破骨細(xì)胞細(xì)胞膜融合的研究現(xiàn)狀

李心照， 康非吾

（上海牙組織修復(fù)與再生工程技術(shù)研究中心，同濟(jì)大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，同濟(jì)大學(xué)附屬口腔醫(yī)院口腔頜面外科，上海 200072）

破骨細(xì)胞是在特定的情況下由造血系統(tǒng)中的單核細(xì)胞融合而成的多核細(xì)胞， 是目前發(fā)現(xiàn)的唯一一個(gè)具有骨吸收功能的細(xì)胞。 它的分化過(guò)程復(fù)雜而有序， 破骨細(xì)胞的體積大小與骨吸收功能相關(guān)， 所以融合過(guò)程對(duì)于破骨細(xì)胞的骨吸收功能活性至關(guān)重要。 細(xì)胞融合是2 個(gè)或多個(gè)單核細(xì)胞形成多核細(xì)胞的過(guò)程， 對(duì)多核細(xì)胞的發(fā)育及行使功能至關(guān)重要。

近年來(lái)，人們對(duì)破骨細(xì)胞融合相關(guān)分子機(jī)制的研究越來(lái)越多，這就為治療破骨細(xì)胞相關(guān)的骨代謝疾病提供了新的治療靶點(diǎn)。 本文旨在對(duì)一些破骨細(xì)胞融合的研究現(xiàn)狀進(jìn)行綜述。

1 破骨細(xì)胞融合的過(guò)程

細(xì)胞融合通常見(jiàn)于受精發(fā)生、胎盤(pán)生成、炎癥形成、肌肉和骨骼發(fā)育等過(guò)程中，并在每個(gè)過(guò)程中起到了不可替代的作用。 破骨細(xì)胞的融合過(guò)程包括2 個(gè)破骨細(xì)胞前體細(xì)胞間相互識(shí)別后， 細(xì)胞質(zhì)膜變形，其磷脂雙分子層相互接觸，形成外層小葉混合的半融合結(jié)構(gòu)， 接著內(nèi)層小葉融合形成融合孔，融合孔緩慢擴(kuò)張，使得細(xì)胞內(nèi)容物完全混合，即完成細(xì)胞融合[1]。

2 破骨細(xì)胞融合的機(jī)制

1 個(gè)多核破骨細(xì)胞形成的過(guò)程中包括多種類(lèi)型的細(xì)胞融合，例如2 個(gè)單核細(xì)胞之間的融合，1 個(gè)多核細(xì)胞與1 個(gè)單核細(xì)胞的融合，以及2 個(gè)多核細(xì)胞之間的融合。 而形成多核破骨細(xì)胞的過(guò)程中以1 個(gè)單核細(xì)胞和1 個(gè)多核細(xì)胞間的融合為主。 這是一個(gè)多基因調(diào)控且多因素控制的過(guò)程， 其中核因子κB受體活化因子配體（receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand，RANKL）及巨噬細(xì)胞集落刺激因子 （macrophage colony-stimulating factor，M-CSF）為最主要的2 類(lèi)細(xì)胞因子。 RANK 與其受體結(jié)合后激活TRAF6 信號(hào)通路， 同時(shí)激活下游的NF-κB 和MAPK 通路，最終激活轉(zhuǎn)錄因子活化T 細(xì)胞核因子c1（nuclear factor of activated T-cells，NFATc1），增加了破骨相關(guān)基因的表達(dá)， 調(diào)控破骨細(xì)胞的分化融合，從而促進(jìn)破骨細(xì)胞形成[2-3]。

3 破骨細(xì)胞融合的影響因素

3.1 物理因素

3.1.1 低氧 在異常的低氧狀態(tài)下，低氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）是目前發(fā)現(xiàn)的在骨組織或細(xì)胞中適應(yīng)低氧微環(huán)境最直接的調(diào)控因子。 本課題組在前期的研究[4]過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，HIF-1αfl/fl/ctsk-cre C57 破骨細(xì)胞條件性敲除小鼠原代單核細(xì)胞誘導(dǎo)分化的Trap 染色結(jié)果可見(jiàn)，CKO 組小鼠細(xì)胞未見(jiàn)明顯分化，Trap 陽(yáng)性面積和數(shù)量明顯小于對(duì)照組， 表明HIF-1α 的缺失顯著抑制RANKL 及M-CSF 誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化及生成的數(shù)量。 Huang 等[5]的研究表明，缺氧可促進(jìn)口腔鱗癌細(xì)胞與人永生化口腔上皮細(xì)胞的自發(fā)融合，為細(xì)胞融合和癌癥之間的聯(lián)系提供一個(gè)新的思路。

