高同型半胱氨酸血癥人群的腸道菌群特征研究

趙梓汝，李業(yè)榮，賈海英，王珍，胡峰，孟令軍，劉彧

1.中央廣播電視總臺辦公廳醫(yī)療保障處，北京 100859；2.中國人民解放軍戰(zhàn)略支援部隊特色醫(yī)學(xué)中心特勤健康管理科

腸道微生物在人體內(nèi)部形成龐大而復(fù)雜的微生態(tài)系統(tǒng)，在調(diào)控多種腸道內(nèi)外疾病風(fēng)險中起著至關(guān)重要的作用，尤其對腹腔疾病、代謝綜合征、心血管疾病和肥胖等有著較大的影響[1]。目前，國內(nèi)外對人體內(nèi)同型半胱氨酸(Hcy)水平與腸道菌群結(jié)構(gòu)和相關(guān)益生菌豐度之間聯(lián)系的研究欠缺，有限的相關(guān)研究也主要來自嚙齒動物實驗。有研究表明,補充益生菌可減輕高Hcy引起的損傷，改善尿毒癥者的腸上皮屏障功能[2]。高蛋氨酸飲食會改變小鼠腸道菌群，增加擬桿菌門(Bacteroidetes)和卟啉單胞菌科(Porphyromonadaceae)細(xì)菌的相對豐度[3]。通過限制飲食中的蛋氨酸攝入，可以提升小鼠腸道菌群中一些能產(chǎn)生短鏈脂肪酸(SCFA)的細(xì)菌種群豐度，并同時減少一些產(chǎn)生脂多糖(LPS)和促炎的菌群豐度[4]。

本研究采用Illumina Hiseq 2500高通量基因測序平臺的16S rRNA測序技術(shù)對20例高Hcy組和37例健康對照組的糞便細(xì)菌基因組進(jìn)行分析，探討Hcy水平與腸道微生物組結(jié)構(gòu)的聯(lián)系，為深入研究人體內(nèi)Hcy和腸道菌群分布特征提供參照，并為高Hcy相關(guān)疾病的致病因素研究和相關(guān)益生菌治療提供證據(jù)。

1 對象與方法

1.1 研究對象 本研究共納入2019年10月至2020年10月在中國人民解放軍戰(zhàn)略支援部隊特色醫(yī)學(xué)中心體檢的57例志愿者，將受試者嚴(yán)格分為高Hcy組和健康對照組，其中20例Hcy水平較高成年人群為高Hcy組，37例為同期在該院體檢的Hcy正常的成年健康人群為健康對照組。納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡范圍18～63歲,常住地為北京市。排除標(biāo)準(zhǔn)：胃腸道疾病等嚴(yán)重腸道菌群紊亂病史者，6個月內(nèi)服用過抗生素或益生菌等影響腸道菌群結(jié)構(gòu)的藥物者。本研究經(jīng)過中國人民解放軍戰(zhàn)略支援部隊特色醫(yī)學(xué)中心倫理委員會審查和批準(zhǔn)，并得到全部研究對象書面的知情同意。

1.2 檢測方法

1.2.1 糞便樣本采集及DNA提取 在體檢時使用無菌器皿收集57例研究對象的新鮮糞便樣品5.0 g，置于無菌冷凍試管中，封口后于1 h內(nèi)送至中國科學(xué)院微生物研究所實驗室中，稱取2.00 g糞便，余置于-80 ℃超低溫冰箱內(nèi)保存。提取樣本總DNA，DNA提取通過Kit KAPA HiFi HotStart DNA Polymerase試劑盒進(jìn)行，使用VORTEX-5渦旋振蕩器結(jié)合QMGEN Vonex適配器按照操作手冊流程完成核酸純化(組織樣本選擇使用組織勻漿儀)。使用Nano Drop查看核酸的純度和濃度，將DNA樣品存放于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 高同型半胱氨酸血癥(HHcy)標(biāo)準(zhǔn) 根據(jù)HHcy診療專家共識[5]：參照成人HHcy共識標(biāo)準(zhǔn)，及共識中我國成人血正常值在13～14 μmol/L之間，將血Hcy≥15 μmol/L者納入高Hcy組。

