人誘導多能干細胞來源的心肌細胞構建短QT綜合征疾病模型概況

張偉 黃從新

人誘導多能干細胞（hiPSCs）已經成為一個具有巨大吸引力的種子細胞，它能克服疾病建模和藥物研發(fā)中動物模型存在的一些局限性[1]?；颊咛禺愋缘膆iPSCs具有自我更新和多向分化的潛能，能夠提供各種疾病相關的成體細胞，這為以前無法獲得的細胞類型（如心肌細胞和神經細胞）提供了豐富的來源。短QT 綜合征（SQTS）是一種由單基因突變引起的遺傳性心律失常，以室性快速心律失常及患者心臟常無結構性改變?yōu)樘卣鳎蓪е聲炟屎托脑葱遭?，是造成年輕人（尤其是嬰幼兒）心源性猝死的主要原因之一。SQTS的患病率較低，成人約0.02%～0.1%，兒童約0.05%[2—3]，以男性為主，其特征是校正的QT 間期（QTc）縮短并伴有較高的心臟猝死風險。目前為止，已經報道了與不同基因突變有關的8種類型的SQTS[4]。已有多項研究表明，hiPSCs來源的心肌細胞（hiPSC-CMs）可以在細胞、組織水平上有效地模擬SQTS，并利用SQTS患者來源的hiPSC-CMs篩選治療SQTS 的潛在藥物。

1 hiPSCs及(hiPSC-CMs)

hiPSCs的出現(xiàn)革新了干細胞領域的研究，這類細胞與胚胎干細胞相似，理論上具有無限增殖和分化為任何特定細胞類型的潛能，但與胚胎干細胞不同的是，hiPSCs是由體細胞（如成纖維細胞、血細胞等）經一系列轉錄因子（OCT3/4、SOX2、KLF4、c-MYC 或OCT3/4、SOX2、NANOG、LIN18等）重編程產生的[1，5—7]，這避免了醫(yī)學倫理上的爭議；hiPSCs為發(fā)病機制和藥物篩選的研究提供了患者來源的種子細胞，并為實驗性移植治療提供了豐富的細胞來源，這將極大促進個性化醫(yī)療和精準醫(yī)療的發(fā)展。

經十余年的發(fā)展，hiPSCs可通過不同的分化方案向心肌細胞定向分化[8]?；颊咛禺愋詇iPSC-CMs提供了一個新的以人源性心肌細胞為基礎的實驗平臺，以概括人類心肌細胞生物學的關鍵特征。研究表明，不同患者來源的hiPSCs具有相同的分子、電生理、代謝特征以及心肌細胞超微結構，但表現(xiàn)出的功能特征更類似于胎兒心肌細胞，尚處于不成熟狀態(tài)[9]。

hiPSC-CMs表達心肌細胞特異性標志物，具有心肌細胞典型的動作電位特征，并能對兒茶酚胺類和膽堿類藥物產生反應；根據心肌細胞亞型的特性標志物及動作電位的形態(tài)，可將hiPSCs-CMs分為心室肌樣細胞、心房肌樣細胞以及竇房結樣細胞[10]。由于hiPSC-CMs可來源于患者，因此hiPSC-CMs已成為構建遺傳性心臟?。ㄈ鏢QTS）模型的熱點種子細胞[11]。目前誘導hiPSCs向hiPSC-CMs分化的不同方案產生心肌細胞的比例存在一定的差異，進而導致心肌細胞亞型的差異，因此在利用hiPSCs-CMs研究心臟疾病時應考慮細胞異質性。

2 細胞水平上構建SQTS模型

2018年El-Battrawy等[12]首次利用hiPSCs建立SQTS細胞模型。該研究小組招募了1例SQTS 1型（SQTS1）患者（基因KCNH2攜帶N588K 突變）和2例健康者，并將皮膚來源的成纖維細胞重編程為hiPSCs；采用單層細胞培養(yǎng)的方法誘導hiPSCs定向分化為hiPSC-CMs，隨后對其進行病理生理及藥理學研究。研究發(fā)現(xiàn)，與正常對照組來源的hiPSC-CMs相比，SQTS1患者來源的hiPSC-CMs的快速延遲整流鉀通道電流（IKr）密度增加，而動作電位時程（APD）縮短，而且表現(xiàn)出異常的鈣瞬變和節(jié)律性活動。卡巴膽堿能增加SQTS1-hiPSCs-CMs發(fā)生心律失常的風險，奎尼丁可以延長APD 和消除卡巴膽堿對SQTS1-hiPSCs-CMs的致心律失常作用?；蚣暗鞍妆磉_譜分析，SQTS1-hiPSCs-CMs中基因KCNH2和HERG 通道蛋白表達上調。