3.1.2 微重力和輻射 微重力下缺乏負(fù)重和宇宙輻射都被認(rèn)為是造成航天員骨質(zhì)丟失和骨質(zhì)疏松癥的風(fēng)險(xiǎn)因素。 研究者在體外模擬微重力條件，用不同劑量的γ 射線照射細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)僅0.1 Gy 劑量的輻射就可以刺激破骨細(xì)胞融合，包括Trap 和樹(shù)突狀細(xì)胞特異性跨膜蛋白 （dendritic cell-specific transmembrane protein，DC-STAMP）的表達(dá)增加。然而，當(dāng)劑量超過(guò)0.5 Gy 時(shí)，破骨細(xì)胞融合減少。 而與輻射暴露相比， 模擬微重力誘導(dǎo)了更高程度的細(xì)胞融合，且這2 種環(huán)境因素的影響呈相加效應(yīng)[6]。

3.2 化學(xué)因素

3.2.1 多糖 糖尿病會(huì)引起一系列的骨代謝性疾病。有研究表明，高糖在RANKL 誘導(dǎo)單核細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化的過(guò)程中會(huì)抑制c-fos、NFATc1 等轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，從而影響破骨細(xì)胞的分化[7]。 而c-fos、NFATc1 等在破骨細(xì)胞分化融合中也起到一定的作用[2]，因此我們推測(cè)高糖可能在細(xì)胞融合過(guò)程中發(fā)揮作用。

3.2.2 無(wú)機(jī)磷 在患有嚴(yán)重的腎功能衰竭并伴有骨代謝障礙的高磷血癥患者中，其血清中的無(wú)機(jī)磷（Pi）會(huì)升高。 Arioka 等[8]的研究表明，Pi 通過(guò)抑制鼠破骨細(xì)胞前體細(xì)胞中的NFATc1 和DC-STAMP 表達(dá)來(lái)抑制破骨細(xì)胞生成。 可能是Pi 通過(guò)抑制c-fos的表達(dá)， 影響轉(zhuǎn)錄因子AP-1 結(jié)合位點(diǎn)抑制了DCSTAMP 啟動(dòng)子活性。

3.3 生物因素

3.3.1 炎癥 有學(xué)者證明了四環(huán)素類(lèi)抗生素米諾環(huán)素成功地抑制了腫瘤壞死因子-α （tumor necrosis factor α，TNF-α） 誘 導(dǎo) 的MDA-MB-435 癌 細(xì) 胞 與M13SV1 乳腺上皮細(xì)胞的融合[9]。除RANKL 外，TNF-α、脂 多 糖（lipopolysaccharide，LPS）、肽 聚 糖（peptidoglycan，PGN）均可誘導(dǎo)細(xì)胞融合，而在不同的處理下，融合過(guò)程中NFATc1 和DC-STAMP 的表達(dá)量無(wú)明顯差異。

3.3.2 膜蛋白 DC-STAMP 是由Tm7s4 基因編碼的7 次跨膜蛋白， 在樹(shù)突狀細(xì)胞或白細(xì)胞介素4（interleukin 4，IL-4） 活化的巨噬細(xì)胞中首次被發(fā)現(xiàn)。 它在破骨細(xì)胞形成過(guò)程中對(duì)細(xì)胞間融合至關(guān)重要。DC-STAMP 能夠在RANKL 的刺激下表達(dá)增加，且在DC-STAMP 缺陷小鼠體內(nèi)外破骨細(xì)胞的多核性完全消失，但破骨細(xì)胞分化標(biāo)志物表達(dá)正常，表明破骨細(xì)胞細(xì)胞融合而不是分化需要DC-STAMP[10]。在體外，抗DC-STAMP 單克隆抗體成功地阻斷了破骨細(xì)胞的形成，在體內(nèi)DC-STAMP-/-的條件性敲除小鼠具有輕度骨質(zhì)疏松癥，并僅形成具有有限吸收能力的單核細(xì)胞[11]。

破骨細(xì)胞多次跨膜蛋白 （osteoclast stimulatory transmembrane protein， OC-STAMP） 是一種與DCSTAMP 在結(jié)構(gòu)與功能上都類(lèi)似的6 次跨膜蛋白，屬于G 蛋白偶聯(lián)受體超家族成員，編碼基因在結(jié)構(gòu)上高度保守。 它也受到RANKL/RANK 信號(hào)通路的調(diào)控。Witwicka 等[12]發(fā)現(xiàn)，6 周的OC-STAMP 基因缺陷小鼠股骨的干骺端Trap 陽(yáng)性區(qū)數(shù)目較少且面積較小，但血清中骨轉(zhuǎn)換標(biāo)志正常。與M-CSF 和RANKL培養(yǎng)時(shí)，單核細(xì)胞沒(méi)有融合，通過(guò)慢病毒轉(zhuǎn)染恢復(fù)敲除細(xì)胞中的OC-STAMP 可恢復(fù)融合和吸收。

CD47 即整合素相關(guān)蛋白， 其可以作為信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白a（signal regulatory protein-a，SIRP-a）的配體影響破骨細(xì)胞前體細(xì)胞之間的識(shí)別進(jìn)而影響破骨細(xì)胞融合。在體外實(shí)驗(yàn)中，敲除或抑制CD47 的活性可導(dǎo)致Trap 陽(yáng)性的多核破骨細(xì)胞數(shù)量明顯減少[13]。