1.2.3 16S rRNA基因測序 將檢測合格的微生物DNA樣本按指定區(qū)域進(jìn)行PCR擴增、文庫制備、文庫質(zhì)檢、定量，使用設(shè)定的TAG序列進(jìn)行樣本區(qū)分。采用Illumina Hiseq 2500高通量測序平臺對檢測合格的文庫進(jìn)行測序。第1次擴增時，使用16S rRNA V3-V4區(qū)的通用引物[338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3)和806R (5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)]進(jìn)行擴增，純化后，進(jìn)行第2次擴增，引入index序列，文庫均一化后進(jìn)行上機測序。根據(jù)barcode序列區(qū)分樣本，提取的數(shù)據(jù)以標(biāo)準(zhǔn)fastq格式保存。根據(jù)PE reads之間的overlap采用Flash軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接，對原始測序數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)清洗，分析數(shù)據(jù)只保留高質(zhì)量(Q值≥25)的堿基比例大于等于90%的reads，否則舍棄。采用QIIME軟件中的usearch 8.0軟件進(jìn)行嵌合體序列的檢測及過濾。

1.3 生物信息學(xué)分析

1.3.1 物種分類與豐度分析 將原始數(shù)據(jù)拼接、過濾、去嵌合體后，留下有效TAG。根據(jù)97%的序列相似性水平，利用QIIME軟件包中的Uclust方法進(jìn)行Operational Taxonomie Units(OTU)聚類分析。

基于Silva參考數(shù)據(jù)庫，對每個樣品的OTUs進(jìn)行物種分類學(xué)(Taxonomy)注釋，對樣本腸道菌群分別進(jìn)行物種組成和分類分析。

1.3.2 α多樣性分析 α多樣性是指一個特定區(qū)域或生態(tài)系統(tǒng)內(nèi)的多樣性。多樣性指數(shù)是反映樣本中微生物豐富度和均勻度的綜合指標(biāo)。本研究根據(jù)OTU豐度表，分別檢測并計算2組樣品中物種數(shù)量、菌群豐度Chao指數(shù)、多樣性指數(shù)Shannon指數(shù)及Simpson指數(shù)，對人群的腸道菌群群落進(jìn)行α多樣性分析。Chao指數(shù)越大，表示樣本中微生物物種數(shù)量越多，Shannon指數(shù)越大、Simpson指數(shù)越小，表示樣本中微生物群落多樣性越高。

1.3.3 β多樣性分析 β多樣性分析是對不同樣本的微生物群落構(gòu)成進(jìn)行比較分析。根據(jù)歸一化的OTU豐度表進(jìn)行PCoA主坐標(biāo)分析，對腸道菌群豐富度和均勻度進(jìn)行β多樣性分析。

1.3.4 LEfSe差異分析 使用LEfSe(LDA Effect Size)分析來探究高Hcy組和健康對照組腸道菌群之間豐度差異特征，并找到與豐度有統(tǒng)計學(xué)差異的類群，同時采用線性判別分析(LDA)來估算不同物種豐度對組間差異效果影響的大小，判定差異的物種。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 使用R軟件包進(jìn)行統(tǒng)計分析，對組間差異進(jìn)行t檢驗或wilcoxon rank sum test，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2組人群特征描述 高Hcy組和健康對照組年齡分別為(50.0±8.0)歲和(49.2±6.3)歲,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。高Hcy組男性占100%，健康對照組男性占78.4%。在健康體檢人群中女性HHcy者較少。

2.2 樣品測序數(shù)據(jù)分析 57份糞便樣品腸道菌群16S rRNA測序數(shù)據(jù)經(jīng)數(shù)據(jù)過濾和嵌合體序列檢測并去除后，共得到5 499 806條有效序列，總樣品平均有效序列為96 487.82條，樣本的Q20均在90%以上。選擇相似水平為97%的OTU，獲得的OTU總數(shù)為2 006個，其中2組共有的OUT為994個，高Hcy組有特有的屬5個，健康對照組有特有的屬13個。

2.3 α多樣性分析 所有樣本的腸道菌群α多樣性分析箱形圖見圖1。以Hcy-H表示高Hcy組樣本，以Hcy-L表示Hcy正常的健康對照組樣本。α多樣性分析結(jié)果顯示，高Hcy組樣本腸道菌群的微生物物種數(shù)量多于健康對照組，但并未顯示出明顯區(qū)別(P=0.20)。其他多樣性指數(shù)上，仍表現(xiàn)為高Hcy組樣本高于健康對照組，但未顯示出統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，表示2組間的腸道菌群多樣性無明顯差異，僅表現(xiàn)為隨同型半胱氨酸升高而增加的趨勢。

