壞死性小腸結(jié)腸炎體內(nèi)外模型的研究進(jìn)展

高潤楠 朱海濤 沈淳

復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院新生兒外科，上海 200000

壞死性小腸結(jié)腸炎（necrotizing enterocolitis，NEC）是新生兒胃腸外科常見急癥之一［1-2］。 近年來，隨著新生兒重癥監(jiān)護(hù)技術(shù)的發(fā)展，大量早產(chǎn)兒得以存活，NEC 的發(fā)病率不斷上升［3-5］。 為了降低NEC 的發(fā)病率和提高NEC 患兒存活率，在過去50年里，許多研究人員進(jìn)行了大量NEC 相關(guān)基礎(chǔ)和臨床研究。

目前NEC 的發(fā)病機制仍不十分清楚，較為統(tǒng)一的觀念認(rèn)為，NEC 是一種多因素共同作用所致的疾病，其中最被公認(rèn)的NEC 誘發(fā)因素是早產(chǎn)，早產(chǎn)兒腸道蠕動和消化功能、腸道血液循環(huán)調(diào)節(jié)、腸道屏障功能及免疫防御機制尚不成熟。 另一個被公認(rèn)的誘發(fā)因素是配方奶喂養(yǎng)，配方奶喂養(yǎng)誘發(fā)的腸道損傷機制可能是液體自絨毛血管轉(zhuǎn)移至腸腔，導(dǎo)致腸黏膜缺血損傷。 因此，對于新生兒（尤其是早產(chǎn)兒），任何高滲性液體的攝入都可能損傷腸黏膜。此外，低氧也可導(dǎo)致壞死性小腸結(jié)腸炎。 而細(xì)菌感染是否在壞死性小腸結(jié)腸炎的發(fā)病中起主要作用，抑或患兒最初的腸黏膜損傷是否會進(jìn)一步導(dǎo)致繼發(fā)性細(xì)菌入侵，目前尚不清楚［1］。

基于對NEC 發(fā)病機制的認(rèn)知，有研究人員利用導(dǎo)致人類疾病的致病因素，建立各種實驗?zāi)Ｐ停M實驗性NEC 樣損傷，如新型腸道體外模型——腸道類器官模型，進(jìn)一步拓寬了NEC 研究模型的平臺［6］。本文將重點介紹目前應(yīng)用最為廣泛的NEC 實驗?zāi)Ｐ停勰c上皮細(xì)胞模型（intestinal epithelia cells，IEC）、腸道類器官模型和動物NEC 實驗?zāi)Ｐ停荨?/p>

一、腸上皮細(xì)胞模型與NEC

IEC 是長期以來研究NEC 相關(guān)機制的細(xì)胞水平的模型。 IEC6 和IEC18 作為NEC 細(xì)胞水平研究中最常用的兩種貼壁細(xì)胞，其來源容易，生長速度快，易于培養(yǎng)，體外因素簡單，便于研究控制，可以評估單一的NEC 相關(guān)應(yīng)激因子或不同NEC 相關(guān)應(yīng)激因子的組合，進(jìn)而更好地了解這些應(yīng)激因子對上皮損傷和炎癥嚴(yán)重程度的影響，有助于NEC 發(fā)病機制的研究。 氧化應(yīng)激一直被認(rèn)為與NEC 發(fā)生密切相關(guān)，Li 等［6］采用IEC18 細(xì)胞，研究H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激對腸上皮的影響，成功地在體外模擬腸上皮損傷，并進(jìn)一步驗證H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激是參與NEC 發(fā)生的主要機制之一。 而Lee 等［7］通過比較單一因素脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）、H2O2或低濃度牛血清（2%）與多因素LPS、H2O2和2%牛血清刺激下的IEC18 炎癥水平IL-6 以及腸干細(xì)胞標(biāo)志物L(fēng)gr5 基因表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)當(dāng)單一因素誘導(dǎo)IEC18 輕度損傷，會促進(jìn)Lgr5 的表達(dá)升高。 在多個因素同時刺激下，IEC18 重度損傷，Lgr5 表達(dá)降低。一方面，體外細(xì)胞系利用單個刺激因素或不同組合刺激因素，能更加直觀研究這些刺激因素下腸上皮損傷和炎癥的嚴(yán)重程度；另一方面，與H2O2類似，LPS 或低血清誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷，有助于我們理解細(xì)菌感染致NEC 發(fā)生發(fā)展的機制。 因此，對于NEC細(xì)胞水平的研究，推薦采用多種刺激共同誘導(dǎo)，能夠更好模擬NEC 在人體的發(fā)病情況，從而進(jìn)一步探索NEC 的發(fā)生機制。 而對于已知可能導(dǎo)致NEC 發(fā)生機制的研究，腸上皮細(xì)胞系能夠較為方便進(jìn)行外源基因表達(dá)的調(diào)控，從而在體外細(xì)胞模型中更有利于NEC 機制的探究。

