大鼠消化系統(tǒng)中器官組織差異性VOCs檢測分析

劉 玥，柯 立，陸 燕，張 兵，鄒 雪，夏 磊，李愛悅，劉亞偉，黃超群，沈成銀，儲焰南*

(1.安徽大學(xué) 物質(zhì)科學(xué)與信息技術(shù)研究院，安徽 合肥 230601；2.中國科學(xué)院合肥物質(zhì)科學(xué)研究院 健康與醫(yī)學(xué)技術(shù)研究所，醫(yī)學(xué)物理與技術(shù)安徽省重點實驗室，安徽 合肥 230031；3.中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)附屬第一醫(yī)院 胸外科，安徽 合肥 230001；4.中國科學(xué)院 合肥腫瘤醫(yī)院，安徽 合肥 230031)

揮發(fā)組學(xué)(Volatolomics)是分析生命系統(tǒng)的揮發(fā)性有機物(volatile organic compounds，簡稱VOCs)及其生物代謝過程[1]的科學(xué).檢測并識別內(nèi)源性VOCs，研究疾病所引起的VOCs異常及其生化機制，是建立有效的揮發(fā)性生物標(biāo)志物的基礎(chǔ)[2].消化系統(tǒng)從口腔到大腸，負責(zé)食物消化、吸收和排泄，作為消化道外的器官——肝臟分泌膽汁幫助消化.

人體組織VOCs的研究中，在胃腸道癌癥患者的呼氣及其離體癌組織中同時檢測到了偏高的同種VOCs，例如，胃癌中的丙酮、異丙醇、乙醇和乙酸乙酯[3]與結(jié)直腸癌中的苯甲醛、乙苯和吲哚[4].這些研究為呼氣VOCs診斷器官病變提供了可能性依據(jù).此外，在炎癥性腸病、腸易激綜合征、壞死性小腸結(jié)腸炎、感染性腹瀉和肝病有關(guān)的消化系統(tǒng)疾病的代謝VOCs研究中，也獲得了一系列的潛在生物標(biāo)志物，并發(fā)現(xiàn)腸道微生物菌群失調(diào)可以解釋疾病引起的VOCs改變[5].

關(guān)于動物的消化系統(tǒng)、器官的VOCs研究，Reade等[6]采用氣相色譜質(zhì)譜(gas chromatography-mass spectrometry, 簡稱GC-MS)技術(shù)檢測結(jié)腸炎模型小鼠的糞便和結(jié)腸內(nèi)容物，通過非靶向VOCs分析，發(fā)現(xiàn)急性炎癥時醛類升高，慢性炎癥則酮類增加.Kistler等[7]研究了C57Bl/6N雄性小鼠的多種組織揮發(fā)物特征，質(zhì)子轉(zhuǎn)移反應(yīng)飛行時間質(zhì)譜(proton transfer reaction time-of-flight mass spectrometry, 簡稱PTR-TOF-MS)測量實驗發(fā)現(xiàn)肝臟釋放的丙酮濃度最高，盲腸內(nèi)容物揮發(fā)出的最多的是甲醇，并認為盲腸是系統(tǒng)性甲醇的最可能來源.因為使用的檢測技術(shù)PTR-TOF-MS是一種在線質(zhì)譜，因而只能對被選擇的特定質(zhì)子數(shù)/電荷數(shù)(m/z)的比值所對應(yīng)的有限VOCs進行靶向性監(jiān)測，例如丙酮和甲醇.

筆者以大鼠作為模型動物，期望獲得健康器官的差異性VOCs特征，為器官病變引起的VOCs異常提供參考.考慮大鼠與人類具有基因的高度相似性，該研究工作對Wistar大鼠消化系統(tǒng)離體組織的VOCs進行非靶向分析，通過固相微萃取氣相色譜質(zhì)譜(solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry, 簡稱SPME-GC-MS)技術(shù)的頂空檢測，結(jié)合檢驗和判別分析，以獲取各種器官組織的差異性VOCs，并對其可能的代謝過程進行討論.

