miR-95和miR-19b在骨肉瘤組織中的表達及與順鉑耐藥性的關(guān)系

雷小蕾 劉建峰 葉鐵良 張帥虎 袁國靜

骨肉瘤是兒童和青少年中最常見的原發(fā)性惡性骨腫瘤，約占所有兒科惡性腫瘤的2.4%[1]。骨肉瘤患者常用的化療藥物包括順鉑、阿霉素和甲氨蝶呤，但化療藥物耐藥情況也越發(fā)普遍[2]?；熕幬镯樸K(cisplatin，CDDP)在臨床上主要用于實體瘤的治療，它抗癌譜廣，是目前已知的最有效的抗腫瘤藥物之一，也是骨肉瘤化療的一線用藥[3]。然而臨床上在使用順鉑化療的過程中，患者易產(chǎn)生耐藥，這可能與藥物的不規(guī)范使用、腫瘤細胞基因的不穩(wěn)定性及高突變率等有關(guān)[4]。但是關(guān)于臨床治療中骨肉瘤化學(xué)耐藥性的分子機制尚不清楚。miRNA(microRNA)是一類由內(nèi)源性基因編碼的非編碼單鏈 RNAs，長度約為 22 個核苷酸，主要在翻譯水平調(diào)控基因的表達[5]。miRNA 在腫瘤耐藥中發(fā)揮著重要作用，其在耐藥細胞和對藥物敏感的細胞中的表達量存在差異[6]。miR-95和 miR-19b 與多種類型腫瘤的發(fā)生高度相關(guān)[7]，但是與骨肉瘤以及順鉑耐藥性的關(guān)系尚不明確。因此本研究探討miR-95和 miR-19b 在骨肉瘤組織中的表達及與順鉑耐藥性的關(guān)系，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 研究對象

選取2016年2月至2020年2月本院收治的骨肉瘤患者100例，其中男性54名，女性46名，年齡6～69歲。納入標準：①符合《骨肉瘤臨床循證診療指南》[7]，經(jīng)病理學(xué)確診骨肉瘤；②病歷、臨床資料完整；③患者簽署自愿受試同意書，患者及其家屬需簽署知情同意書。排除標準：①精神疾病患者；②合并其他惡性腫瘤患者；③合并其他器官嚴重性病變患者；④排除糖尿病、腎病等其他代謝性疾病的患者。

1.2 miR-95和 miR-19b 水平檢測

取骨肉瘤組織樣本，使用TRIzol RNA試劑盒(購自賽默飛世爾科技有限公司)提取總RNA，紫外分光光度計(上海美譜達公司)檢測總RNA 濃度及純度。取 2 μg 總 RNA 使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(賽默飛世爾科技有限公司)進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。取反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進行PCR擴增，用2-ΔΔCt法計算各組基因的相對表達量。

1.3 化療耐藥分析

患者可根據(jù)鉑類耐藥評價標準[8]分為敏感組和耐藥組，敏感組為患者在化療完成后處于完全緩解狀態(tài)，后期復(fù)發(fā)間隔6個月以上；耐藥組為患者在化療完成后處于癥狀未緩解狀態(tài)或者處于完全緩解狀態(tài)但是后期復(fù)發(fā)間隔在6個月以內(nèi)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 miR-95和 miR-19b 表達與骨肉瘤患者的臨床病理參數(shù)關(guān)系分析

根據(jù)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-95和 miR-19b表達與性別無關(guān)(P均>0.05)，與臨床分期、腫瘤直徑以及遠處轉(zhuǎn)移有關(guān)(P均<0.05)，其中臨床分期Ⅲ期、腫瘤直徑≥5 cm、發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移患者miR-95表達水平顯著低于其他患者(P<0.05)，臨床分期Ⅲ期、腫瘤直徑≥5 cm、發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移患者miR-19b 表達水平顯著高于其他患者(P<0.05)，見表1。

表1 miR-95和 miR-19b表達與骨肉瘤的臨床病理資料關(guān)系

2.2 miR-95和 miR-19b表達與化療耐藥的關(guān)系

miR-95在耐藥組的表達水平明顯低于敏感組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；miR-19b在耐藥組的表達水平明顯高于敏感組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 miR-95和 miR-19b在耐藥組與敏感組中的表達水平

