珍珠粉復合支架在骨修復的研究進展*

張 楷 徐 普

骨缺損是較為常見的一種疾病，每年至少有數(shù)百萬相關(guān)病例需要進行骨修復。而珍珠粉具有良好的生物相容性，價格低廉、易獲取，因而有進一步深入相關(guān)研究的必要[1,2]。現(xiàn)在學者常將珍珠粉制備成復合支架，進行實驗室研究和動物實驗，以研究其骨修復能力，故本文選取常用相關(guān)復合支架以探討其性能及發(fā)展前景。

1.珍珠粉在骨修復的作用

珍珠粉主要產(chǎn)于珍珠貝類和珠母貝類軟體動物體內(nèi)，由珍珠研磨而成。很早以前即開始應(yīng)用于人類醫(yī)學，作為中藥歷史悠久[3,4]，有明目[5]、護肝[6]、緩解心律失常[7]、抗皮膚衰老[8]等功效，同時，也可消炎抑菌[9]、促進創(chuàng)口愈合[10]。其理化和生物學特性接近骨[11]，自Lo?pez 發(fā)現(xiàn)其成骨潛能以來受到國內(nèi)學者廣泛的關(guān)注[12]。

其組成、結(jié)構(gòu)類似骨,由95%的無機物和5%的蛋白質(zhì)、多糖、幾丁質(zhì)等有機物組成[1]。無機部分多為碳酸鈣，可作為成骨的原料。相比羥基磷灰石，珍珠粉的有機基質(zhì)可作為粘接劑分布于碳酸鈣板層間，二者形成的磚墻結(jié)構(gòu)使珍珠具有良好的力學性能，同時也增強了骨誘導和蛋白吸附能力[1,13]。雖然只占5%，但有機基質(zhì)才是珍珠粉對于生物活性起主要作用的成分。一方面，它可促進成骨細胞增殖和分化，并產(chǎn)生新的界面結(jié)構(gòu)，影響表面穩(wěn)定性和調(diào)節(jié)組織特性，在晶體成核、微觀結(jié)構(gòu)中起著相當重要的作用[14]。另一方面，有機基質(zhì)本身也有多種促進成骨效果的成分。珍珠蛋白N16能抑制核因子κB受體活化因子配體，減少破骨細胞的骨吸收，而骨形態(tài)蛋白2也使得其相比羥基磷灰石有更好的骨再生活性[15,16]。

珍珠粉可促進細胞外基質(zhì)合成和組織再生，體內(nèi)外實驗均顯示了它有良好的生物相容性以及優(yōu)于羥基磷灰石的成骨作用及骨誘導性[17]。陳靈將其植入兔股骨遠端缺損處，3個月后可見骨缺損邊界模糊，新生組織幾乎覆蓋完全。而CBCT顯示材料基本降解完全，缺損邊緣新生成組織的灰度值與周圍正常骨組織相近。同時組織學觀察發(fā)現(xiàn)有大量的軟骨細胞及軟骨基質(zhì)增生，有較明顯軟骨化現(xiàn)象[18]。而毛秋華實驗發(fā)現(xiàn)，將其浸提液加入肘部靜脈血后溶血率為僅為1.01%，注入兔背部皮內(nèi)72 h后皮膚無紅斑和水腫表現(xiàn)[19]。鄭斌將其與小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)細胞毒性為Ⅰ級，細胞形態(tài)呈梭形、無明顯改變，未見大面積細胞脫落，符合我國生物材料應(yīng)用標準，與同濃度納米羥基磷灰石相比，具有更好的細胞相容性，是良好的骨修復材料[20]。而將其小鼠成骨細胞共培養(yǎng)后，廖軍發(fā)現(xiàn)，在各時間點堿性磷酸酶活性高于加入納米羥基磷灰石的陽性實驗組，且細胞匯合呈集落生長,細胞間紅褐色，茜素紅結(jié)節(jié)面積可達45.79% ，亦大于納米羥基磷灰石組[21]。

然而，該材料孔隙率較低，機械強度不足以有效支撐，且不易成形，在體內(nèi)易流失[14,22]，有機基質(zhì)將無機質(zhì)連接成同一晶型方向的結(jié)構(gòu)也阻礙了其降解，故臨床上需要將珍珠粉作為功能性填料，制成復合支架，進行骨組織工程以改善其性能，使之易加工、便于操作，作用持久[1,23]。

2.珍珠粉復合支架在骨修復中的作用

骨組織工程是目前修復骨缺損最有前景的方法之一，即將自體細胞種植于支架內(nèi)，培養(yǎng)一段時間后移植體內(nèi)，以修復骨組織[24]。而構(gòu)建支架對組織工程技術(shù)最為關(guān)鍵，即采用支架為種子細胞、生長因子提供空間，自身降解的同時引導新骨的長入，達到骨修復的目的。

