Caspase家族參與乳牙根吸收牙髓組織細(xì)胞凋亡的研究進(jìn)展

林珊如，錢 虹，呂婧雯，蕭曼雪

與恒牙牙根的病理性根外吸收和內(nèi)吸收相比，生理性根吸收是乳牙牙根特有的正常的生理現(xiàn)象[1]，其為繼承恒牙的萌出預(yù)留出足夠的空間，避免了恒牙的異位萌出，這一過(guò)程對(duì)于繼承恒牙的萌出至關(guān)重要[2]。在乳牙牙根生理性吸收過(guò)程中，牙髓組織的減少與細(xì)胞程序性死亡，即細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。天冬氨酸特異性蛋白水解酶(cysteine-containing aspartate-specific protease，Caspase)是一種促使細(xì)胞凋亡的蛋白酶，在細(xì)胞凋亡機(jī)制網(wǎng)絡(luò)中處于核心地位[3-4]。本文就乳牙生理性根吸收過(guò)程中牙髓組織的細(xì)胞凋亡及Caspase家族在其中發(fā)揮作用的研究現(xiàn)狀作一綜述。

1 乳牙根吸收過(guò)程中牙髓組織發(fā)生細(xì)胞凋亡

牙髓位于髓腔和根管內(nèi)，是一種富含血管的疏松結(jié)締組織，內(nèi)含大量長(zhǎng)梭形的成纖維細(xì)胞、纖維及血管，在近牙本質(zhì)側(cè)有呈柵欄狀排列的成牙本質(zhì)細(xì)胞[5-6]。研究發(fā)現(xiàn)，在根吸收早期，牙髓中細(xì)胞的排列及數(shù)目正常，成牙本質(zhì)細(xì)胞層連續(xù)。隨著根吸收的進(jìn)行，根尖部近根吸收區(qū)域出現(xiàn)破牙細(xì)胞，成牙本質(zhì)細(xì)胞層開始不連續(xù)，部分成牙本質(zhì)細(xì)胞被日漸活躍的破牙細(xì)胞替代[7-9]。隨著乳牙生理性根吸收的進(jìn)行，牙髓中細(xì)胞的數(shù)目逐步減少。在牙根吸收完成時(shí)，牙髓組織基本失去了原有的組成和結(jié)構(gòu)，主要表現(xiàn)在成牙本質(zhì)細(xì)胞減少、碎片狀的細(xì)胞增加等[10-11]。

為進(jìn)一步了解生理性根吸收過(guò)程中牙髓中細(xì)胞減少的機(jī)制，Bardellini等拔除處于生理性根吸收晚期階段的乳牙后即刻取出牙髓，固定后制作組織石蠟切片，蘇木精-伊紅染色,觀察到與恒牙牙髓相比，乳牙牙髓中大量細(xì)胞體積縮小，與周圍細(xì)胞脫離，細(xì)胞周圍出現(xiàn)清晰的白暈，胞質(zhì)和胞核皺縮，呈現(xiàn)典型凋亡細(xì)胞的形態(tài)[12-13]。細(xì)胞凋亡被廣泛認(rèn)為是一種動(dòng)態(tài)的非炎癥過(guò)程，它不會(huì)引起免疫系統(tǒng)反應(yīng)[14]，在組織學(xué)水平上，凋亡小體的存在表明牙髓在生理性根吸收過(guò)程中有細(xì)胞凋亡現(xiàn)象。末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP原位缺口末端標(biāo)記法 (TdT-mediated dUTP nick-end labeling, TUNEL)和DNA瓊脂糖凝膠電泳為常規(guī)檢測(cè)細(xì)胞凋亡的方法[15]。Rodrigues等[16]應(yīng)用TUNEL法檢測(cè)牙髓細(xì)胞DNA片段顯示，乳牙牙髓中出現(xiàn)大量廣泛分布的深染細(xì)胞，這是基于凋亡細(xì)胞核與反應(yīng)底物二氨基聯(lián)苯胺發(fā)生過(guò)氧化物酶反應(yīng)，使得細(xì)胞呈暗褐色[17]。實(shí)驗(yàn)的對(duì)照組為因正畸需求而拔除的健康前磨牙，在此組中陽(yáng)性標(biāo)記的細(xì)胞分布較為稀疏。乳牙組與恒牙組分別計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞，計(jì)算凋亡指數(shù)，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果顯示乳牙牙髓細(xì)胞的凋亡指數(shù)顯著高于恒牙。除TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡外，DNA瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，在乳牙牙髓中觀察到大量DNA核小體碎裂條帶，而在恒牙中，大部分DNA仍然處于未破碎狀態(tài)。上述研究均提示乳牙生理性根吸收過(guò)程中牙髓組織中細(xì)胞數(shù)目及形態(tài)的變化與細(xì)胞凋亡相關(guān)。