Caco-2 細(xì)胞作為一種人克隆結(jié)腸腺癌細(xì)胞，它具有與小腸上皮細(xì)胞相似的形態(tài)學(xué)、相同的細(xì)胞極性與緊密連接。 有研究人員將其作為NEC 腸道屏障功能的細(xì)胞模型，結(jié)果顯示，緊密連接蛋白ZO-1（zonula occludens-1）對經(jīng)過LPS 和雙歧桿菌雙重誘導(dǎo)損傷的腸道屏障具有保護(hù)作用；而這與在NEC 患兒和動物模型中發(fā)現(xiàn)的現(xiàn)象相符［9-10］。

總的來說，腸道細(xì)胞模型來源簡單，價格低廉，單純的體外因素更有利于直接觀察細(xì)胞增殖、凋亡和基因表達(dá)等。 然而，細(xì)胞模型無法還原患兒腸組織的體內(nèi)生物學(xué)特性，這也成為細(xì)胞模型在NEC 研究中的局限之一。

二、腸道類器官與NEC

隨著近年來腸道干細(xì)胞標(biāo)記物L(fēng)gr5 ＋的發(fā)現(xiàn)，新型腸道體外模型- 腸道類器官（intestinal organoid）模型逐漸興起［11］。 腸道類器官是由組織多能干細(xì)胞（pluripotent stem cells，PSCs）或成年干細(xì)胞（adult stem cells，ASCs）衍生而來的三維體外培養(yǎng)結(jié)構(gòu)，它具有與原組織相似的結(jié)構(gòu)與功能特性［12］。腸道類器官既具有易于培養(yǎng)、連續(xù)培養(yǎng)時穩(wěn)定不易癌變、可以冷凍、便于長期保存等體外研究優(yōu)勢；又可以獲得在體內(nèi)模型中表現(xiàn)的多種病理生理特征，是兩方面優(yōu)勢的完美結(jié)合。 因此，大量研究人員開始利用動物和人來源腸道類器官，作為理想的研究腸道上皮干細(xì)胞生物學(xué)和腸道結(jié)構(gòu)與功能機制等相關(guān)腸道疾病的體外研究模型［13-14］。

（一）鼠源腸道類器官

有研究人員使用成年小鼠腸道組織來源的腸道類器官來研究腸道損傷［15］。 McElroy 等［15］利用ErbB4-／-小鼠的腸道組織培養(yǎng)類器官，該種類器官潘氏細(xì)胞低表達(dá)，對炎癥因子呈高敏狀態(tài)，以此來模擬NEC 樣損傷。 他們的研究證實，ErbB4 配體-神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白4（neuregulin-4，NRG4 ）可以在損傷中發(fā)揮保護(hù)性作用。 Sodhi 等［16］利用TLR4 基因敲除小鼠來源的腸道類器官探討TLR4 對杯狀細(xì)胞的影響及其在NEC 發(fā)病中的作用。