圖1 α多樣性分析箱形圖

2.4 β多樣性分析 所有樣本的腸道菌群β多樣性分析主坐標(biāo)分析PCoA圖，見圖2?；谙到y(tǒng)發(fā)育樹未加權(quán)的Unifrac距離矩陣主坐標(biāo)分析，高Hcy組樣本之間物種豐度和構(gòu)成較遠(yuǎn)，而健康對照組樣本之間的關(guān)系則更近。高Hcy患者腸道菌群結(jié)構(gòu)與健康對照組人群腸道菌群結(jié)構(gòu)有一定的差異,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

圖2 未加權(quán)Unifrac主坐標(biāo)分析的PCoA圖

2.5 群落相對豐度 高Hcy組和健康對照組之間糞便菌群組成有一定差異。圖3為在門水平的腸道菌群相對豐度柱狀圖，展示了所占豐度比重前15的物種。數(shù)據(jù)顯示，擬桿菌門(Bacteroidetes)在高Hcy組和健康對照組中都占據(jù)最大的比重，分別占全部腸道菌群的46.43%和49.48%，但2組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(W=308,P>0.05)。其次是厚壁菌門(Firmicutes)，分別占41.51%和37.65%，2組之間差異也無統(tǒng)計學(xué)意義(W=441,P>0.05)。其余細(xì)菌按相對豐度比重大小為變形菌門(Proteobacteria)，分別占7.39%和6.04%，2組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(W=303,P>0.05)、放線菌門(Actinobacteria)，占4.01%和4.27%，2組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(W=268,P>0.05)、梭桿菌門(Fusobacteria)，占0.11%和1.40%，2組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(W=498.5,P<0.05)、疣微菌門(Verrucomicrobia)，占0.3%和0.98%，2組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(W=255.5,P>0.05)、藍(lán)細(xì)菌(Cyanobacteria)占0.05%和0.03%，2組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(W=344,P>0.05)。故在門水平，僅梭桿菌門的豐度在健康對照組腸道菌群中顯著高于高Hcy組樣本。

圖3 門水平腸道菌群群落結(jié)構(gòu)柱狀圖

腸道菌群的微生物組成展現(xiàn)出一定的個體差異，尤其在健康對照組中，如擬桿菌門在樣本中所占比重最高達(dá)81.93%，最低為18.40%，該最大最小值皆出現(xiàn)在健康對照組中。厚壁菌門在樣本中所占比重最大值為73.74%，最小值為15.20%，也出現(xiàn)在健康對照組中。

在基于屬水平的相對豐度分析顯示，屬水平上豐度較高的細(xì)菌在2組之間有較大差異。占全部腸道菌群比重最大的是擬桿菌屬(Bacteroides)，在高Hcy組樣本中占35.19%，在健康對照組中占29.11%，2組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(W=431，P>0.05)。其后依次是普雷沃氏菌屬(Prevotella9)、糞桿菌屬(Faecalibacterium)、布勞特氏菌屬(Blautia)、雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)、毛螺菌屬(Lachnospira)，各屬2組之間均差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，F(xiàn)usicatenibacter在高Hcy組中占2.46%，在健康對照組中占1.31%，2組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(W=596，P<0.01)，大腸桿菌志賀氏菌(Escherichia-Shigella)在高Hcy組中占2.24%，在健康對照組中占1.16%，2組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(W=515，P<0.05)，羅斯氏菌屬(Roseburia)在高Hcy組中占1.09%，在健康對照組中占1.86%，2組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(W=538，P<0.01)，而直腸真桿菌(Eubacteriumrectalegroup)、另枝菌屬(Alistipes)、考拉桿菌屬(Phascolarctobacterium)、巨單胞菌屬(Megamonas)、狄氏副擬桿菌(Parabacteroides)、巴恩斯氏菌屬(Barnesiella)各屬2組之間均差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。故在屬層次，F(xiàn)usicatenibacter、大腸桿菌志賀菌、羅斯氏菌屬在高Hcy組樣本中的豐度均顯著高于健康對照組。其余屬并未在2組之間表現(xiàn)出具有統(tǒng)計學(xué)意義的平均豐度差異。

