哺乳動(dòng)物抗菌肽的研究進(jìn)展

蘇華鋒　雷 戰(zhàn)　郭中坤 （山東省鄄城縣畜牧局　274600）李 浩　李建梅　趙 元　李蘭波?。ㄉ綎|省醫(yī)學(xué)科學(xué)院　山東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心　濟(jì)南）

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哺乳動(dòng)物抗菌肽的研究進(jìn)展

蘇華鋒雷 戰(zhàn)郭中坤 （山東省鄄城縣畜牧局274600）李 浩李建梅趙 元李蘭波*（山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院山東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心濟(jì)南）

抗菌肽(Antibacterial peptide)是生物體用來(lái)抵御外來(lái)病原入侵而產(chǎn)生的具有抗菌作用的一類(lèi)小分子蛋白質(zhì)，具有分子質(zhì)量小、對(duì)熱穩(wěn)定、水溶性好、廣譜抗菌和作用機(jī)制獨(dú)特等特點(diǎn)。本文主要對(duì)幾種哺乳動(dòng)物抗菌肽研究概況及其開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景做一綜述。

抗菌肽是生物長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中保留的先天免疫系統(tǒng)或原生宿主防衛(wèi)機(jī)制中重要的活性分子，是具有抗菌活性的肽類(lèi)的總稱[1]，是哺乳動(dòng)物防御系統(tǒng)的一個(gè)重要組成部分，具有熱穩(wěn)定、水溶性好、廣譜殺菌甚至有的能殺真菌、原蟲(chóng)等優(yōu)點(diǎn)，而且許多抗菌肽在100℃加熱10min條件下仍能保持一定活力，對(duì)較大的離子強(qiáng)度和較低或較高的pH都有較強(qiáng)的抗性。迄今為止，人們已從生物界分離得到2000多種具有抗菌活性的多肽[2]，它們分布極廣，從病毒、細(xì)菌、真菌、兩棲動(dòng)物、軟體動(dòng)物、魚(yú)類(lèi)、鳥(niǎo)類(lèi)到昆蟲(chóng)、哺乳動(dòng)物均有發(fā)現(xiàn)。

1　抗菌肽的分類(lèi)

哺乳動(dòng)物抗菌肽主要存在于中性粒細(xì)胞及皮膚和黏膜的上皮細(xì)胞，哺乳動(dòng)物抗菌肽主要分為兩大類(lèi)，即防御素(defensins)和cathelicidins。其中研究最多的防御素類(lèi)抗菌肽，是抗菌肽家族最大的一類(lèi)，哺乳動(dòng)物防御素分為α-defensins和β-defensins兩大類(lèi)。

1.1兔源抗菌肽1980年洛杉磯Leherer實(shí)驗(yàn)室首次從兔肺巨噬細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)兩個(gè)陽(yáng)離子性極強(qiáng)的小分子抗菌肽[3, 4]，富含Cys殘基的防御素，其后又發(fā)現(xiàn)一系列一級(jí)結(jié)構(gòu)相似的小肽分子，命名為Defensins，其后國(guó)內(nèi)外已有學(xué)者分別由兔嗜中性粒細(xì)胞、兔腎等細(xì)胞或器官中分離出了抗菌肽類(lèi)物質(zhì)[5,6]，并且這些抗菌肽類(lèi)物質(zhì)均表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗菌活性。佘銳萍等[7]已從兔腸道組織的特殊結(jié)構(gòu)圓小囊組織中分離到一類(lèi)抗菌肽類(lèi)物質(zhì)，實(shí)驗(yàn)證明這類(lèi)抗菌物質(zhì)有較強(qiáng)的抗菌活性和較廣泛的抗菌譜。2005年王可洲使用乙酸提取法從兔小腸組織中分離得到一種純的兔腸源抗菌蛋白[8]，其相對(duì)分子質(zhì)量約為43×103的抗菌蛋白，用瓊脂糖彌散法和活菌計(jì)數(shù)試驗(yàn)檢測(cè)純化物對(duì)大腸桿菌，金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、白色念珠菌、白色葡萄球菌均具有較強(qiáng)的抗菌活性。