然而，有研究表明，新生兒腸道上皮與成年腸道上皮并不完全相同［16］。 因此，為了更好還原NEC在新生兒的發(fā)病環(huán)境，研究人員嘗試?yán)脕碓从谛律∈蟮幕啬c組織的腸道類器官［17］。 Li 等［17］采用日齡為P9（postnatal 9 days）天的C57BL／6 系新生小鼠腸道組織進(jìn)行腸道類器官培養(yǎng)，模擬新生兒腸道環(huán)境，結(jié)果證實NEC 樣損傷新生兒腸道類器官可以通過缺氧和LPS 共同誘導(dǎo)而成。 我們課題組比較了不同時期母乳來源外泌體對腸道類器官的作用，采用相同來源的新生小鼠腸道類器官并給予LPS單一刺激，發(fā)現(xiàn)腸道類器官炎癥水平升高，而腸道干細(xì)胞的活力不僅不降，反而升高［18］。 這一現(xiàn)象可能與Lee 等在體外細(xì)胞系中的發(fā)現(xiàn)相同，當(dāng)單一刺激因子導(dǎo)致輕度損傷時，可促進(jìn)Lgr5 的表達(dá)升高。而在多重因子同時刺激下導(dǎo)致重度損傷時，Lgr5 的表達(dá)降低［7］。 因此，與腸上皮細(xì)胞模型相似，在腸道類器官模型中，可以通過對單個刺激因素或多個刺激因素的控制，模擬所需要的NEC 樣損傷程度。

（二）人源腸道類器官

Wu 等［19］收集了NEC 早產(chǎn)兒手術(shù)中回腸組織，并進(jìn)行腸道類器官培養(yǎng)。 由于腸道類器官具有與來源組織相似的結(jié)構(gòu)與功能特性，故該腸道類器官具有為NEC 損傷的腸道。 他們發(fā)現(xiàn)使用人母乳多聚寡糖（human milk oligosaccharides，HMO）處理，可以促使腸道類器官出芽增加，Muc2 蛋白的表達(dá)升高，從而改善腸道內(nèi)環(huán)境的平衡狀態(tài)。 而Ares等［20］取腸切除患兒的正常腸道組織，對腸干細(xì)胞進(jìn)行分離后培養(yǎng)類器官。 當(dāng)LPS 加入培養(yǎng)基與腸道類器官共培養(yǎng)時，其組織學(xué)、基因水平、蛋白表達(dá)和炎癥反應(yīng)均與人體NEC 病理生理條件相似。 然而，正常腸道組織的獲取常涉及倫理問題。 近年來，有研究顯示，來源于人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的腸道類器官是研究NEC 的另一個可靠模型，因其被證實具有與新生兒腸道組織相似的基因表達(dá)［21］。 同時，研究發(fā)現(xiàn)將人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞來源腸道類器官移植入NEC 小鼠中，可以有效增加腸道干細(xì)胞標(biāo)志物人類嗅素蛋白（olfactomedin 4，Olfm4）的表達(dá)［21］。

除直接來源于腸道組織之外，也有研究發(fā)現(xiàn)可以使用已有腸上皮細(xì)胞株進(jìn)行腸道類器官誘導(dǎo)培養(yǎng)［22］。 研究人員通過比較IEC6、CT26.WT 和Caco-2 三種腸上皮細(xì)胞株進(jìn)行類器官誘導(dǎo)培養(yǎng)，最終發(fā)現(xiàn)只有結(jié)腸癌上皮細(xì)胞株Caco-2 能形成腸道類器官樣結(jié)構(gòu)［22］。 這為腸道類器官的培養(yǎng)提供了一個新的來源。

綜上所述，新生兒腸道類器官為NEC 研究提供了一個平臺，使我們能夠在不受復(fù)雜神經(jīng)體液和其他器官系統(tǒng)干擾的情況下，研究腸道損傷的直接影響及影響因素。 然而，當(dāng)前研究中所使用的腸道類器官仍是孤立的培養(yǎng)體系，尚未將免疫系統(tǒng)、神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)、血管與體液等腸道生理微環(huán)境進(jìn)行整合。 因此，目前腸道類器官模型仍然無法完全還原腸道所處微環(huán)境，故創(chuàng)造更貼近人類體內(nèi)腸道微環(huán)境的培養(yǎng)體系將是腸道類器官研究的發(fā)展方向［23］。

三、動物模型與NEC

多年來，人們對NEC 的各種實驗動物模型進(jìn)行了研究，主要通過給予各種刺激因素，模擬人類NEC 發(fā)生發(fā)展的可能致病因素。 人類NEC 的精確模型尚未被描述。 目前，大多數(shù)研究人員會根據(jù)研究的方向和目的來選擇模型，大鼠和小鼠仍是NEC研究的主要動物模型。 NEC 動物模型增進(jìn)了我們對于NEC 這種高致死率疾病的了解，特別是在致病因素、預(yù)防和治療選擇方面。