2 Caspase家族與細(xì)胞凋亡

細(xì)胞凋亡這一術(shù)語(yǔ)在1972年由Kerr等[18]在一篇論文中首次使用。它是指在接收到外部或內(nèi)部信號(hào)后，機(jī)體內(nèi)細(xì)胞主動(dòng)爭(zhēng)取死亡的過(guò)程，其目的是為了更好地適應(yīng)當(dāng)前所處的環(huán)境[3]。如前文所述，乳牙的生理性根吸收是為給繼承恒牙的萌出預(yù)留出足夠的空間。細(xì)胞凋亡涉及一系列相關(guān)基因的陸續(xù)激活，相應(yīng)mRNA的表達(dá)以及調(diào)控基因的相互作用等。

細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)與執(zhí)行需要一系列蛋白分子信號(hào)共同作用，如信號(hào)分子、受體、蛋白酶等，其通路復(fù)雜，途徑多樣[19]。目前，對(duì)于乳牙生理性根吸收過(guò)程中牙髓細(xì)胞凋亡的文獻(xiàn)報(bào)道主要集中于Caspase家族和對(duì)Caspase家族起調(diào)控作用的B淋巴細(xì)胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)家族[12-13,16,20]。目前將在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮作用的Caspase分為兩類：一類是起始者，主要有Caspase-2、Caspase-8、Caspase-9、Caspase-10；另一類是執(zhí)行者，主要為Caspase-3、Caspase-6、Caspase-7[21-22]。

依據(jù)現(xiàn)有的研究結(jié)果，目前普遍認(rèn)為Caspase前體的活化主要通過(guò)以下三種路徑：①死亡受體途徑，即外源性途徑(Caspase-8/10依賴途徑)；②細(xì)胞色素c(cytochrome-c, cyt-c)誘導(dǎo)的線粒體途徑，即內(nèi)源性途徑(Caspase-9依賴途徑)；③穿孔素/顆粒酶途徑[19,23]。這三種途徑均通過(guò)活化上游的Caspase酶原起始蛋白，激活執(zhí)行蛋白Caspase-3，最終實(shí)現(xiàn)細(xì)胞凋亡。此外，在線粒體途徑中，Bcl-2家族作為調(diào)控者，在Caspase的活化及級(jí)聯(lián)反應(yīng)中起著調(diào)控作用[24]。Bcl-2家族中有著眾多的基因，其中與細(xì)胞凋亡相關(guān)的基因主要有抗凋亡基因Bcl-2和促凋亡基因Bcl-2相關(guān)X基因(Bcl-2 associated X,Bax)。Bcl-2蛋白和Bax蛋白二者構(gòu)成二聚體結(jié)構(gòu)，調(diào)節(jié)控制細(xì)胞凋亡的進(jìn)程[25]。

基于細(xì)胞凋亡通路的多樣化，不斷有學(xué)者進(jìn)行深入研究，試圖理清乳牙生理性根吸收過(guò)程牙髓中細(xì)胞以何種方式發(fā)生凋亡，進(jìn)一步了解其凋亡機(jī)制，為后續(xù)研究及臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