能與珍珠粉共同制備成復合支架的材料，多為可降解聚合物，如聚乳酸、聚乳酸-羥基乙酸、聚己內(nèi)酯、多羥基苯甲酸酯、透明質(zhì)酸、殼聚糖等?？筛鶕?jù)需要人為調(diào)節(jié)理化及生物學性能，實現(xiàn)高孔隙率和表面積。其降解速度可控、產(chǎn)物可吸收，故而能避免二次手術(shù)。同時易成型，可在無機非金屬材料之間可充當粘接劑[25]。但是，純聚合物單一組分的生物活性較弱，且它們多存在機械性能不足、降解快且產(chǎn)物呈酸性而引起不良反應(yīng)等缺點，骨傳導、骨誘導能力尚不足[26]。而將珍珠粉均勻分散于支架中，可與可降解聚合物取長補短，使其獲得理想的孔隙結(jié)構(gòu)和強度，更有利于細胞的生長及礦化，從而提高成骨效果[27]。因此，以聚合物為基質(zhì)、無機非金屬材料為功能填料的復合支架得到了廣泛發(fā)展。

目前研究最多的珍珠粉復合支架為珍珠粉/殼聚糖-透明質(zhì)酸復合支架和珍珠粉/聚乳酸復合支架[1,28]。

2.1 珍珠粉/聚乳酸復合支架及珍珠粉/聚乳酸-羥基乙酸復合支架聚乳酸由L-乳酸、D-乳酸聚合而成，易于加工制成有各種孔結(jié)構(gòu)和孔隙率的三維多孔支架，且降解產(chǎn)物易為人體所吸收，在各種珍珠粉復合支架中最廣為學者所研究[28]。

珍珠粉均勻分布于支架，可改善支架親水性和成骨效果。朱磊制備出圓柱體的左旋聚乳酸/珍珠層粉復合支架，電鏡下見階梯狀多孔結(jié)構(gòu)，孔壁和邊緣上珍珠層粉均勻分布，未見明顯團聚，部分珍珠層粉粘附在左旋聚乳酸表面，使孔壁粗糙。將其植入兔1.5 cm橈骨骨缺損處，12周時骨折斷端有大量骨痂連接，骨髓腔基本再通達到骨性愈合[29]。而珍珠粉的結(jié)構(gòu)也影響著性能，Qianli Huang將文石結(jié)構(gòu)的聚乳酸/文石復合支架與人成骨肉瘤細胞SaOS-2共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)3天后細胞接近融合，邊界模糊，在第4 天和第7 天，對SAOS-2細胞的堿性磷酸酶活性有促進作用，14天后，觀察到左旋聚乳酸/文石支架表面形成骨樣結(jié)節(jié)，探測到Ca、P元素，骨鈣蛋白和骨橋蛋白的表達水平顯著升高。證明要聚乳酸/文石復合支架對細胞的促進增殖作用與成骨作用要優(yōu)于聚乳酸/球文石復合支架[23]。乳酸可造成酸性環(huán)境，但相關(guān)實驗無明顯炎癥反應(yīng)，劉淵聲認為，這是因為珍珠粉堿性產(chǎn)物提供了相對穩(wěn)定的環(huán)境，中和了酸性，也延緩了支架降解，故無明顯炎癥反應(yīng)[30]，也有學者認為這是由于其酸性弱，對高孔隙率支架影響過小[23]。除此以外，也有人將抗生素加入了支架，制成了同時具備抗感染和成骨能力的利福平/莫西沙星-聚乳酸-羥基乙酸共聚物微球，將其植入兔長度、直徑6 mm的橈骨感染性骨缺損模型，8周后Micro?-CT見無感染跡象，新生骨在骨缺損處形成持續(xù)愈合的骨組織，表明其在治療感染性骨缺損方面具有顯著的潛力[28]。

然而聚乳酸自身機械強度不足，且有大量酯鍵，因此親水性、生物相容性不足，故而骨誘導性不足。除此以外，其降解緩慢，難以控制降解周期[30]。而羥基乙酸擁有較好的生物降解性、生物相容性，可與聚乳酸共聚形成聚乳酸-羥基乙酸[31]。因此，胡濤以低溫沉積法1:1還原制備了珍珠粉/聚乳酸-羥基乙酸下頜骨骨塊[32]?？赏ㄟ^聚乳酸-羥基乙酸與珍珠粉的比例控制其降解速率，通常羥基乙酸含量越高，降解越快，但比例為1：1時，降解最快[30]。珍珠粉的引入能改善支架的壓縮強度等綜合性能，尤以聚乳酸-羥基乙酸：珍珠粉比例為5：2時綜合評價最好：壓縮彈性模量為36.097MPa；接觸角為77.98°；14 天降解了40.23%。