1.2豬源抗菌肽（1）1989年Lee等首先從豬小腸分離出得到抗菌肽cecropin P1[9]。ceceopin P1含有31個(gè)氨基酸殘基，分子量是3339 Da不含半胱氨酸(Cys)，不能形成分子內(nèi)二硫鍵，有強(qiáng)堿性的N端和強(qiáng)疏水性的C端，C末端酰胺化，酰胺化的C端對(duì)其廣譜抗菌作用極為重要。Agerberth等[10]1991年首次從豬小腸上端分離得到的豬抗菌肽PR-39，PR-39只含有7種氨基酸，含有較高比例Pro(45%~ 49%)和Arg(24%~29%)。另外，從豬肝臟中分離得到βPR-39與PR-39相差3.6%。PR-39由39個(gè)氨基酸殘基組成，相對(duì)分子量4719Da，具有廣譜抗菌活性，它在動(dòng)物的機(jī)體免疫上發(fā)揮著重要的作用。（2）豬抗菌肽Prophenin是從豬白細(xì)胞中分離得到的抗菌肽[11]，它也是一種富含脯氨酸和苯丙氨酸的抗菌肽。其中，脯氨酸含量占總氨基酸的57.1%，苯丙氨酸含量也較多(19.0%)。目前從豬白細(xì)胞中分離得到的Prophenin有兩種：Prophenin-1和Prophenin-2，兩者之間的差異體現(xiàn)在其氨基酸組成上，它們的第17個(gè)氨基酸殘基不同，Prophenin-1的第17號(hào)氨基酸為苯丙氨酸，Prophenin-2為纈氨酸。Prophenin-1的分子量為8683Da，含有79個(gè)氨基酸殘基，其中含有42個(gè)脯氨酸殘基和15個(gè)苯丙氨酸殘基。體外試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Prophenin-1對(duì)大腸桿菌有較強(qiáng)的殺菌活性。（3）N K-lysin是從豬小腸純化得到的，含有78個(gè)氨基酸殘基，并從豬骨髓cDNA文庫(kù)中分離得到它的克隆，有3個(gè)分子內(nèi)二硫鍵，對(duì)N K-lysin敏感型鼠腫瘤細(xì)胞YAC-1有顯著的裂解活性，但不裂解紅細(xì)胞。它與同樣具有三個(gè)二硫鍵的defensins不存在關(guān)系 。另外，專家們還從豬白細(xì)胞中分離得到5個(gè)小分子抗菌肽，它們含有16~18氨基酸殘基。馬衛(wèi)明等[12]采用凝膠過(guò)濾層析方法，純化得到具有抑制大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌的豬小腸抗菌肽類(lèi)似物。

1.3?？咕模?）至今已發(fā)現(xiàn)至少38種?？咕?，包括陽(yáng)離子性的防御素(defensins)和cathelicidins、陰離子抗菌肽及牛乳鐵素。1991年Diamond G等[13]從牛的氣管黏膜上皮細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)TAP。TAP前原肽(prepro-peptide)有64個(gè)氨基酸，包含20個(gè)氨基酸的信號(hào)肽和1個(gè)短的前序列(FTQ GVG)。（2）從牛舌上皮分離的LAP含42個(gè)殘基，其前原肽由64個(gè)氨基酸組成，包含20個(gè)氨基酸的信號(hào)肽和2個(gè)殘基的前序列(phe-thr)。LAP在消化道、呼吸道、乳腺上皮和結(jié)膜均有表達(dá)[14]。（3）Selsted等[15]從牛中性粒細(xì)胞中分離到13種BNBDs。BNBDs包含38~42個(gè)殘基，5ku左右，高度陽(yáng)離子性。大多數(shù)BNBDs對(duì)大腸桿菌ML35和金黃色葡萄球菌502A的MIC值約為10μg/ml。（4）EBD在牛的小腸末端和結(jié)腸中高水平表達(dá)[16]。在腸內(nèi)隱孢子蟲(chóng)(Cryptozoite)的誘導(dǎo)下，腸道中EBD mRNA的表達(dá)量升高5~10倍，表明EBD在抗寄生蟲(chóng)感染中發(fā)揮了重要作用。（5）cathelicidins是一類(lèi)存在于多種哺乳動(dòng)物中的在C端結(jié)構(gòu)上存在很大差異的抗菌肽，因其分子中都含有與cathelin(一種從豬白細(xì)胞中分離出的組織蛋白酶L抑制劑)相似的結(jié)構(gòu)而得名[17]。（6）陰離子抗菌肽存在于牛支氣管及細(xì)支氣管的上皮細(xì)胞中。新生牛支氣管肺泡洗液中陰離子抗菌肽的濃度是成年牛的3倍，但對(duì)溶血曼海姆菌(Mannheimia haemolytica)的殺菌活性明顯弱于成年牛的[18]。陰離子抗菌肽的作用機(jī)制尚不清楚，但發(fā)現(xiàn)鋅能使其活性增加，因此推測(cè)陽(yáng)離子鹽橋能克服微生物表面的負(fù)電荷。（7）牛乳鐵素(LfcinB)是乳鐵蛋白(LF)白在消化道正常生理?xiàng)l件下，在胃蛋白酶的作用下釋放出的一種肽，含25個(gè)氨基酸殘基，對(duì)應(yīng)于LF氨基端的第17~41位氨基酸，牛乳鐵素的一級(jí)結(jié)構(gòu)為：FKCRRWQWRMKKLGAPSITCV RRAF。Lf-cinB的抑菌效果是LF的400倍，在胃腸道作用更強(qiáng)，耐熱，在消化道中不易降解，無(wú)抗原性。LfcinB可抗多種革蘭氏陽(yáng)性和陰性菌，對(duì)耐抗生素的也有抑制作用[19]，還能抗病毒和真菌，但不作用于雙歧桿菌(Bacillus bifidus)等益生菌，能刺激細(xì)胞生長(zhǎng)，參與免疫調(diào)節(jié)。

