槲皮素金屬配合物抑制膽囊癌細(xì)胞增殖、侵襲及增強(qiáng)化療敏感性的機(jī)制分析

劉 濤 白 浪 高永濤

膽囊癌是膽道系統(tǒng)常見的惡性腫瘤[1]，流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)我國膽囊癌發(fā)病率占同期膽道疾病0.4%～3.8%，位列消化道腫瘤發(fā)病率第6位[2-3]。由于膽囊癌具有惡性程度高、易發(fā)生區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、放化療敏感性差等臨床生物學(xué)特性，膽囊癌患者總體預(yù)后較差，5年生存率不足5%[4-5]。對于晚期膽囊癌患者，姑息性放化療能減緩腫瘤進(jìn)展、緩解疼痛、改善總體生存率，有結(jié)果顯示聯(lián)合放化療是能延長病人總體生存時(shí)間，然而目前對膽囊癌化療方案存在爭議[6]。吉西他濱(gemcitabine，GEM)聯(lián)合順鉑(cisplatinum，DDP)是進(jìn)展期膽道腫瘤治療的首選化療方案[7]，然而大多數(shù)膽囊癌患者的癌細(xì)胞對GEM是耐藥的，因此對GEM耐藥機(jī)制探討成為近年來膽囊癌化療研究的熱點(diǎn)。槲皮素(quercetin)是從以槲皮類植物中提取出來的一種黃酮類化合物，化學(xué)名為3,3′,4′,5,7-五羥基黃酮，近幾年來，已有研究證實(shí)槲皮素對多種實(shí)體腫瘤具有抑制作用[8-9]，但對膽囊癌細(xì)胞的作用研究較少，本研究通過將槲皮素金屬配合物與膽囊癌GBC-SD細(xì)胞共培養(yǎng)，檢測細(xì)胞的增殖及侵襲能力的變化以及細(xì)胞內(nèi)hENT-1表達(dá)變化，以期為膽囊癌GEM耐藥機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株及主要試劑

膽囊癌細(xì)胞株GBC-SD購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞所細(xì)胞庫；胎牛血清、DMEM培養(yǎng)液( Gibco 公司);0.25% 胰酶( Hyclone公司);侵襲小室( Sigma公司)、CCK-8 試劑盒(北京博奧森公司)、PCR引物序列由北京生物工程有限公司設(shè)計(jì)合成。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

用含10% FBS的DMEM完全培養(yǎng)基，在37 ℃，5% CO2，相對濕度95%的恒溫孵育箱中培養(yǎng)人膽囊癌GBC-SD細(xì)胞；將GBC-SD細(xì)胞按接種于96孔板中，按0、10、20、40、80、160 μmol/L的 Co(Que)2藥物濃度將細(xì)胞分為6組，CCK8法測定GBC-SD細(xì)胞的生長曲線，確定Co(Que)2的最佳實(shí)驗(yàn)濃度，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

將最佳試驗(yàn)濃度Co(Que)2、GEM等不同組合與人膽囊癌GBC-SD細(xì)胞培養(yǎng)，細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測對GBC-SD細(xì)胞增殖的影響；劃痕實(shí)驗(yàn)和 Transwell體外侵襲實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞侵襲遷移能力的影響。

將最佳試驗(yàn)濃度Co(Que)2、GEM等不同組合與人膽囊癌GBC-SD細(xì)胞培養(yǎng)，Trizol法提取各組細(xì)胞總RNA，RT-PCR法測量細(xì)胞內(nèi)hENT-1 mRNA的相對表達(dá)，反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性 5 min，95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，共35個(gè)循環(huán)，用 hENT-1/β-actin 的比值表示hENT-1 mRNA的相對表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

2 結(jié)果

2.1 槲皮素金屬配合物與膽囊癌GBC-SD細(xì)胞系共培養(yǎng)

將不同濃度Co(Que)2與膽囊癌GBC-SD細(xì)胞共培養(yǎng)24 h后，隨著濃度的增加，Co(Que)2對膽囊癌GBC-SD細(xì)胞抑制率亦增高，160 μmol/L的 Co(Que)2對GBC-SD細(xì)胞的抑制率達(dá)(83.5±15.8)%，與其他不同濃度抑制率有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=35.12，P<0.0001)(圖1A)。將50 μmol/L的Co(Que)2與GBC-SD細(xì)胞培養(yǎng)不同時(shí)間后，培養(yǎng)120 h后Co(Que)2對GBC-SD細(xì)胞的抑制率達(dá)(87.7±12.6)%，與其他組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=25.44，P<0.0001)(圖1B)，表明Co(Que)2對GBC-SD細(xì)胞增殖抑制作用呈時(shí)間及濃度依賴性。

注：A為不同濃度Co(Que)2培養(yǎng)24 h；B為50 μmol/L培養(yǎng)不同時(shí)間。

2.2 Co(Que)2抑制GBC-SD細(xì)胞增殖、侵襲

將濃度為50 μmol/L的Co(Que)2與膽囊癌GBC-SD細(xì)胞共培養(yǎng)24 h后，細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測對GBC-SD細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果顯示Co(Que)2+GEM聯(lián)合培養(yǎng)后細(xì)胞克隆數(shù)目形成最少(114±16)，與其他組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=20.06，P<0.0001)，Co(Que)2組細(xì)胞克隆數(shù)目(195±20)，高于正常對照組(t=32.18，P<0.0001)(圖2)。采用劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell小室檢測共培養(yǎng)后膽囊癌GBC-SD細(xì)胞轉(zhuǎn)移和侵襲能力的變化，Co(Que)2+GEM組細(xì)胞遷移數(shù)目(95±16.7)低于NC組(158±31.7)和GEM組(128±27.4)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=15.34，P=0.0015)(圖3)。