2.2 珍珠粉/聚己內(nèi)酯復合支架聚己內(nèi)脂由己內(nèi)酯單體聚合而來，具有良好的生物相容性，在37°C生理溶液中比較穩(wěn)定，與珍珠粉幾乎無化學反應(yīng)，因此具有長期的機械強度[22]。雖力學性能不足，且本身疏水，不利于細胞粘附生長，但可溶于多種有機溶劑，通過與其他材料共混或表面改性來改善自身不足[33]。

三維打印法是較新穎的支架制備技術(shù)，能精細控制支架的孔徑、孔隙率和強度，在口腔領(lǐng)域應(yīng)用愈發(fā)增多[34]。杜曉宇用三維打印法制備出的具有約350 mm大孔，強度約8 Mpa的珍珠粉-硫酸鈣/聚己內(nèi)脂復合支架，大體滿足松質(zhì)骨抗壓強度的要求，同時也能調(diào)節(jié)支架降解并穩(wěn)定環(huán)境PH變化。相比其他組，隨著珍珠粉含量增加，支架力學強度得到了更好的改善，骨髓間充質(zhì)干細胞的細胞增長率及細胞在支架表面的增長率也顯著增加。這表明珍珠粉含量可調(diào)控復合支架的理化和生物學性能[35]。而Xu Zhang等通過三維打印制備了不同濃度珍珠粉的復合支架，使孔徑得到了嚴格控制，規(guī)則均勻的500 μm方形大孔結(jié)構(gòu)與58.4%的孔隙率利于細胞血管長入、細胞增殖分化，也保證了支架2.47±0.40 MPa到7.58±0.15 MPa的近似于骨小梁的抗壓強度[22]。

2.3 珍珠粉/聚3-羥基丁酸-3-羥基戊酸共聚物(po?ly lactic-co?-glyco?lic acid，PHBV)復合支架PHBV是微生物合成的高分子材料。因其降解性、生物相容性和優(yōu)異的材料改性而被廣泛研究。降解物不含有害物質(zhì)，且有很好的誘導骨細胞生長的作用。但是，該材料也有機械性能不足、熱穩(wěn)定性低、強疏水性等不足，無法單獨使用[36]。

白敬敬發(fā)現(xiàn)不含珍珠粉的試樣在1-3天羥基磷灰石增長率小，長量約為0.23 mg/cm2，而后增長率增加，但小于加珍珠粉的復合薄膜。這是因為前者礦化初期會先形成晶核，而含珍珠粉的PHBV薄膜會釋放鈣離子，使周圍局部濃度升高，羥基磷灰石更快成核及沉積，在相同條件下生成羥基磷灰石更多。同時，為了緩釋藥物、治療腫瘤，白敬敬又采用電紡法制備了載阿霉素(do?xo?rubicin,DOX)的DOX/PHBV/珍珠粉靜電紡纖維支架，發(fā)現(xiàn)珍珠粉含量高則緩釋藥物快，其對于腫瘤的治療有一定的前景[37]。

2.4 珍珠粉/殼聚糖-透明質(zhì)酸復合支架殼聚糖由氨基葡萄糖和N-二氨基葡萄糖組成，生物相容性、降解性、粘附力、可塑性較優(yōu)，也有良好的擴散特性[38]。雖然有抑菌、促進愈合等優(yōu)點，但也有機械性能較弱，β-（1,4）鍵導致的降解過快等不足。然而，其陽離子性質(zhì)及氨基反應(yīng)活性，使其易修飾成各種物理或化學衍生物以改善其性質(zhì)，同時可調(diào)節(jié)體內(nèi)PH值，改善部分材料降解時產(chǎn)生的炎癥反應(yīng)[39]。

透明質(zhì)酸由存在于人體的大多數(shù)結(jié)締組織中，是細胞外基質(zhì)的主要成分。具有抗炎、抑菌、抗腫瘤的能力[40]，能調(diào)節(jié)基質(zhì)中的水分，可被用于構(gòu)建具有結(jié)構(gòu)的支架[24]。但機械性能較低，性能不穩(wěn)定，無法單獨用做骨替代材料。然而，可與殼聚糖發(fā)生反應(yīng)生成穩(wěn)定聚合物，彌補殼聚糖脆性大，黏彈性弱等缺點[41]。