2.3 miR-95和miR-19b對骨肉瘤患者化療耐藥的預(yù)測價值分析

根據(jù)ROC曲線分析可知，miR-95和miR-19b評估骨肉瘤患者化療耐藥的預(yù)測AUC分別為0.707、0.692，聯(lián)合檢測AUC為0.808，高于單獨檢測的AUC值。見表3，圖1。

表3 miR-95和 miR-19b聯(lián)合檢測骨肉瘤預(yù)測效能評價

圖1 miR-95和 miR-19b對骨肉瘤化療耐藥的預(yù)測價值ROC曲線分析

3 討論

骨肉瘤是高度惡性的間葉組織腫瘤，年發(fā)病率約為3/100萬，由于骨肉瘤局部侵襲性生長并易發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移[9-10]。與其他癌癥類型相比，骨肉瘤的分子發(fā)病機制尚不清楚。骨肉瘤患者的5年總體和無病生存率為50%～60%，約40%的患者死于肺轉(zhuǎn)移[11]。近年來，順鉑的新輔助化療被廣泛用于降低骨肉瘤患者的復(fù)發(fā)率和提高生存率[12]。對化療藥物的耐藥性仍然是骨肉瘤和癌癥治療的主要問題。目前臨床上對化療耐藥的評價標準主要根據(jù)患者在化療結(jié)束后根據(jù)化療效果以及復(fù)發(fā)情況來判斷，不能及時根據(jù)耐藥情況調(diào)整治療藥物，影響患者的治療效果，因此尋找有效的針對子宮內(nèi)膜癌化療耐藥情況的生物學(xué)指標對臨床研究具有重大意義。

miRNA 是一種高度保守的非編碼RNA分子，具有18～25個核苷酸，在轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)基因表達[13]。miRNA參與多種細胞過程，如分化、增殖和凋亡，這些過程在癌癥的發(fā)展中具有重要意義，越來越多的研究表明miRNA可能與癌癥的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)[14-15]。miR-95過表達促進了腫瘤生長[16]。研究表明miR-19b可以促進乳腺癌細胞的腫瘤發(fā)生[17]。有研究稱與正常黑色素細胞相比，黑色素瘤細胞中miR-19b的表達顯著增加[18]。在骨肉瘤細胞中也發(fā)現(xiàn)了miR-19b的上調(diào)表達，并在這種惡性腫瘤中發(fā)揮了促癌作用[19]。但是miR-95和miR-19b在骨肉瘤的發(fā)病機制和化療耐藥中的潛在作用尚未闡明。本研究結(jié)果顯示：miR-95和miR-19b表達與臨床分期、腫瘤直徑以及遠處轉(zhuǎn)移有關(guān)，提示了miR-95和miR-19b可能參與了骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展，但是具體發(fā)病機制亟待進一步研究。miR-95在耐藥組的表達水平明顯低于敏感組，miR-19b在耐藥組的表達水平明顯高于敏感組。miR-95和miR-19b評估骨肉瘤患者化療耐藥的預(yù)測AUC分別為0.707、0.692，聯(lián)合檢測AUC為0.808，高于單獨檢測的AUC值。說明miR-95和miR-19b水平與骨肉瘤對化療耐藥有關(guān)，與目前的研究所推測的一致，另外還發(fā)現(xiàn)其對骨肉瘤化療耐藥有一定的預(yù)測價值，可作為骨肉瘤化療耐藥相關(guān)生物標志物的潛力。

綜上所述，本研究證實了miR-95和miR-19b與骨肉瘤病理參數(shù)的關(guān)系以及對化療耐藥預(yù)測的價值，為未來尋求一種有效與骨肉瘤相關(guān)的生物標志物提供了數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。然而本研究由于樣本量少以及中心單一等不足對研究結(jié)果可能產(chǎn)生一定的偏移，在未來的研究中需要更具前瞻性以及擴大樣本量來對結(jié)果進一步完善。