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    橙皮苷通過MeCP2/Wnt軸對口腔鱗狀細胞癌惡性生物學行為的作用機制

    2022-11-23 12:22:14李國芳韓永付李曉琰高振杰
    實用癌癥雜志 2022年11期
    關鍵詞:遷移率橙皮劃痕

    李國芳 韓永付 鄭 雷 李曉琰 高振杰

    口腔鱗狀細胞癌(oral squamous-cell carcinoma,OSCC)是頭頸部常見的惡性腫瘤,其發(fā)病率居口腔癌首位,且逐年攀升并趨于年輕化[1]。目前臨床治療OSCC通常采用化療聯(lián)合手術切除,但由于腫瘤生長位置特殊,可能會損壞患者面部形象或造成面部器官功能障礙,治療效果并不理想[2]。此外,OSCC隱蔽性強,部分患者確診時已處于晚期,出現(xiàn)組織浸潤及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,以致患者病死率居高不下[3]。橙皮苷是柑橘類成熟果皮和組織中的類黃酮物質(zhì),有研究證明,其可通過抑制人肝癌和神經(jīng)母細胞瘤細胞增殖并誘導其凋亡來發(fā)揮抗癌功效[4]。然而,目前關于其對于OSCC細胞的作用及相關機制鮮有報道。本研究采用橙皮苷干預OSCC細胞,觀察其對該細胞克隆、遷移、侵襲等惡性生物學行為的影響,并探討相關機制。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 細胞系 人OSCC CAL27細胞系、人口腔黏膜角質(zhì)形成細胞(Human Oral Keratinocytes,HOK)系,購自中國科學院上海細胞庫。

    1.1.2 藥物、主要試劑、儀器 橙皮苷(純度>98%,上海源葉生物科技有限公司),二喹啉甲酸(bicinchoninic acid,BCA)全蛋白提取試劑盒、pcDNA 3.1-甲基化CpG結(jié)合蛋白-2(methyl-CpG-binding protein 2,MECP2)質(zhì)粒(上海聯(lián)碩生物科技有限公司),LipofectamineTM3000試劑盒(上海臻諾生物科技有限公司),兔抗人MeCP2、Wnt-1、β-連環(huán)蛋白(β-catenin)、腺瘤樣結(jié)腸息肉病(adenomatous polyposis coli,APC)蛋白一抗(美國Santa公司)。

    倒置熒光顯微鏡(德國Leica公司),DYCZ-24電泳儀(北京六一生物科技有限公司),Gel Doc XR+一體式凝膠成像分析儀(美國伯樂公司)。

    1.2 方法

    1.2.1 細胞培養(yǎng) 將人OSCC CAL27細胞、HOK細胞置于DMEM培養(yǎng)基(含有10%胎牛血清+1%青霉素和鏈霉素雙抗)中,37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每2~3 d更換一次培養(yǎng)液,細胞融合至80%后,采用胰蛋白酶消化、傳代,選取對數(shù)生長期細胞作為實驗對象。

    1.2.2 Western blot法檢測MeCP2在HOK、CAL27細胞系中的蛋白表達量 取HOK、CAL27對數(shù)期細胞,加入預冷RIPA細胞裂解液,注入離心管,以10000 r/min,離心半徑r=10 cm離心15 min,BCA法測定蛋白含量。取50 μg待測蛋白,按比例與上樣緩沖液混合,經(jīng)水煮沸5 min,同條件離心取其上清,80 V恒壓上樣電泳后濕轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜,封閉液室溫搖床封閉2 h,TBST清洗,加入兔抗人MeCP2一抗(1∶500),4 ℃搖床孵育過夜,TBST清洗,加入山羊抗兔IgG二抗(1∶2 000),室溫孵育2 h,TBST清洗,加入ECL發(fā)光液顯色,暗室曝光,經(jīng)一體式凝膠成像系統(tǒng)分析,以MeCP2蛋白與內(nèi)參GAPDH灰度值比值表示蛋白表達量。