2.6 LEfSe差異分析 使用線性判別分析(LDA)和進(jìn)化分支圖來探究LEfSe(LDA Effect Size)差異分析(圖4)。結(jié)果顯示，在OTU水平上，高Hcy組和健康對照組樣本的微生物群的優(yōu)勢種群和系統(tǒng)發(fā)育分布都存在一定差異。圖4左圖為針對高Hcy組和健康對照組中具有>2.0的差異豐度的特征計算的LDA值分布柱狀圖(log10)，右圖為進(jìn)化分支圖，以不同顏色表示了在2組樣本組中起到重要作用的微生物類群。根據(jù)設(shè)置的LDA值標(biāo)準(zhǔn)，在高Hcy組的腸道菌群中，共有13種有顯著差異的細(xì)菌展現(xiàn)出較高的影響力，分別為普雷沃氏菌科(Prevotellaceae)、巨單胞菌屬(Megamonas)、副薩特氏菌屬(Parasutterella)、柯林斯氏菌屬(Collinsella)、紅椿桿菌綱(Coriobacteriia)、擬普雷沃菌屬(Alloprevotella)、球腸菌科(Enterococcaceae)、脫硫弧菌屬(Desulfovibrio)和瘤胃球菌(RuminococcusGauvreauiiGroup)。

高Hcy組腸道菌群中最豐富的差異菌群主要為普雷沃氏菌屬(Prevotella9)和巨單胞菌屬(Megamonas)(LDA值>3)。在健康對照組中，共有11屬顯著差異的細(xì)菌展現(xiàn)出較大的影響，其中最占優(yōu)勢的主要差異細(xì)菌類群為艾克曼菌(Akkermansia)和疣微菌屬(Verrucomicrobiaceae)(LDA值>3)。

LEfSe分析生成的進(jìn)化分支圖(圖4右圖)，顯示了2組樣品群落中由門至屬的分類級別上，豐度差異最大的細(xì)菌類群。

圖4 通過LDA分?jǐn)?shù)和LEfSe分析對高Hcy組和健康對照組的腸道菌群進(jìn)行表征：黃色圈表示無顯著差異的物種，紅色圈表示高Hcy組樣本中起到重要作用的微生物類群，綠色圈表示健康對照組中起到重要作用的微生物類群，圈的直徑大小與相對豐度大小成正比

