和膠體金免疫層析法，具有操作簡便、快速、無需儀器設(shè)備，試劑性能穩(wěn)定及成品易于保存等優(yōu)點(diǎn)，在近幾年得到快速發(fā)展。崔光輝等[23]分別用斑點(diǎn)金免疫滲濾試驗(yàn)、PCR和痰涂片法檢測肺結(jié)核患者血清標(biāo)本，發(fā)現(xiàn)斑點(diǎn)金免疫滲濾試驗(yàn)檢測陽性率為82.14%，明顯高于痰涂片(37.14%)和PCR(58.57%)。

(二)質(zhì)譜技術(shù)

質(zhì)譜分析技術(shù)在檢測的敏感度、特異度、分析速度、多指標(biāo)同時(shí)檢測等方面有非常大的優(yōu)勢，在新生兒遺傳代謝病篩查、維生素及激素監(jiān)測、治療藥物監(jiān)測、微生物鑒定等領(lǐng)域已有應(yīng)用。它是將樣品分子經(jīng)過離子化后，利用其不同質(zhì)荷比(m/z)的離子在靜電場或磁場中受到的作用力不同而改變運(yùn)動方向，使其彼此在空間上分離，最后通過收集和檢測這些離子得到質(zhì)譜圖譜，實(shí)現(xiàn)分析目的的一種分析方法。此外，質(zhì)譜分析技術(shù)受樣本處理復(fù)雜及成本高等限制，目前尚未大范圍推廣使用。

Fan等[24]用液相色譜-質(zhì)譜法定量檢測HIV感染者血清中MTB毒力因子CFP-10，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)陽性和陰性肺結(jié)核患者CFP-10檢出率分別為89.6%和66.7%，檢測非結(jié)核病對照組的特異度為88%。血清CFP-10抗原檢測和培養(yǎng)對60例肺結(jié)核患者的確診率分別為85%和80.0%。結(jié)果表明，該法檢測肺結(jié)核患者血清CFP-10效能高，且能發(fā)現(xiàn)分枝桿菌培養(yǎng)漏檢的患者。Szewczyk等[25]用電噴霧電離-串聯(lián)質(zhì)譜法分析了在分枝桿菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)中起關(guān)鍵作用的分枝桿菌酸?；?0個(gè)最豐富和最具特征的多反應(yīng)監(jiān)測對，對MTB和幾株非結(jié)核分枝桿菌的粗脂肪酸混合物進(jìn)行了有針對性的分析。該研究發(fā)現(xiàn)了分枝桿菌酸的獨(dú)特特征，從而能夠可靠地鑒定分枝桿菌種類。在對波蘭結(jié)核病患者和非結(jié)核病患者的病例-對照研究中，該方法顯示出了快速診斷活動性結(jié)核病方面的潛在價(jià)值，其敏感度和特異度均超過了現(xiàn)有方法。Nicoara等[26]建立并優(yōu)化了一種基于選擇性離子監(jiān)測的氣相色譜-質(zhì)譜法，用于檢測MTB細(xì)胞膜鄰苯二甲酸甘油酯的熱輔助水解和甲基化產(chǎn)物。研究發(fā)現(xiàn)，該方法的最低檢出限為400 CFU/ml(CFU為菌落形成單位)，表明其可用于快速定量檢測MTB，有可能應(yīng)用于人類和獸醫(yī)臨床實(shí)驗(yàn)室，以快速診斷結(jié)核病。

(三)納米技術(shù)

目前，隨著納米技術(shù)的不斷發(fā)展，利用納米材料的獨(dú)特特性檢測MTB生物標(biāo)志物為結(jié)核病的診斷提供了更高效率和準(zhǔn)確性。MPT64是MTB生長早期和中期產(chǎn)生的抗原，可誘導(dǎo)體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)。Thakur等[27]利用聚(3,4-乙烯二氧噻吩)-碳納米管納米復(fù)合材料研制了一種檢測MPT64抗原的電化學(xué)DNA適體傳感器，發(fā)現(xiàn)15 min內(nèi)檢出MPT64的檢出限為0.5 fg/ml，具有較高的敏感度和響應(yīng)時(shí)間。Bai等[28]通過用信號適體標(biāo)記金納米粒子裝飾的富勒烯-聚苯胺納米復(fù)合材料(GNPs-C60-Pan)，構(gòu)建了一種新型基于信號生成和放大的相對簡單且超靈敏的電化學(xué)適體傳感器，用于測定MPT64抗原。研究觀察到MPT64的線性檢測范圍為0.02～1000 pg/ml，檢測限為20 fg/ml，具有對目標(biāo)抗原高選擇性的特點(diǎn)。更重要的是，它對結(jié)核病患者血清樣本中MPT64的檢測也表現(xiàn)出良好的特異度和敏感度，為檢測MTB感染提供了一種快速和高效的方法。Chen等[29]利用一種新型的由富勒烯納米粒子、氮摻雜碳納米管和氧化石墨烯組成的碳納米復(fù)合材料(C60NPs-N-CNTs/GO)，研制了一種新型的夾心型電化學(xué)適體傳感器。研究發(fā)現(xiàn)，在最優(yōu)條件下該適體傳感器對MPT64的線性檢測范圍為1 fg/ml～1 ng/ml，檢測限低至0.33 fg/ml，并成功用于人血清中MPT64抗原的檢測，顯示出良好的應(yīng)用前景。

目前，MTB抗原檢測的納米技術(shù)不斷發(fā)展。與傳統(tǒng)結(jié)核病檢測方法相比，納米技術(shù)具有更高的檢測效能。盡管如此，構(gòu)建一種快速、經(jīng)濟(jì)和便捷的檢測臨床標(biāo)本的納米技術(shù)，仍面臨諸多挑戰(zhàn)。高成本、復(fù)雜的儀器和技術(shù)要求限制了納米技術(shù)在結(jié)核病高負(fù)擔(dān)的低收入和發(fā)展中國家中的使用。因此，基于納米材料的便攜式結(jié)核病檢測技術(shù)仍需不斷發(fā)展。

三、問題與展望

綜上所述，隨著技術(shù)的進(jìn)步，MTB抗原在檢測技術(shù)和研究思路上都取得了較大的進(jìn)展，但仍存在一些問題。首先，敏感度高的特異性抗體和相應(yīng)的商業(yè)化試劑盒缺乏，雖有高效抗體報(bào)道，但仍局限于小樣本研究，缺乏大樣本量的臨床評估。此外，痰液、支氣管灌洗液和胸、腹腔積液等蛋白或細(xì)胞成分含量較高的臨床標(biāo)本中MTB抗原濃度低，檢測困難。

MTB抗原研發(fā)的方向應(yīng)注重多種特異性抗原同時(shí)檢測。隨著新型納米材料和傳感方法的發(fā)展，這些材料和傳感方法可以通過增強(qiáng)各種因素，包括選擇性、敏感度、長期穩(wěn)定性、再現(xiàn)性和成本效益等，為結(jié)核病的快速診斷帶來新的前景。隨著特異性強(qiáng)、免疫原性好的抗原的不斷發(fā)現(xiàn)和研究，在新的抗原富集方法和信號放大技術(shù)的支持下，MTB抗原檢測必將得到新的完善和發(fā)展，并且因其在標(biāo)本處理、操作步驟及儀器設(shè)備等方面具有優(yōu)勢而獲得更多青睞。