    1.2.3 細胞干預、轉(zhuǎn)染、分組[5]取對數(shù)期CAL27細胞,PBS洗滌,調(diào)整細胞密度為1×105個/mL,接種至6孔板,待細胞再次融合至60%時,分為空白組、橙皮苷組、MeCP2過表達組、橙皮苷+MeCP2過表達組。空白組不處理,橙皮苷組培養(yǎng)基加入橙皮苷(100 μmol/L終濃度),MeCP2過表達組根據(jù)LipofectamineTM3000試劑盒說明書步驟,轉(zhuǎn)染MeCP2蛋白過表達質(zhì)粒pcDNA 3.1-MeCP2,橙皮苷+MeCP2過表達組轉(zhuǎn)染pcDNA 3.1-MeCP2后,加入橙皮苷(100 μmol/L終濃度)。每組設置5個復孔,干預或轉(zhuǎn)染48 h后進行后續(xù)實驗。

    1.2.4 Western blot法檢測各組MeCP2蛋白表達量 取各組細胞,操作同1.2.2。

    1.2.5 平板克隆實驗檢測各組克隆能力 轉(zhuǎn)染48 h后,取各組細胞經(jīng)胰蛋白酶消化、傳代,吹打為單個細胞,以細胞密度300個/mL接種于培養(yǎng)皿中(含培養(yǎng)液10 mL),置于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每2~3 d更換一次培養(yǎng)液,待出現(xiàn)肉眼可見的克隆細胞時,終止培養(yǎng)。棄其上清液,PBS洗滌干凈,加入4%多聚甲醛4 ℃固定15 min,棄去固定液,PBS洗滌,加入結(jié)晶紫染液37 ℃染色25 min,自來水沖洗,風干,將平皿倒置于透明膠片上,低倍鏡下記錄克隆數(shù)并拍照。

    1.2.6 劃痕實驗檢測各組遷移能力 取各組對數(shù)期細胞,經(jīng)胰蛋白酶消化、重懸。以1×106個/mL接種至6孔板,培養(yǎng)至細胞貼壁,吸去培養(yǎng)基,用移液器槍頭沿孔板中央垂直向下畫一條直線,PBS輕吹除去邊緣細胞碎片,置于完全培養(yǎng)基繼續(xù)培育24 h,置于顯微鏡下拍照記錄培養(yǎng)前劃痕寬度及培育24 h后劃痕寬度,觀察細胞遷移情況,計算各組遷移率。遷移率=(培養(yǎng)前劃痕寬度-培育24 h后劃痕寬度)/培養(yǎng)前劃痕寬度×100%。

    1.2.7 Transwell實驗檢測各組侵襲能力 取Matrigel膠冰浴融化,加入PBS稀釋,以50 μL/孔置于Transwell小室濾膜上,取各組OSCC CAL27細胞,調(diào)整細胞密度為5×105個/mL,接種于Transwell小室上層,下室中加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基,培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h,取出杯底濾膜,PBS沖洗,加入0.25%戊二醛固定15 min,加結(jié)晶紫染液37 ℃染色25 min,自來水沖洗,風干。顯微鏡下隨機選取5個視野,拍照并記錄各視野穿模細胞數(shù),取其均值。

    1.2.8 Western blot法檢測Wnt-1、β-catenin、APC蛋白表達量 取各組細胞。同1.2.2洗滌、裂解、定量、變性、電泳、轉(zhuǎn)膜、孵育。分別加入相應抗體Wnt-1、β-catenin、APC一抗(1∶500),4 ℃搖床孵育過夜,TBST清洗,加入二抗(1∶2 000),室溫孵育2 h,TBST清洗,加入ECL發(fā)光液顯色,暗室曝光,經(jīng)一體式凝膠成像系統(tǒng)分析,以目的蛋白與內(nèi)參GAPDH灰度值比值表示目的蛋白表達量。

    1.3 統(tǒng)計學分析

    2 結(jié)果

    2.1 MeCP2在HOK、CAL27細胞系中的蛋白表達量

    HOK、CAL27細胞系中MeCP2蛋白表達量分別為(0.43±0.03)、(0.61±0.05),與HOK細胞系比較,MeCP2在CAL27細胞系中蛋白表達量升高(t=6.903,P<0.05)。見圖1。