1 實驗方法

1.1 實驗大鼠

根據(jù)動物實驗4R 原則盡量少用動物(reduction)的倡議，考慮初步研究的相關(guān)參數(shù)平均值對數(shù)據(jù)點個數(shù)的基本要求，實驗將使用8只成年Wistar大鼠(8周齡，180～220 g，SPF級，雌雄各4只)，均購自山東省濟南朋悅實驗動物繁育有限公司[SCXK(魯)20190003].動物實驗通過了中國科學(xué)院合肥物質(zhì)科學(xué)研究院倫理委員會審查(批準(zhǔn)號：SWYX-DW-2021-50).

1.2 組織取樣

實驗開始前，8只Wistar大鼠在溫度(25±2)℃、濕度50%～60%、明暗各12 h循環(huán)的空調(diào)環(huán)境中適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，并用SPF級飼料和實驗室標(biāo)準(zhǔn)純化水喂養(yǎng).適應(yīng)期結(jié)束后，大鼠禁食不禁水再飼養(yǎng)72 h，采取脊椎脫臼法處死并進行解剖，分離出的待測器官(肝、胃、小腸、盲腸、大腸)用生理鹽水沖洗掉血液和內(nèi)容物后用濾紙擦干，沖洗時長2～3 s.每個器官取(60±0.5)mg組織并置于15 mL玻璃瓶中，在4 ℃環(huán)境下存放以備下一步檢測分析.實驗室空氣、鼠糧和墊料采用同樣的方式進行檢測以排除對器官組織VOCs分析的干擾.

1.3 VOCs測量

在37 ℃的恒溫箱中對裝有定量組織的瓶進行頂空VOCs固相微萃取(solid-phase microextraction, 簡稱SPME)，萃取纖維(65 μm厚聚二甲基硅烷/二乙烯基苯(PDMS/DVB))穿過瓶蓋深入瓶內(nèi)進行40 min萃取.在萃取之前，SPME纖維在200 ℃的氣相色譜進樣口預(yù)處理30 min，以去除可能殘留的物質(zhì).

組織頂空SPME的VOCs檢測在氣相色譜三重四級質(zhì)譜儀(TSQ Quantum XLS, Thermo Fisher, USA)上進行.色譜柱(TG-624SILMS，Thermo，USA)規(guī)格30 m×0.32 mm×1.80 μm，載氣為高純氦氣(99.999%)，流量是1.5 mL·min-1，實驗中采用不分流進樣模式.進樣口溫度設(shè)置為200 ℃，SPME纖維解析時間為30 s，色譜柱升溫程序是：初始40 ℃保持1 min，然后以5 ℃·min-1升至180 ℃并保持2 min.質(zhì)譜儀操作條件與筆者之前的工作相同[8].NIST質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫用于器官組織VOCs的定性，當(dāng)反向搜索指數(shù)(reverse search index, 簡稱RSI)超過800時予以確認.

1.4 非靶向統(tǒng)計

首先對組織的SPME-GC-MS檢測數(shù)據(jù)進行處理，使用軟件Xcalibur 2.2(Thermo，USA)導(dǎo)出色譜峰面積，對色譜峰面積大于1×105的所有VOCs進行非靶向統(tǒng)計分析，為矯正不同實驗引起的色譜峰漂移，每個色譜峰在保留時間±0.01 min范圍內(nèi)進行確認.為了尋找某個器官差異性的VOCs，將8只大鼠的該器官組織作為測試組，其他的4種器官組織作為對照組進行比較，考慮到每種器官的8個樣本要取VOCs色譜峰面積平均值進行分析，因此采用Mann-Whitney U檢驗比較兩組之間的差異性，當(dāng)p<0.05時被認為具有統(tǒng)計學(xué)意義；篩選出p<0.05的VOCs再進行逐步判別分析，以確定顯著性差異的VOCs.統(tǒng)計分析使用IBM SPSS STATISTICS 22.

2 結(jié)果與討論

2.1 器官組織的差異性VOCs

消化系統(tǒng)的器官組織揮發(fā)物GC-MS檢測實驗中，滿足峰面積條件的色譜峰共有147個，按照上述實驗方法，對每種器官組織VOCs進行非靶向統(tǒng)計分析，獲得的各器官差異性物質(zhì)結(jié)果如表1所示.