3 Caspase家族在乳牙生理性根吸收牙髓組織細(xì)胞凋亡中的研究

目前對(duì)Caspase家族作用范圍及作用機(jī)制的研究廣泛[26]，而在牙髓中細(xì)胞凋亡方面，主要集中于兩種凋亡途徑，分別為死亡受體途徑和線粒體途徑，所研究的Caspase家族成員主要為Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9,以及在線粒體途徑中起調(diào)控作用的Bcl-2和Bax。

3.1 Caspase-3

在乳牙生理性根吸收與細(xì)胞凋亡機(jī)制的研究中，均檢測(cè)到了Caspase-3在乳牙中的活躍存在。Rodrigues等[12]收集恒牙和處于根吸收晚期的乳牙，提取其牙髓組織中總RNA進(jìn)行免疫熒光PCR以及牙齒脫鈣后切片行免疫組化染色，對(duì)Caspase-3在mRNA水平和蛋白質(zhì)表達(dá)水平進(jìn)行定性定量分析，發(fā)現(xiàn)Caspase-3在乳牙牙髓中表達(dá)強(qiáng)陽(yáng)性且表達(dá)量顯著高于恒牙。此外，有研究分離培養(yǎng)乳、恒牙牙髓干細(xì)胞，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和免疫印跡試驗(yàn)檢測(cè)Caspase-3的表達(dá)，結(jié)果亦顯示Caspase-3在乳牙牙髓干細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄水平高于恒牙[20]。Bardellini等[13]著眼于牙髓中的成牙本質(zhì)細(xì)胞，通過(guò)蘇木精-伊紅染色及免疫組化染色，觀察到乳牙牙髓中成牙本質(zhì)細(xì)胞數(shù)目較恒牙明顯減少，乳牙成牙本質(zhì)細(xì)胞層中Caspase-3活躍表達(dá)。

作為Caspase家族中細(xì)胞凋亡的執(zhí)行者，無(wú)活性的Caspase-3酶原在接受上級(jí)凋亡刺激后被活化，切割其作用底物，Caspase-3對(duì)底物作用引起的變化包括：①終止細(xì)胞周期繼續(xù)進(jìn)行；②使得細(xì)胞與周圍非凋亡狀態(tài)的正常組織剝離；③打破細(xì)胞新舊更替的平衡，并使細(xì)胞無(wú)法對(duì)此進(jìn)行修復(fù)；④破壞細(xì)胞間的連接[27-28]。

3.2 Caspase-9與Bcl-2家族

有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，Caspase-9在乳牙牙髓干細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄水平高于恒牙,轉(zhuǎn)染Caspase-9 siRNA使Caspase-9基因沉默后，Caspase-3的表達(dá)顯著降低，Caspase-9的上游調(diào)控基因的表達(dá)在轉(zhuǎn)染組與未轉(zhuǎn)染組間無(wú)顯著差異[20]。因而學(xué)者認(rèn)為，Caspase-9與乳牙牙髓干細(xì)胞的凋亡有關(guān)，乳牙牙髓干細(xì)胞的凋亡可能是通過(guò)線粒體途徑進(jìn)行的。Bardellini等[13]對(duì)成牙本質(zhì)細(xì)胞的研究也發(fā)現(xiàn)，對(duì)Caspase-9起調(diào)控作用的促凋亡基因Bax在乳牙成牙本質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)較抑凋亡基因Bcl-2多。這一結(jié)果也佐證了乳牙牙髓干細(xì)胞凋亡與Caspase-9，即與線粒體途徑的相關(guān)性。