（一）大鼠動物模型

NEC 動物模型最早由Barlow 等［24］于1974 年提出，至今仍被廣泛應(yīng)用于NEC 的研究。 NEC 大鼠模型基于NEC 的發(fā)病因素而產(chǎn)生，包括未成熟腸道、高滲奶喂養(yǎng)、低氧刺激和細(xì)菌過多生長［24］。 考慮到早產(chǎn)和低出生體重是NEC 新生兒的主要危險因子，Barlow 等［24］提出使用新生兒大鼠來模擬NEC患兒的未成熟腸道。 此外，由于NEC 主要發(fā)生于配方奶喂養(yǎng)的新生兒，Barlow 等［24］采用高滲配方奶喂養(yǎng)大鼠。 他們將人和狗配方奶進(jìn)行混合，并計算出每100 mL 奶可提供熱能681.7 焦耳（1 卡路里＝4.182 焦耳），這與大鼠母乳提供的熱量相近。 高滲配方奶通過滴管進(jìn)行喂養(yǎng)，每日4 次，每日提供總熱量約1254.6 焦耳／kg（1 卡路里＝4.182 焦耳）［25］。 在這種喂養(yǎng)條件下，與母乳喂養(yǎng)的老鼠生長速率相比，高滲配方奶喂養(yǎng)的小鼠總體呈現(xiàn)出1 天的生長滯后。 為了重現(xiàn)NEC 新生兒腸缺血的變化，研究人員給予大鼠缺氧應(yīng)激，將大鼠頭部周圍密封在塑料袋3 ～5 min，直至觀察到發(fā)紺為止［24］。

有研究人員通過在大鼠分娩24 h 前口服或經(jīng)陰道插入導(dǎo)尿管給予克雷伯氏菌，來模擬腸道細(xì)菌過度生長；他們認(rèn)為，在大鼠NEC 模型條件中，缺氧和配方奶粉喂養(yǎng)最為關(guān)鍵［24］。 在此基礎(chǔ)上，其他研究團(tuán)隊對大鼠NEC 模型條件進(jìn)行了不同的改進(jìn)，最終由Nadler 等［25］提出標(biāo)準(zhǔn)化的缺氧刺激，即將新生大鼠置于缺氧箱（4%O2，95%N2）10 min，每日3 次。為了保證成模率，一些研究團(tuán)隊引入另一個刺激因子-LPS［26-27］。 LPS 是革蘭氏陰性菌的一種內(nèi)毒素，是細(xì)菌外膜的主要成分，研究顯示LPS 參與了人NEC 的發(fā)病。 因此，他們在造模第1 天和第2 天將LPS 與高滲配方奶混合經(jīng)口喂給大鼠，以達(dá)到更嚴(yán)重的腸道損傷［26］。

另外，一些研究發(fā)現(xiàn)，單個刺激因素即可導(dǎo)致新生大鼠產(chǎn)生嚴(yán)重腸道損傷。 Nadler 等［25］發(fā)現(xiàn)高滲配方奶可以導(dǎo)致嚴(yán)重的腸道損傷。 也有研究人員報道，低氧（氧濃度0%，2 min 或氧濃度5%～10%，30 min）可以引起重度腸道損傷［28］。

總之，NEC 大鼠模型因其成本低、易于飼養(yǎng)而被廣泛應(yīng)用。 新生大鼠出生后不久便進(jìn)行人工喂養(yǎng)，各實驗室NEC 誘導(dǎo)選用的大鼠年齡較為統(tǒng)一，大鼠模型變異率較低。 然而，大多數(shù)大鼠在經(jīng)歷NEC誘導(dǎo)后最終都會死亡。 此外，大鼠遺傳背景尚不清楚，這使得NEC 大鼠模型中許多轉(zhuǎn)基因模型不能使用，這在很大程度上限制了NEC 發(fā)病機制的研究。