    圖1 Western blot法檢測HOK、CAL27細胞系中MeCP2蛋白表達量

    2.2 轉(zhuǎn)染后MeCP2蛋白表達量

    轉(zhuǎn)染48 h后,空白組、橙皮苷組、MeCP2過表達組、橙皮苷+MeCP2過表達組MeCP2蛋白表達量分別為(0.63±0.06)、(0.24±0.02)、(0.94±0.09)、(0.41±0.04),與空白組比較,橙皮苷組MeCP2蛋白表達量降低,MeCP2過表達組MeCP2蛋白表達量升高(P<0.05);與橙皮苷組比較,橙皮苷+MeCP2過表達組MeCP2蛋白表達量升高(P<0.05);與MeCP2過表達組比較,橙皮苷+MeCP2過表達組MeCP2蛋白表達量降低(P<0.05)。見圖2。

    圖2 Western blot法檢測各組MeCP2蛋白表達量

    2.3 克隆能力比較

    空白組、橙皮苷組、MeCP2過表達組、橙皮苷+MeCP2過表達組克隆數(shù)分別為(203.00±29.93)個、(74.50±10.52)個、(285.00±35.41)個、(122.50±19.97)個,與空白組比較,橙皮苷組克隆數(shù)減少,MeCP2過表達組克隆數(shù)增加(P<0.05);與橙皮苷組比較,橙皮苷+MeCP2過表達組克隆數(shù)增加(P<0.05);與MeCP2過表達組比較,橙皮苷+MeCP2過表達組克隆數(shù)減少(P<0.05)。見圖3。

    圖3 平板克隆實驗檢測克隆能力

    2.4 遷移能力比較

    空白組、橙皮苷組、MeCP2過表達組、橙皮苷+MeCP2過表達組遷移率分別為(71.88±8.23)%、(51.67±5.37)%、(90.36±9.52)%、(64.44±6.74)%,與空白組比較,橙皮苷組遷移率降低,MeCP2過表達組遷移率升高(P<0.05);與橙皮苷組比較,橙皮苷+MeCP2過表達組遷移率升高(P<0.05);與MeCP2過表達組比較,橙皮苷+MeCP2過表達組遷移率降低(P<0.05)。見圖4。

    圖4 劃痕實驗檢測遷移能力(×100,標尺50 μm)

    2.5 侵襲能力比較

    空白組、橙皮苷組、MeCP2過表達組、橙皮苷+MeCP2過表達組侵襲細胞數(shù)分別為(70.40±7.60)個/視野、(13.40±3.80)個/視野、(124.60±13.80)個/視野、(38.20±4.40)個/視野,與空白組比較,橙皮苷組侵襲細胞數(shù)減少,MeCP2過表達組侵襲細胞數(shù)增加(P<0.05);與橙皮苷組比較,橙皮苷+MeCP2過表達組侵襲細胞數(shù)增加(P<0.05);與MeCP2過表達組比較,橙皮苷+MeCP2過表達組侵襲細胞數(shù)減少(P<0.05)。見圖5。

    圖5 Transwell實驗檢測侵襲能力(×200,標尺200 μm)

    2.6 Wnt-1、β-catenin、APC蛋白表達比較

    與空白組比較,橙皮苷組Wnt-1、β-catenin蛋白表達降低、APC蛋白表達升高,MeCP2過表達組Wnt-1、β-catenin蛋白表達升高,APC蛋白表達降低(P<0.05);與橙皮苷組比較,橙皮苷+MeCP2過表達組Wnt-1、β-catenin蛋白表達升高,APC蛋白表達降低(P<0.05);與MeCP2過表達組比較,橙皮苷+MeCP2過表達組Wnt-1、β-catenin蛋白表達降低、APC蛋白表達升高(P<0.05)。見表1,圖6。