線粒體途徑是由終末分化、生長(zhǎng)因子缺乏、DNA損傷等刺激激發(fā)的。在乳牙生理性根吸收過(guò)程中，接受到凋亡信號(hào)后，這些因素克服了抗凋亡因子的抑制作用，激活了一個(gè)或多個(gè)促凋亡因子。線粒體膜的通透性提高，使得cyt-c能從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)中[29]。被釋放到細(xì)胞質(zhì)后，cyt-c和凋亡酶激活因子-1(apoptosis protease activating factor-1,Apaf-1)以及脫氧腺苷三磷酸(deoxyadenosine triphosphate，dATP)相結(jié)合。Apaf-1在凋亡小體中處于中心的角色，它的作用是招募并且活化Caspase-9。在沒有凋亡信號(hào)刺激的情況下，apaf-1以單分子的形式存在。然而，當(dāng)遇到cyt-c和dATP時(shí)，Apaf能與這二者特異性結(jié)合，形成一個(gè)輪狀的信號(hào)平臺(tái)，即凋亡小體，從而激活Caspase-9[24]。Caspase-9酶原被活化后，激活位于下游的執(zhí)行者Caspase-3，從而執(zhí)行細(xì)胞凋亡。此外，被活化的Caspase-3又能進(jìn)一步活化Caspase-9酶原，從而形成一種正反饋調(diào)節(jié)，加速細(xì)胞凋亡的進(jìn)程[27]。在此途徑中，Bcl-2及Bax作為一對(duì)調(diào)控基因，可促進(jìn)或抑制Caspase-3酶原的活化[30]。

3.3 Caspase-8

目前對(duì)于Caspase-8在乳牙與恒牙牙髓中表達(dá)的多寡尚存爭(zhēng)議。在Rodrigues等[12]的研究中Caspase-8在乳牙和恒牙中均呈低水平表達(dá)。然而有研究發(fā)現(xiàn)Caspase-8在乳牙牙髓干細(xì)胞中mRNA水平高于恒牙，但Caspase-8沉默組與對(duì)照組間Caspase-3的表達(dá)未見明顯差異[20]。這一結(jié)果否定了Caspase-8介導(dǎo)的死亡受體途徑與乳牙牙髓組織細(xì)胞凋亡的關(guān)系。牙髓干細(xì)胞的體外研究不能完全模擬體內(nèi)微環(huán)境，且現(xiàn)有研究水平數(shù)量及深度尚不足，因此，死亡受體途徑是否參與了乳牙根吸收過(guò)程中牙髓組織細(xì)胞的凋亡仍有待商榷。

4 總結(jié)與展望

當(dāng)前研究表明，細(xì)胞凋亡在乳牙生理性根吸收時(shí)期牙髓細(xì)胞的清除過(guò)程中占據(jù)重要地位，且很有可能是通過(guò)內(nèi)源性途徑，即cyt-c誘導(dǎo)的線粒體調(diào)節(jié)途徑實(shí)現(xiàn)的。目前對(duì)于乳牙生理性根吸收過(guò)程中細(xì)胞凋亡的研究較少，研究對(duì)象多是牙髓中的所有細(xì)胞。而牙髓組織中細(xì)胞種類豐富，目前僅針對(duì)整體或極個(gè)別種類細(xì)胞，如牙髓干細(xì)胞、成牙本質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行研究，所得實(shí)驗(yàn)結(jié)果不具有代表性，并不能表明牙髓組織中所有細(xì)胞均通過(guò)同一凋亡路徑實(shí)現(xiàn)凋亡，目前仍未明確是否存在其他凋亡通路。

現(xiàn)有研究表明咀嚼壓力、繼承恒牙胚壓力、遺傳因素等均會(huì)導(dǎo)致乳牙生理性根吸收[31]，也就是說(shuō)，在沒有繼承恒牙的情況下乳牙仍有可能會(huì)發(fā)生生理性根吸收，脫落后將導(dǎo)致牙列缺損。牙齒發(fā)育異常的患病率為(6.53±3.33)%，先天缺牙將對(duì)兒童的頜面部發(fā)育及咀嚼功能產(chǎn)生影響[32]，而兒童處于生長(zhǎng)發(fā)育期，種植修復(fù)的時(shí)機(jī)及預(yù)后不明確[33]，理清乳牙生理性根吸收過(guò)程中的凋亡機(jī)制，或許能為相關(guān)研究提供理論基礎(chǔ)，從而為錯(cuò)牙合畸形的預(yù)防提供思路。