（二）小鼠動物模型

由于小鼠成本低，容易繁殖，最重要是轉(zhuǎn)基因小鼠的可用性，因此小鼠作為NEC 動物模型的研究愈發(fā)普遍。 小鼠的這些特點為更好研究NEC 發(fā)病的分子機制或新藥的療效提供了較好的模型。 但由于小鼠體型較小以及轉(zhuǎn)基因小鼠的低存活率，使得NEC 小鼠模型的建立具有一定的挑戰(zhàn)性。

與大鼠NEC 誘導(dǎo)相比，不同研究中小鼠NEC誘導(dǎo)起始新生小鼠的年齡差異較大。 Jilling 等［29］采用出生后即刻幼鼠進(jìn)行NEC 誘導(dǎo)，通過經(jīng)口喂養(yǎng)高滲配方奶、缺氧和冷刺激（N2：100%，1 min；4℃，10 min）完成。 其他研究團(tuán)隊使用相似的NEC 誘導(dǎo)方法，只是選擇不同日齡的新生小鼠開始造模，主要選用日齡為P3 或P5 的新生小鼠［30］。 值得一提的是，Hackam 團(tuán)隊比較了誘導(dǎo)NEC 從P7 ～P21 的轉(zhuǎn)基因小鼠模型，他們認(rèn)為選用NEC 誘導(dǎo)的小鼠年齡不宜超過P14 ～21［16，31-32］。 Tian 等［33］比較了NEC新生小鼠在不同年齡段的發(fā)病率，認(rèn)為母乳喂養(yǎng)不影響生后初期的小鼠NEC 發(fā)病率。 這項研究為許多實驗室在新生兒小鼠生后何時開始NEC 誘導(dǎo)提供了依據(jù)。

除了上述標(biāo)準(zhǔn)的NEC 誘導(dǎo)方案外，研究人員還利用其他應(yīng)激因素誘導(dǎo)NEC。 Ginzel 等［34］研究證實，將廣泛用于炎癥性腸病和結(jié)腸炎的葡聚糖硫酸鈉（DSS）與配方奶同時喂養(yǎng)時，可以誘導(dǎo)新生小鼠發(fā)生NEC。 也有研究通過清除腸道潘氏細(xì)胞來誘導(dǎo)NEC 的發(fā)生。 Zhang 等［35］發(fā)現(xiàn)在對P14 ～P16 小鼠腹腔注射雙硫唑酮清除Paneth 細(xì)胞和克雷伯氏菌以誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)10 h 后，小鼠出現(xiàn)NEC 發(fā)展現(xiàn)象。 然而，很難在新生小鼠身上復(fù)制上述模型，因為與人類新生兒相同，新生小鼠在出生時也缺乏潘氏細(xì)胞。

近年來，NEC 小鼠模型在基礎(chǔ)研究中逐漸流行起來，其主要優(yōu)點是飼養(yǎng)成本低，容易繁殖，且小鼠模型更適合基因操作，從而建立精確的分子途徑參與NEC 的發(fā)病，這有助于確定NEC 發(fā)病機制中涉及各種信號分子和分子通路的作用。 然而，新生小鼠由于體型原因，在進(jìn)行人工喂養(yǎng)時仍為NEC 誘導(dǎo)操作帶來了一定的挑戰(zhàn)。

總之，目前用于NEC 病理生理機制研究的體內(nèi)外模型平臺各具特點。 這些模型包括體外腸上皮細(xì)胞模型、腸道類器官模型和動物模型。 這些實驗?zāi)Ｐ偷膽?yīng)用將加深我們對NEC 的了解。 隨著對NEC 發(fā)病機制研究的不斷深入，誘導(dǎo)NEC 所涉及的刺激因子也在不斷完善，但目前仍然沒有完美再現(xiàn)人體NEC 的模型。 因此，研究人員需要根據(jù)研究目的選擇合適的模型。 而重現(xiàn)人類早產(chǎn)兒的胃腸道環(huán)境，可能是此類模型今后所面對的挑戰(zhàn)和努力的方向。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明 文獻(xiàn)檢索為高潤楠，論文調(diào)查設(shè)計為高潤楠、朱海濤、沈淳，論文分析為高潤楠，論文撰寫為高潤楠，論文討論分析為高潤楠、朱海濤、沈淳