2　應(yīng)用前景

2.1藥用開(kāi)發(fā)領(lǐng)域由于抗生素的普遍使用，耐藥菌株的廣泛產(chǎn)生以及抗生素使用中在生物體內(nèi)的殘留問(wèn)題，日益引起人們的擔(dān)心和極大關(guān)注，因此，開(kāi)發(fā)不易耐藥的、能夠替代抗生素的天然物質(zhì)尤其必要也十分緊迫[20]。由于抗菌肽具有廣譜殺菌作用、相對(duì)分子量較小、熱穩(wěn)定、水溶性好等優(yōu)點(diǎn)，更為重要的是抗菌肽對(duì)真核細(xì)胞幾乎沒(méi)有作用，僅作用于原核細(xì)胞和發(fā)生病變的真核細(xì)胞，由于抗菌肽是生物體內(nèi)自然產(chǎn)生的，對(duì)生物體本身不產(chǎn)生副作用。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，研究人員通過(guò)基因工程技術(shù) 對(duì)生物內(nèi)抗菌肽進(jìn)行研究，將抗菌肽基因克隆與表達(dá)，從而達(dá)到大批量生產(chǎn)，在醫(yī)藥領(lǐng)域廣抗菌肽逐步取代抗生素將成為可能。

2.2畜牧業(yè)領(lǐng)域在畜牧養(yǎng)殖業(yè)中，由于在抗生素大量使用，細(xì)菌的耐藥性已成為對(duì)養(yǎng)殖業(yè)危害最大，最棘手的問(wèn)題之一。由于細(xì)菌的耐藥性，許多新藥以越來(lái)越快的速度被開(kāi)發(fā)出來(lái)。但實(shí)踐表明，新藥的開(kāi)發(fā)速度遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于細(xì)菌產(chǎn)生抗藥性的速度，因而這幾年養(yǎng)殖業(yè)出現(xiàn)的現(xiàn)象就是新藥使用越來(lái)越多，而細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生也越來(lái)越快[21]。抗生素在動(dòng)物組織中的殘留不僅影響了動(dòng)物性制品的出口創(chuàng)匯，更嚴(yán)重的是可能影響人們的健康[22]。因此應(yīng)用無(wú)毒、無(wú)殘留的藥物是當(dāng)今養(yǎng)殖業(yè)急需解決的問(wèn)題。鑒于此抗菌肽為合適的抗生素替代藥物之一，抗菌肽作為動(dòng)物免疫防衛(wèi)系統(tǒng)產(chǎn)生的一類(lèi)活性小肽，由于其具有廣譜抗菌活性、低抗原性，對(duì)正常動(dòng)物體細(xì)胞無(wú)損害，以及抗腫瘤、抗病毒抗真菌、抗寄生蟲(chóng)等活性特點(diǎn)，倍受關(guān)注[23]。因此有可能成為替代抗生素的藥物或添加劑在養(yǎng)殖業(yè)得到廣泛的應(yīng)用。

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收稿日期：（2015–12–08）

*通訊作者

基金項(xiàng)目：山東科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(2013GNC11032)，濟(jì)南市科技計(jì)劃項(xiàng)目(201401268)

中圖分類(lèi)號(hào)：S859.79+7

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1007-1733(2016)02-0056-03