為模擬骨基質(zhì)，王秋子[1]等采用低溫干燥法制成了納米珍珠粉/殼聚糖-透明質(zhì)酸復合支架。該支架的孔隙率在89%～93%之間，隨著珍珠粉的增加而略有降低。同時，復合支架的親水性和力學性能增加，但孔形態(tài)略微受到干擾，其中25%的支架表現(xiàn)尤為明顯。珍珠粉含量較高的支架有利于小鼠顱頂前成骨細胞增殖和分化，其中珍珠粉含量為10 wt%和25 wt%的支架效果最好，第14天，逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)可見添加10%和25%納米珍珠粉的支架骨鈣蛋白、成骨特異性轉(zhuǎn)錄因子的表達均高于對照組(P<0.05)。并且蛋白印跡條帶清晰，形狀規(guī)則，與對照組相比，添加10%和25%納米珍珠粉的復合支架對骨鈣蛋白、骨橋蛋白、I型膠原蛋白和成骨特異性轉(zhuǎn)錄因子的蛋白的合成增加。而骨鈣蛋白、骨橋蛋白、I型膠原蛋白和成骨特異性轉(zhuǎn)錄因子基因的表達上調(diào)可能是其促進分化的機制之一[42,43]。

2.5 其他復合支架除組成上述支架以外，珍珠粉還可與聚氨基酸[44]等可降解聚合物以及硫酸鈣[45]等骨水泥復合成支架，骨形態(tài)蛋白2[46]等生長因子作為第三要素亦可載入其中，但物理刺激等第四元素尚少見于相關(guān)支架。

3.珍珠粉及其復合支架在骨修復應(yīng)用中的可能機制

一方面，珍珠粉可以通過經(jīng)絲裂原活化蛋白激酶/細胞外信號調(diào)節(jié)激酶信號通路促進細胞自噬，從而促進成骨細胞分化[47]。另一方面，它能抑制破骨細胞組織蛋白酶K進而減少骨吸收[48,49]。除此以外，珍珠粉還可通過c-Jun氨基末端激酶信號通路調(diào)控Fo?s相關(guān)抗原-1表達促進成骨細胞礦化[50]。

珍珠粉的各組分也有促進骨修復的作用。其無機部分多為碳酸鈣，多孔性結(jié)構(gòu)可令生物組織可長入其中并與其表面鍵合，同時產(chǎn)生成骨作用，因此具有骨傳導性[38]。同時，其降解時可改變鈣離子濃度，隨之產(chǎn)生的堿性微環(huán)境也可刺激成骨細胞活性[51]。它也具有良好的生物相容性，能促進成骨細胞的粘附生長，誘導骨形成，因此具有骨誘導性[22]。雖然有機基質(zhì)只占5%，但該部分才是珍珠粉對于生物活性起主要作用的成分。一方面，它可促進成骨細胞增殖和分化，并產(chǎn)生新的界面結(jié)構(gòu)，有機/無機界面的電荷可影響表面穩(wěn)定性和調(diào)節(jié)組織特性，在晶體成核、微觀結(jié)構(gòu)中起著相當重要的作用[14]。另一方面，有機基質(zhì)能清除細胞內(nèi)活性氧自由基及抑制脂質(zhì)體氧化，維持活性，阻止成骨細胞凋亡[15]。而珍珠的有機基質(zhì)本身也有多種促進成骨效果的成分。珍珠蛋白N16能抑制核因子κB受體活化因子配體，減少破骨細胞的骨吸收，而骨形態(tài)蛋白2也使得其相比羥基磷灰石有更好的骨再生活性[15,16]。

將珍珠粉均勻分散于支架中，可與可降解聚合物取長補短，使其獲得理想的孔隙結(jié)構(gòu)和強度，提高親水性。更有利于細胞的生長及礦化，從而提高成骨效果[27]。同時，降解產(chǎn)物產(chǎn)生的堿性微環(huán)境可穩(wěn)定環(huán)境PH，減輕部分可降解聚合物導致的炎癥[30]。

4.總結(jié)和展望

因相關(guān)蛋白與磚墻結(jié)構(gòu)，珍珠粉具有優(yōu)于羥基磷灰石的成骨性能和生物相容性。制成復合支架時，也能均勻分散于支架，從而提高力學性能和親水性。同時，降解產(chǎn)物產(chǎn)生的堿性微環(huán)境可穩(wěn)定環(huán)境PH，減輕部分可降解聚合物導致的炎癥。

目前研究較多的為珍珠粉/聚乳酸復合支架以及珍珠粉/殼聚糖-透明質(zhì)酸復合支架。在搭載藥物方面，不少支架已開始探尋抗感染、抗腫瘤的方法，以及在制備方法上使用三維打印令孔隙形狀更適合細胞的長入和力學性能的改善。在眾多研究中，珍珠粉復合支架均展現(xiàn)了其潛力，但目前僅是實驗室研究和簡單的動物實驗，與其它材料的比較也需進一步探索。與此同時，種子細胞的研究，金屬離子摻雜的研究，磁等物理刺激的研究等，尚少見于珍珠粉復合支架。同時，細胞毒性、成血管、免疫排斥等性質(zhì)以及何種復合支架更適合人體骨修復仍需進一步研究。