靈芝種質(zhì)資源評價研究進展※

●王 飛 于 婭 王 娜 李艷軍 王 鵬 霍云龍 宮國輝

（吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟植物研究所 吉林 長春 136105）

靈芝是我國傳統(tǒng)的名貴中藥材，擁有2000多年的歷史[1]，早在醫(yī)書《神農(nóng)本草經(jīng)》和《本草綱目》中就有記載，其具有明目、安神、堅筋骨、補肝益氣等功效，久服可強身健體，素有“瑞芝” “仙草”的美譽[2]?，F(xiàn)代研究表明，靈芝含有豐富的生物活性物質(zhì)，如多糖、三萜、甾醇、多酚、氨基酸和微量元素等[3-5]，對提高免疫力、抗血栓、降血糖血壓、改善肝功能、鎮(zhèn)咳祛痰平喘、預(yù)防心腦血管疾病等具有一定的作用[6-9]。隨著藥用保健功能的開發(fā)和利用，靈芝越來越受到人們的青睞，需求量增加，栽培面積也逐年擴大。截至2018年底，我國靈芝產(chǎn)量約16 800萬千克，產(chǎn)值近3000億[10]。種質(zhì)資源是靈芝生產(chǎn)和遺傳育種的基礎(chǔ)，其特異性、一致性和穩(wěn)定性的好壞決定生產(chǎn)能否順利進行以及育種工作能否成功，而對種質(zhì)資源進行科學(xué)、系統(tǒng)的評價是合理利用的前提[11]。

1 靈芝種質(zhì)資源概況

我國地理環(huán)境優(yōu)越，靈芝種質(zhì)資源豐富，分布較為廣泛，北緯25°～45°間的29個省市有分布[12]，如海南、云南、貴州、福建、廣西、廣東、浙江、湖北、江蘇、山東、吉林等。根據(jù)顏色的不同靈芝可分為赤芝、紫芝、青芝、白芝、黃芝和黑芝[13]，其中赤芝和紫芝已被納入《中華人民共和國藥典》。

我國靈芝育種研究工作者十分重視靈芝種質(zhì)資源資源的收集和利用，在全國范圍內(nèi)開展了靈芝種質(zhì)資源的調(diào)查評價、優(yōu)異種質(zhì)的篩選、野生菌株馴化、原生質(zhì)體融合等一系列工作，選育出一批優(yōu)良品種[14-19]。19個品種通過國家和省級審定，其中國審品種4個，分別為‘金地靈芝’‘山東泰赤-1’‘川芝6號’和‘G26’；省審品種15個，有‘榮保1號’‘靈芝昆侖山-6’‘湘赤芝1號’‘仙客來靈芝1號’ ‘芝102’‘仙芝1號’和‘上海市滬農(nóng)靈芝1號’等[20]。