表1 統(tǒng)計分析得到的消化系統(tǒng)器官組織的特異性VOCs

通過這些具有顯著性差異的VOCs反映肝臟和盲腸的敏感度為100.0%、特異度為87.5%～100%.但是，在胃、小腸、大腸組織中均未得到顯著性差異的VOCs.

2.2 差異性VOCs可能來源

2.2.1 肝臟差異性VOCs

大鼠肝臟組織差異性VOCs為丙酮和正戊醇，如圖1所示.

圖1 肝臟差異性揮發(fā)物丙酮(a)和正戊醇(b)及其源于其他組織的色譜峰面積

由圖1可知，每只大鼠肝臟中測得的丙酮含量均高于其他器官組織，且丙酮的含量也遠高于另一種差異性VOC正戊醇.

丙酮是酮體(β-羥丁酸、乙酰乙酸和丙酮)的主要成分，已有研究表明肝臟中的脂肪酸分解并生成酮體[9].在之前的鼠類研究中，丙酮也曾在Wistar大鼠呼氣中被檢測到[10]，肝臟是機體揮發(fā)物中丙酮的主要來源.在人體疾病研究中，糖尿病[11]、非酒精性脂肪肝(NAFLD)[12]、肝硬化和肝癌[13]、結(jié)直腸癌[14]、食管胃癌[15]，甚至新冠肺炎患者呼氣[16]中也觀察到丙酮含量偏高.值得注意的是，節(jié)食和運動也能消耗脂肪從而使呼出的丙酮增加[17]，因此，一旦丙酮作為疾病標(biāo)志物時，有必要考慮患者的飲食不佳或者營養(yǎng)的過度消耗所帶來的影響.此外，大鼠攝入丙酮實驗發(fā)現(xiàn)肝微粒體和過氧化物酶體隨之上調(diào)，促進脂肪酸氧化，并進一步合成葡萄糖，表明丙酮也是糖異生的重要前體[18].在大鼠及其肝細胞實驗中，通過14C標(biāo)記發(fā)現(xiàn)丙酮可形成葡萄糖為組織提供能源，丙酮有兩種代謝途徑：血液中低濃度丙酮經(jīng)C3(甲基乙二醛和1,2-丙二醛)途徑代謝，該途徑在缺乏葡萄糖的情況下可以作為替代能源；而高濃度丙酮則通過醋酸鹽代謝，最終轉(zhuǎn)換成丙酮酸/乳酸進入三羧酸循環(huán)為機體供能[19].圖1顯示肝臟中丙酮含量具有性別差異，雄性大鼠肝臟中的丙酮均高于雌性大鼠，這可能與大鼠體重有關(guān)，實驗中雄性大鼠體重較大且活動程度較為活躍，能量消耗可能較大，故代謝產(chǎn)生丙酮較多.

正戊醇是一種短鏈脂肪醇，被認為是豬肝臟制品脂源性揮發(fā)物[20].在全身性炎癥[21]和出血性休克低血壓[22]模型大鼠呼氣VOCs研究中，正戊醇的含量都顯著升高.在雞的胚肝原代細胞中，發(fā)現(xiàn)正戊醇可以使5-氨基乙酰丙酸合成酶活性增加[23]，該合成酶是血紅素生物合成的限速酶，而肝臟是血紅素合成的主要器官，血紅素負責(zé)與氧結(jié)合并輸送氧氣.猜測肝內(nèi)正戊醇含量的增加可能與血紅素與氧的結(jié)合與運輸有關(guān).

2.2.2 盲腸差異性VOCs

大鼠盲腸組織差異性VOCs是苯酚、丙酸、丙基丙二酸和苯并噻唑(圖2)，其中，丙基丙二酸和苯并噻唑是首次在鼠類組織中被檢測到.