    圖6 Western blot法檢測各組Wnt-1、β-catenin、APC蛋白表達

    表1 各組細胞Wnt-1、β-catenin、APC蛋白表達

    3 討論

    OSCC是源自口腔黏膜的鱗狀細胞癌,早期通常表現(xiàn)為表淺潰瘍,逐漸出現(xiàn)病理性白斑、紅斑,進而進展為腫瘤侵入口腔內(nèi)部組織[6],其危險因素包括不良生活習慣,如吸煙、飲酒、食用檳榔、感染HPV等[7]。目前關于OSCC的發(fā)病機制尚不明確,研究認為其與基因突變、微小RNA調(diào)控、抑癌基因產(chǎn)物改變DNA代謝調(diào)節(jié)有關[8]。惡性程度高、病程發(fā)展快、侵襲性強、復發(fā)率高是OSCC的主要特征,且多數(shù)患者確診時已出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,是高復發(fā)率和病死率的重要原因[9]。由此可見,研究抑制OSCC細胞克隆、侵襲、遷移等惡性細胞學行為的方式,是提升患者生存率,改善預后的有效途徑。

    近年來,天然提取物常被用于抗癌治療,因其高效、低副作用的特點,已成為臨床研究熱點。橙皮苷廣泛存在于柑橘屬、蕓香科、茜草科、十字花科植物果實或根莖中,具有抗炎、抗衰老、提升免疫力、保護心腦血管、防止血液凝聚及抗癌等多種生物學活性[10]。L等[11]在研究橙皮苷的抗癌活性及其作用機理時發(fā)現(xiàn),其可抑制體外人前列腺癌細胞活力,阻滯細胞周期,促進其凋亡,并降低其遷移、侵襲能力,提示其具有潛在的體外抗癌作用。作為天然抗氧化保健品,橙皮苷及其衍生物可清除超氧陰離子自由基,減少DNA損傷,降低腫瘤發(fā)生風險[12]。本研究結(jié)果顯示,與空白組比較,橙皮苷組克隆數(shù)、侵襲細胞數(shù)減少,遷移率降低,提示橙皮苷可抑制OSCC細胞克隆、侵襲、遷移。

    DNA甲基化是引發(fā)抑癌基因失活的重要原因之一[13]。MeCP2蛋白是甲基化結(jié)合蛋白家族成員,可與甲基化DNA結(jié)合或經(jīng)轉(zhuǎn)錄因子識別甲基化DNA,進而調(diào)控其下游蛋白表達,參與增殖、侵襲、遷移、凋亡等多種細胞功能調(diào)控[14]。有研究表明[15],MeCP2在乳腺癌細胞中異常高表達,敲降MeCP2可抑制細胞增殖,阻滯細胞周期并誘導其凋亡。Wnt/β-catenin信號通路是引發(fā)腫瘤的重要通路之一,其中Wnt1表達水平與該信號通路活性有關。APC是一種抑癌基因,其蛋白參與β-catenin濃度調(diào)控。正常細胞內(nèi)β-catenin與APC結(jié)合呈低表達狀態(tài)。腫瘤細胞內(nèi),APC基因缺失或突變,β-catenin大量游離,進入核內(nèi)參與調(diào)控基因表達,誘發(fā)Wnt/β-catenin信號通路異常激活[16]。Zhang等[17]研究認為,MeCP2高表達可激活Wnt/β-catenin信號傳導途徑來促進OSCC細胞增殖,促進OSCC發(fā)展。本研究結(jié)果顯示,與HOK細胞系比較,CAL27細胞系MeCP2蛋白表達量升高,提示MeCP2在OSCC細胞異常低表達;與空白組比較,MeCP2過表達組Wnt-1、β-catenin蛋白表達升高,APC蛋白表達降低,且與橙皮苷聯(lián)用可減弱轉(zhuǎn)染MeCP2對OSCC惡性行為的影響,提示橙皮苷抑制OSCC細胞克隆、侵襲、遷移的機制可能與調(diào)控MeCP2,進而調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路有關。

    綜上所述,橙皮苷可抑制OSCC細胞克隆、侵襲、遷移,其作用機制可能與抑制MeCP2,進而抑制Wnt/β-catenin信號通路有關。

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