2 形態(tài)學(xué)評價

形態(tài)學(xué)評價是通過肉眼對靈芝菌絲體和子實體形態(tài)進行客觀評價。評價指標一般包括菌落的濃密程度、顏色、菌絲的生長速度、色素的分泌情況、生育期、子實體性狀和產(chǎn)量等，涉及從菌絲體到子實體的整個生長發(fā)育過程[11]。形態(tài)學(xué)評價是目前作物種質(zhì)資源評價中最傳統(tǒng)、經(jīng)濟、直觀的方法。孟麗等[21]采用形態(tài)學(xué)評價對11個靈芝主栽品種的菌絲生長速度和長勢、菌蓋形狀和色澤、孢子形態(tài)和產(chǎn)量進行對比，結(jié)果表明，‘泰芝’ ‘赤芝8號’‘赤芝H504’和‘赤芝H506’可作為生產(chǎn)品種，其菌絲長勢強、子實體商品性狀好，產(chǎn) 孢 多；‘赤 芝H505’‘紫 芝H503’‘黃 芝248’和‘鹿角H508’可作為觀賞品種，其子實體出菇一致，性狀和色澤好，產(chǎn)孢少。蘭玉菲等[22]以29個靈芝種質(zhì)資源為供試材料，以菌絲生長速度、菌蓋直徑、厚度、菌蓋色澤、菌柄直徑和長度、生物學(xué)效率作為評價指標，通過聚類分析將供試資源分為兩個大類群，靈芝亞屬和樹舌亞屬，其中靈芝亞屬又分成3個亞類群，為引種提供參考。金鑫等[23]通過對5份不同的靈芝資源進行形態(tài)學(xué)評價，發(fā)現(xiàn)不同資源的菌蓋直徑、厚度、菌柄長度和轉(zhuǎn)化率存在明顯差異，黃芝生育期長、菌蓋大且厚，轉(zhuǎn)化率較高；‘圓芝8號’整齊一致，色澤好，轉(zhuǎn)化率高；平芝生育期短，分支多，產(chǎn)孢量多；‘金地靈芝’表現(xiàn)中等，靈白整齊度較差。吳伯文[24]篩選了15個經(jīng)原生質(zhì)體單核化后雜交的靈芝菌株進行田間性狀產(chǎn)量、子實體外形、抗雜能力的綜合評價，獲得2份優(yōu)異的雜交菌株‘金山102’和‘金山120’?？卤箝臶25]通過對65個無柄靈芝雜交菌株的菌絲長勢、抗雜能力進行評價，獲得40個抗雜能力強且長勢較好的菌株，經(jīng)與雜交親本的農(nóng)藝性狀對比評價，篩選出在產(chǎn)量上超親遺傳的菌株G13/19和G13/10；66個赤芝雜交菌株通過菌絲生長特性的評價，獲得46個抗雜能力強且長勢較好的菌株，其中5株菌絲生長速度超過親本，對雜交菌株及親本的折干率、生育期、產(chǎn)量、子實體形態(tài)等指標進行評價，X19/H4的子實體大小和產(chǎn)量優(yōu)勢明顯，J7/AL22生育期短，屬于早熟的菌株，J19/AL8商品性狀較好，可為下一步的育種工作提供重要的參考依據(jù)。

3 藥用成分評價

20世紀70年代科研工作者開始對靈芝成分和相關(guān)的藥理藥效展開研究。目前已知的靈芝藥用成分包括多糖、三萜類、酚類、呋喃類、油脂類、核苷類、甾醇類等，其中多糖和三萜是不同靈芝種質(zhì)資源藥用成分評價的主要指標。鄭林用[26]通過對18個來源不同的靈芝種質(zhì)資源的多糖和三萜含量進行對比分析，發(fā)現(xiàn)紫芝多糖含量最高為2.348%，三萜含量最低僅0.371%，而京大靈芝三萜含量最高為5.788%，多糖含量最低，僅為0.879%，說明不同的靈芝資源藥用成分含量差異顯著。劉平[27]以18個靈芝菌株為供試材料，評價各菌株菌絲體的胞外多糖含量，篩選出多糖高產(chǎn)菌株‘榮保靈芝1號’。陳勇[28]對15個野生靈芝資源的多糖和三萜檢測結(jié)果表明，野生菌株P(guān)2多糖含量最高，G、P2、X1和G7三萜含量超過5%，綜合各資源的多糖和三萜評價結(jié)果，發(fā)現(xiàn)P2的藥用成分最高。郭金英等[29]采用苯酚硫酸法對14個靈芝品種的多糖含量進行評價，發(fā)現(xiàn)多糖含量在1%以上的靈芝品種有3個，分別為野生白靈芝（3.05%）、野生云芝（2.44%）和‘泰山3號’（1.22%），其余11個品種的多糖含量較低，均在1%以下。陳凌華等[30]通過評價53份靈芝資源的藥用成分，發(fā)現(xiàn)多糖含量由高到低的順序為靈芝紫芝＞樹舌靈芝＞密紋靈芝＞赤芝＞松山靈芝，結(jié)果表明不同亞屬間多糖含量存在顯著差異，這為靈芝種屬間藥用價值的研究提供了參考。目前研究工作者建立了多糖和三萜的HPLC和TLC 指紋圖譜[31-33]，為靈芝種質(zhì)資源的質(zhì)量評價奠定基礎(chǔ)。