3 討論

研究證實腸道菌群與人體能量代謝和多種慢性疾病有密切關(guān)系。本研究對高Hcy組和健康對照組腸道菌群樣本進(jìn)行16S rRNA測序分析，以檢測其核心細(xì)菌分布，最終發(fā)現(xiàn)高Hcy組的腸道菌群與健康人群相比，有多種細(xì)菌在高Hcy組腸道菌群中有著與健康對照組明顯不同的豐度。在門層次，放線菌門、梭桿菌門和疣微菌門的豐度在健康對照組腸道菌群中顯著高于HHcy樣本組。在屬層次，F(xiàn)usicatenibacter、大腸桿菌志賀氏菌、羅斯氏菌屬在高Hcy組樣本中的豐度均顯著高于健康對照組。Fusicatenibacter屬于厭氧梭狀芽孢桿菌，在食物中與食物的總抗氧化能力(T-AOC)呈正相關(guān)[6]。在人體腸道菌群中，F(xiàn)usicatenibacterSaccharivorans作為一類有益菌，以葡萄糖為底物，會產(chǎn)生一些具有抗炎作用的短鏈脂肪酸(SCFA)作為發(fā)酵終產(chǎn)物，如乳酸、乙酸和琥珀酸，且同時能通過誘導(dǎo)結(jié)腸黏膜固有層單核細(xì)胞(LPMC)產(chǎn)生白細(xì)胞介素(IL)-10，最終可在人體中起到預(yù)防腸道炎癥的作用[7-8]。大腸桿菌志賀氏菌則作為一種有害菌，會產(chǎn)生志賀毒素，有研究顯示其豐度與人體中促炎細(xì)胞因子IL-1β、NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3和趨化因子配體2的濃度呈正相關(guān)[9]。羅斯氏菌屬為桿狀革蘭陽性厭氧菌，有研究顯示其在人體腸道中可影響多種代謝途徑，且可能與包括腸應(yīng)激綜合征、肥胖癥、2型糖尿病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病和過敏等多種疾病相關(guān)[10]。高Hcy組腸道菌群中最豐富的差異細(xì)菌類群(LDA>3)為普雷沃氏菌屬和巨單胞菌屬。普雷沃氏菌可刺激腸上皮細(xì)胞產(chǎn)生IL-8、IL-6和趨化因子配體20，從而促進(jìn)腸黏膜輔助性T細(xì)胞17免疫反應(yīng)和嗜中性白細(xì)胞募集，促進(jìn)一些慢性炎癥的產(chǎn)生和發(fā)展，甚至可能引起更大的全身性疾病[11]。巨單胞菌屬相關(guān)的研究則較少，有研究發(fā)現(xiàn)其未曾在歐美人群樣本中作為腸道菌群優(yōu)勢微生物出現(xiàn)，故推測其可能是亞洲人腸道菌群中特有的優(yōu)勢種，對該屬細(xì)菌在人體內(nèi)各項生理生化及代謝的研究尚有探究空間[12]。因此，在高Hcy組腸道菌群中，長期高蛋氨酸的飲食可能為Fusicatenibacter、大腸桿菌志賀氏菌、羅斯氏菌屬、普雷沃氏菌屬和巨單胞菌屬提供了更好的生長和繁殖環(huán)境。除了Fusicatenibacter可產(chǎn)生抗炎作用的短鏈脂肪酸和巨單胞菌的特性尚不明確外，其余4種細(xì)菌都會通過其代謝產(chǎn)物和分泌物對腸道上皮細(xì)胞和黏膜造成一定的破壞，最終促進(jìn)炎癥的形成，甚至造成全身性的慢性疾病，對人體內(nèi)環(huán)境帶來負(fù)面影響。本研究對于人體內(nèi)HHcy水平與這些關(guān)鍵生物標(biāo)志物種類有關(guān)聯(lián)這一事實提供了一定的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)和支持。而對于其他優(yōu)勢細(xì)菌與Hcy水平及相關(guān)疾病之間的聯(lián)系，還需進(jìn)一步探究。

本研究有一定的局限性。在本研究中，高Hcy組樣本和健康對照組的α多樣性并無統(tǒng)計學(xué)區(qū)別，顯示人體Hcy水平并不會對腸道菌群的物種多樣性有太大的影響，推測這可能是因為Hcy的主要來源是飲食中較多的蛋氨酸和較少的維生素，食物中的蛋氨酸由D-蛋氨酸和L-蛋氨酸兩種形式存在，其中D-蛋氨酸本身對維持腸道菌群穩(wěn)態(tài)、防止腸道損傷有一定作用[13]，故腸道菌群在多樣性層面上并無明顯差異。這與研究對象樣本量較少有關(guān)，需擴充樣本進(jìn)一步研究。若樣本量能進(jìn)一步增大，α多樣性或許能呈現(xiàn)更顯著的區(qū)別。此外，盡管有嚴(yán)格的納入和排除標(biāo)準(zhǔn)，樣本之間的個體差異依舊比較明顯。更大樣本量的研究也許能更好地闡明腸道微生物群落結(jié)構(gòu)對不同血清Hcy水平的影響。

4 結(jié)論與展望

高Hcy組的腸道菌群與血液中Hcy水平正常的健康對照組人群腸道菌群在組成上存在一定差異，腸道菌群群落結(jié)構(gòu)與高同型半胱氨酸血癥的發(fā)生和多項Hcy相關(guān)疾病的發(fā)展可能存在密切聯(lián)系。目前國內(nèi)外對于該領(lǐng)域的研究仍相對較少，僅有的文獻(xiàn)也多為嚙齒動物實驗數(shù)據(jù)所得。本研究提供了高Hcy組與正常水平Hcy健康對照組人體內(nèi)腸道菌群區(qū)別的描述，結(jié)果表明，在高Hcy組人群體內(nèi)，F(xiàn)usicatenibacter、大腸桿菌志賀氏菌、羅斯氏菌屬、普雷沃氏菌屬和巨單胞菌屬有著比健康對照組明顯更高的豐度。該研究結(jié)果有助于闡明不同Hcy水平下腸道菌群的組成，為進(jìn)一步明確腸道菌群對Hcy水平的影響提供了數(shù)據(jù)支持，也為對Hcy水平相關(guān)疾病的控制和采用益生菌治療手段提供了新思路。