圖2 盲腸差異性揮發(fā)物苯酚(a)、丙酸(b)、丙基丙二酸(c)和苯并噻唑(d)及其源于其他組織的色譜峰面積

腸道是一個復(fù)雜的微生態(tài)系統(tǒng)，盲腸處于小腸和大腸交匯處，儲存著機體的排泄物.苯酚是腸道內(nèi)兼性厭氧菌分解酪氨酸形成的代謝物[24]，腸桿菌科(Enterobacteriaceae)中部分菌株也可以產(chǎn)生苯酚，例如產(chǎn)酸克雷伯氏菌(Klebsiellaoxytoca)、產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacteraerogenes)等[25].在添加酪氨酸飲食的大鼠實驗中，發(fā)現(xiàn)大鼠糞便、盲腸內(nèi)容物和血清中的酚類(苯酚和對甲酚)含量會增高，且血清與盲腸內(nèi)容物中的酚類濃度有相關(guān)性，因而血液中酚類被認為是來自于盲腸的內(nèi)容物[26]，這與筆者實驗觀測結(jié)果一致.在硫酸鎂誘導(dǎo)的滲透性腹瀉模型小鼠中，發(fā)現(xiàn)小鼠糞便中的苯酚增加[6].對人體的研究表明，人的糞便[27]和呼氣[28]中含有苯酚，且胃食管癌患者呼出的苯酚濃度顯著增加[29].苯酚異常與腸道微生物變化相關(guān)[28]，可作為監(jiān)測腸道菌群紊亂的標(biāo)志物.此外，酚類物質(zhì)的增加還可以通過血液循環(huán)在皮膚中積累，損害皮膚角質(zhì)形成細胞的分化，導(dǎo)致干燥等皮膚問題[30]，還有假說認為胃腸道菌群活動產(chǎn)生的苯酚是白血病的致病因素之一[31].

前人在大鼠盲腸內(nèi)容物中也觀測到了包括丙酸在內(nèi)的短鏈脂肪酸(short-chain fatty acids, 簡稱SCFAs)[32]，并且盲腸內(nèi)容物產(chǎn)生的SCFAs是乙狀結(jié)腸/直腸內(nèi)容物的8倍[33].人體研究表明，作為一種短鏈脂肪酸，丙酸主要來源于腸道細菌分解發(fā)酵腸道中的膳食纖維(多糖、低聚糖和抗性淀粉)[34]，因此，測量呼氣中的丙酸可以了解膳食纖維代謝狀況[35]或者監(jiān)測腸道菌群分布[36].

丙基丙二酸在接種炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides)的芒果中被檢測到，被認為是有毒真菌感染的標(biāo)志物[37].大鼠盲腸內(nèi)丙基丙二酸的產(chǎn)生可能是來自腸道中微生物的發(fā)酵，其生化機制還需要進一步研究.

苯并噻唑是一種雙環(huán)結(jié)構(gòu)分子，具有抗癌、抗菌、抗炎、抗病毒等活性，也是治療藥物合成的前體物[38].苯并噻唑曾在健康人呼氣中被觀測到[39]，有證據(jù)表明苯并噻唑來自半胱氨酸和苯醌衍生物的加成合成[40].苯并噻唑類化合物可以改善高脂模型小鼠的抗氧化能力[41]，苯并噻唑衍生物對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌等具有抗菌活性[42].

3 結(jié)束語

筆者采用SPME-GC-MS對Wistar大鼠消化系統(tǒng)主要器官組織的VOCs進行了檢測，通過色譜峰的非靶向統(tǒng)計分析，獲得了6種差異性VOCs，即肝臟中的丙酮、正戊醇以及盲腸中苯酚、丙酸、丙基丙二酸、苯并噻唑，并對這些差異性VOCs的生化來源、相關(guān)標(biāo)志物進行了討論.

通過離體實驗獲取大鼠在健康狀況下消化系統(tǒng)器官的差異性VOCs，期望為人體消化系統(tǒng)的器官的異常VOCs研究提供參考.但該研究也存在一定的局限性，進行的是大鼠解剖后的離體器官VOCs測量，而不是在體原位檢測，獲得的結(jié)果與活體器官可能存在一定差異.在147個色譜峰的非靶向分析中，只開展了單個消化系統(tǒng)的器官差異性VOCs的統(tǒng)計，未來有必要對每種器官釋放的VOCs進行詳細分析研究，結(jié)合大鼠呼氣實驗，為疾病的呼氣VOCs標(biāo)志物研究提供模型動物實驗依據(jù).