4 分子生物學(xué)評價

分子生物學(xué)評價可在基因水平上直接反映生物體的本質(zhì)區(qū)別，對靈芝DNA序列進行分析，不受環(huán)境條件和人為因素的影響，也不受基因是否表達的影響，對種質(zhì)資源的評價更精準可靠。用于靈芝種質(zhì)資源評價的分子標記主要有ITS、RAPD、ISSR、SRAP、SCAR、SSR。肖自添等[34]篩選10個ISSR引物對24份靈芝種質(zhì)資源的遺傳差異性進行評價，相似系數(shù)在0.71水平上分為4個類群，類群Ⅰ為美芝和雜交赤芝，特點為菌絲生長速度快，菌蓋厚度??；類群Ⅱ為野生靈芝；類群Ⅲ為菌蓋近圓形靈芝；類群Ⅳ的特點為菌柄長、菌蓋腎形。陳小敏等[35]采用ISSR和ITS分子標記技術(shù)對四川地區(qū)采集的野生靈芝資源進行遺傳多樣性評價，評價結(jié)果表明，ITS標記構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹將供試的12份資源分成兩類，即赤芝和紫芝；ISSR聚類結(jié)果在0.54水平上，同樣也將供試資源分成兩類，其中SICAU-6和SICAU-9相似系數(shù)最小，遺傳距離最大，親緣關(guān)系較遠，為親本的選配和遺傳改良提供參考依據(jù)。李睿[36]基于RAPD和SRAP標記對24份靈芝種質(zhì)資源擴增數(shù)據(jù)進行分析，RAPD的多態(tài)性比率為55.3%，將供試菌株分成2個類群；SRAP的多態(tài)性比率為53.4%，將供試菌株分成3個類群，評價結(jié)果為供試的24份種質(zhì)資源的親緣關(guān)系較近，遺傳多樣性水平較低。徐曉蘭等[37]基于2012年公布的靈芝全基因組序列開發(fā)60對SSR引物，篩選擴增出24對多態(tài)性條帶引物，26個供試菌株的相似系數(shù)分布在0.02～0.73，其中‘赤芝6號’和‘赤芝Ga66’的遺傳距離最小，‘泰山’靈芝和‘赤芝KG’遺傳距離最大，親緣關(guān)系最遠，在相似系數(shù)0.17水平上，26個菌株可分成4類，說明供試靈芝資源具有豐富的遺傳多樣性。許美燕等[38]關(guān)于152個靈芝菌株的聚類研究結(jié)果表明，在遺傳距離為0.85處將供試菌株建成48個基因池，用ISSR和SRAP引物對48個DNA 池進行擴增，采用和ISSR引物（TTCCC）3和SRAP引物me3-em13獲得4條特異性片段，經(jīng)回收、連接轉(zhuǎn)化、測序，設(shè)計特異引物，引物準確性驗證，開發(fā)出4個可用菌株遺傳相關(guān)性檢測的SCAR標記，為靈芝種質(zhì)資源遺傳多樣性評價提供快速可靠的特異性標記。

5 展望

我國靈芝種質(zhì)資源豐富，隨著研究的深入，越來越多的靈芝資源被發(fā)掘利用。目前在形態(tài)學(xué)方面，對于藥用靈芝種質(zhì)資源的評價指標主要集中在菌絲長勢和子實體大小、顏色、形狀及產(chǎn)量，而往往忽視了能帶來最大經(jīng)濟效益的指標——孢子粉產(chǎn)量；對于觀賞用靈芝種質(zhì)資源的評價較少，子實體外觀和產(chǎn)孢量可作為重要評價指標。因此，針對不同用途的靈芝資源評價指標應(yīng)該有不同的側(cè)重。

靈芝作為一種名貴的中藥材，基于藥用成分的評價尤為重要，不同資源的藥用成分差異較大。篩選對提高免疫和抗衰老有療效的資源時，可將多糖作為主要的評價指標；篩選對肝功能疾病有療效的資源時，可將三萜作為主要的評價指標。同時研究表明，靈芝的藥用成分含量與形態(tài)學(xué)性狀沒有相關(guān)性。因此靈芝種質(zhì)資源的評價要權(quán)衡形態(tài)學(xué)性狀中的重要指標和藥用成分進行綜合評價，建立資源的標準分級評價體系。

優(yōu)良品種的選育是靈芝產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的前提，利用分子生物技術(shù)進行的遺傳多樣性評價能從DNA序列水平上反映種質(zhì)資源間的親緣關(guān)系，可為親本選配提供參考依據(jù)，防止近交退化，提高育種和保種效率。目前已經(jīng)開展了一定的靈芝種質(zhì)資源分子生物學(xué)評價研究，在此基礎(chǔ)上需要繼續(xù)增加分子標記種類和數(shù)量，建立重要性狀的基因定位，構(gòu)建遺傳連鎖圖譜，為靈芝的新品種選育工作奠定基礎(chǔ)。