圖2 細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測Co(Que)2對GBC-SD細(xì)胞增殖的抑制作用

圖3 劃痕實(shí)驗(yàn)和 Transwell體外侵襲實(shí)驗(yàn)檢測Co(Que)2對GBC-SD細(xì)胞遷移、侵襲能力的抑制作用

2.3 Co(Que)2上調(diào)GBC-SD內(nèi)hENT-1 mRNA的表達(dá)

將濃度為50 μmol/L的Co(Que)2與膽囊癌GBC-SD細(xì)胞共培養(yǎng)24 h后，RT-PCR檢測GBC-SD內(nèi)hENT-1 mRNA的表達(dá)，Co(Que)2+GEM組 hENT-1 mRNA 的表達(dá)為(0.61±0.15)，明顯高于空白對照組(0.42±0.07)和GEM組(0.48±0.09)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=3.986，P=0.0471)。

3 討論

目前對膽囊癌化療方案存在爭議[10]。2010年，ValleJ等在新英格蘭雜發(fā)表文章，發(fā)現(xiàn)GEM聯(lián)合DDP組中位生存期(11.7個(gè)月)明顯高于GEM單藥組(8.1個(gè)月)[11]，從而確立GEM聯(lián)合DDP方案為進(jìn)展期膽道腫瘤治療的首選化療方案。但多項(xiàng)Ⅱ期臨床試驗(yàn)報(bào)道以GEM為主的化療方案對膽囊癌的客觀緩解率僅在20%～36%之間[12-13]，提示大多數(shù)膽囊癌患者的癌細(xì)胞對GEM是耐藥的，因此對GEM耐藥機(jī)制探討成為近年來膽囊癌化療研究的熱點(diǎn)。GEM是一種胞嘧啶核苷衍生物，在腫瘤細(xì)胞DNA合成期通過半胱氨酸天冬氨酸酶級聯(lián)放大系統(tǒng)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[14-16]，然而親水性的GEM通過細(xì)胞膜的脂性結(jié)構(gòu)極為困難，其主要通過hENT-1進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)[17]，因此，hENT-1蛋白和mRNA表達(dá)水平被認(rèn)為是預(yù)測 GEM臨床療效最具潛力的生物標(biāo)志物[18]。

槲皮最早記載于唐朝蘇敬等奉敕于顯慶四年(公元659年)編撰的《唐本草》，槲皮素(Quercetin)是從以槲皮類植物中提取出來的一種黃酮類化合物，化學(xué)名為3,3′,4′,5,7-五羥基黃酮，近幾年來，已有研究證實(shí)槲皮素對多種實(shí)體腫瘤具有抑制作用，但對膽囊癌細(xì)胞的作用研究較少。

目前研究顯示槲皮素及其金屬配合物的抗腫瘤機(jī)制主要集中在以下幾個(gè)方面。①抑制端粒酶的活性：槲皮素能夠抑制端粒酶的活性，破壞其穩(wěn)定性，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；②調(diào)控腫瘤的癌基因與抑癌基因：槲皮素在翻譯水平抑制突變型P53蛋白的表達(dá)，抑制c-myc、ras等癌基因及上調(diào)P21等抑癌基因的表達(dá)；③阻滯細(xì)胞周期：槲皮素能減少癌細(xì)胞DNA的復(fù)制,使細(xì)胞周期阻滯于G1期、G2/M期；④阻遏熱休克蛋白(Heat Shock Protein，HSP)：槲皮素可以在基因轉(zhuǎn)錄水平抑制HSP的表達(dá)，增加腫瘤細(xì)胞對放、化療的敏感性，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；⑤抑制腫瘤新生血管的形成：槲皮素可能通過抑制基質(zhì)MMP-2和MMP-9的活性來抑制腫瘤新生血管的生成，從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制轉(zhuǎn)移；⑥逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥：槲皮素可以通過下調(diào)熱休克蛋白HSP70的表達(dá)和抑制P糖蛋白的功能，發(fā)揮逆轉(zhuǎn)多藥耐藥功能[19-22]。本研究通過將Co(Que)2與GBC-SD細(xì)胞共培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，Co(Que)2對GBC-SD細(xì)胞增殖抑制作用呈時(shí)間及濃度依賴性，而且能抑制GBC-SD細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移，通過RT-PCR檢查細(xì)胞內(nèi)hENT-1 mRNA表達(dá)，結(jié)果顯示Co(Que)2使GBC-SD細(xì)胞內(nèi)hENT-1 mRNA表達(dá)上調(diào)，因此我們推測，Co(Que)2通過上調(diào)GBC-SD細(xì)胞內(nèi)hENT-1 mRNA的表達(dá)，進(jìn)而增強(qiáng)GEM對GBC-SD細(xì)胞的化療敏感性，進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移侵襲能力。

本研究結(jié)果表明，槲皮素金屬配合物能夠有效地抑制膽囊癌細(xì)胞的增殖、侵襲遷移，其機(jī)制主要通過上調(diào)hENT-1增強(qiáng)吉西他濱對膽囊癌細(xì)胞化療敏感性，為膽囊癌吉西他濱耐藥機(jī)制探討提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。