CD44 是一種細(xì)胞表面糖蛋白， 在多核破骨細(xì)胞中，共聚焦顯微鏡顯示骨橋蛋白（osteopontin，OPN）和CD44 在運(yùn)動(dòng)性破骨細(xì)胞中高度共存。在OPN 缺失和CD44 缺失小鼠產(chǎn)生的破骨細(xì)胞中， 細(xì)胞移動(dòng)和偽足突起減少，細(xì)胞融合受損，破骨細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)性和吸收活性明顯受損[14]。

ATP6v0d2 是破骨細(xì)胞質(zhì)膜中質(zhì)子泵的重要組成部分， 是骨吸收過(guò)程中細(xì)胞外酸化的輔助物質(zhì)。Lee 等[15]認(rèn)為，小鼠ATP6v0d2 的缺失可引起有缺陷的破骨細(xì)胞生成，導(dǎo)致骨量顯著增加，ATP6v0d2 缺乏并不影響破骨細(xì)胞的分化或v-ATPase 活性，但是破骨細(xì)胞前體融合需要ATP6v0d2。

人內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒HERVW1 的包膜蛋白Syn cytin-1（Syn-1）在胎盤(pán)滋養(yǎng)細(xì)胞中高度表達(dá)，在人類(lèi)胎盤(pán)生成中介導(dǎo)融合，已被證明在破骨細(xì)胞生成中同樣發(fā)揮作用。 Syn-1 的表達(dá)促進(jìn)了2 個(gè)多核破骨細(xì)胞之間的融合，但不能促進(jìn)2 個(gè)單核破骨細(xì)胞前體之間的融合。 抑制Syn-1 的活性可以同時(shí)抑制多核破骨細(xì)胞的形成和破骨細(xì)胞成熟的生化標(biāo)記物Trap 的表達(dá)[16]。

ATP 是P2X7 受體（purinergic receptor，P2X7R）的激動(dòng)劑，P2X7R 的短暫激活可以導(dǎo)致膜的快速去極化， 在幾秒鐘內(nèi)發(fā)生膜滲透性狀態(tài)的變化。P2X7R 具有成孔作用， 使用P2X7R 的抑制劑或降低P2X7R 基因表達(dá)會(huì)顯著抑制破骨細(xì)胞前體間的融合[17]。

3.3.3 細(xì)胞因子 巨噬細(xì)胞炎性蛋白1-α 也稱(chēng)趨化因子配體3（chemokine ligand 3，CCL3），是一種調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞向炎癥關(guān)節(jié)轉(zhuǎn)運(yùn)的趨化因子。Jordan 等[18]關(guān)于CCL3 在炎性關(guān)節(jié)炎中作用的研究顯示，抑制破骨細(xì)胞相關(guān)的CCL3 減少了破骨細(xì)胞前體細(xì)胞的融合和破骨細(xì)胞的骨吸收功能，同時(shí)減輕了關(guān)節(jié)炎相關(guān)的骨丟失。

B 細(xì)胞淋巴瘤6（B-cell lymphoma 6 protein，Bcl6）可抑制破骨細(xì)胞分化，并抑制DC-STAMP、NFATc1、組織蛋白酶K 等破骨細(xì)胞基因的表達(dá)。Bcl6 基因缺陷小鼠表現(xiàn)出破骨細(xì)胞生成增強(qiáng)和骨量減少[19]。

4 破骨細(xì)胞融合的生理病理學(xué)意義與展望

破骨細(xì)胞的融合過(guò)程十分復(fù)雜，其中涉及到了很多細(xì)胞因子及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)控，目前已知的DC-STAMP、CD 分子、Syn-1 等因子在破骨細(xì)胞融合過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。 生理狀態(tài)下，由成骨細(xì)胞介導(dǎo)的新骨形成和破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨質(zhì)吸收之間保持著一種動(dòng)態(tài)平衡，以此來(lái)保持骨骼系統(tǒng)的強(qiáng)度和完整性。 而當(dāng)機(jī)體處于如骨質(zhì)疏松、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、 牙周炎等病理狀態(tài)時(shí)，DC-STAMP 等破骨細(xì)胞融合蛋白表達(dá)增加， 導(dǎo)致破骨細(xì)胞過(guò)度融合，破壞成骨與破骨之間的平衡，造成溶骨性破壞。 然而破骨細(xì)胞的大小與其生物學(xué)功能直接相關(guān)，并且破骨細(xì)胞在骨代謝的過(guò)程中發(fā)揮著不可替代的功能，對(duì)于維持骨環(huán)境的穩(wěn)態(tài)必不可少。 因此，破骨細(xì)胞形成過(guò)程中細(xì)胞融合這一關(guān)鍵步驟的研究，能夠幫助我們進(jìn)一步了解破骨細(xì)胞的生物學(xué)機(jī)制，為臨床上治療相關(guān)的骨代謝疾病提供新的思路。