CRISPR/Cas9基因編輯技術通過插入或修正突變基因可以產生具有相同遺傳組成的hiPSCs細胞系，極大地促進了基因疾病的研究[13]。Guo 等[14]將hiPSCs 和CRISPR/Cas9 基因編輯技術有機整合在一起，在細胞水平上研究SQTS患者的病理機制。該團隊招募3例志愿者，包括1例SQTS1患者（基因KCNH2攜帶T618I錯義突變）和2例健康成年人；并將這3 例志愿者的皮膚成纖維細胞重編程為hiPSCs，隨后利用CRISPR/Cas9技術將SQTS1患者的hiPSCs中KCNH2基因的T618I突變修正，依此作為具有相同遺傳背景的對照組（GC-iPSCs）。所有的hiPSCs通過單層細胞培養(yǎng)方案被誘導分化為hiPSC-CMs。采用膜片鉗技術進行電生理研究表明，與正常對照組（Con-iPSC-CMs）和GCiPSC-CMs相比，SQTS1-hiPSC-CMs表現(xiàn)為APD 縮短和節(jié)律紊亂；而且SQTS1-iPSC-CMs的IKr密度增加，KCNH2的膜蛋白表達也明顯增加，這與IKr密度增加的表現(xiàn)是相符的，在單細胞水平再現(xiàn)了SQTS的表型。在藥物檢測中發(fā)現(xiàn)，奎尼丁干預顯著延長了SQTS患者（攜帶KCNH2 基因T618I突變）的QTc間期，降低了T 波波幅。在細胞水平，奎尼丁有效地恢復SQTS-hiPSC-CMs中的APD，突出了患者特異性hiPSC-CMs在體外實驗中再現(xiàn)藥物治療效果的能力。此外，該研究團隊還發(fā)現(xiàn)，Bm KKx2 可通過靶向抑制KCNH2通道進而延長APD，這些結果表明，Bm KKx2等多肽毒素可作為未來發(fā)現(xiàn)治療SQTS藥物的先導化合物。這些研究表明，患者特異性和GC-iPSC-CMs能夠再現(xiàn)SQTS的單細胞表型。這些發(fā)現(xiàn)將有助于闡明SQTS的機制，并發(fā)現(xiàn)以肽毒素為先導化合物治療該疾病的治療藥物。

3 SQTS-hiPSCs-CMs在藥物檢測中的應用

目前奎尼丁被證明是治療SQTS1 患者唯一有效的藥物，但是臨床用藥發(fā)現(xiàn)，奎尼丁具有較為嚴重的胃腸道反應。Zhao等[15]利用來自SQTS1患者的hiPSC-CMs檢測伊伐布雷定、阿嗎靈、美西律、氟卡尼、雷諾嗪、胺碘酮對動作電位（AP）的影響和心律失常事件的發(fā)生，以尋找治療SQTS1患者的潛在有效藥物。他們采用膜片鉗技術和單細胞收縮測量來評估藥物效應。研究發(fā)現(xiàn)，伊伐布雷定、美西律、阿嗎靈可以延長SQTS1-hiPSCs-CMs的AP，其潛在機制可能是這些藥物能夠明顯抑制KCNH2通道，進而使IKr電流密度降低；此外，伊伐布雷定、美西律、阿嗎靈還可減少腎上腺素誘發(fā)的心律失常；而氟卡尼、雷諾嗪以及胺碘酮卻沒有此類作用[15]。但該研究僅使用了1 例SQTS1 患者的hiPSCs-CMs，其顯示的藥物效應還需在更多不同SQTS1患者來源的hiPSCs-CMs進行驗證。

丙吡胺可延長QTc間期，并可通過阻滯鉀通道標準化QTc[16]。Lan等[17]首次以SQTS1 患者（HERG 通道攜帶N588K 突變）的hiPSC-CMs 為模型，探究了丙吡胺延長APD 和抗心律失常作用的離子機制。研究發(fā)現(xiàn)，丙吡胺能夠延長SQTS1-hiPSCs-CMs的APD 并能減少自發(fā)搏動的SQTS1-hiPSCs-CMs經卡巴膽堿和腎上腺素干預后心律失常事件的發(fā)生，其可能機制是，丙吡胺通過增強內向L 型鈣電流（ICa-L）、晚鈉電流、鈉鈣交換電流（INCX）并抑制外向小電導鈣活化鉀通道電流（ISK），進而改善SQTS1-hiPSCs-CMs的APD，但丙吡胺對快速和緩慢激活的延遲整流鉀通道電流和ATP敏感型鉀通道電流無影響。在正常對照組的hiPSC-CMs中，丙吡胺抑制峰鈉電流、ICa-L、IKr以及ISK，同時能夠增強晚鈉電流和INCX。這些結果表明，丙吡胺可有效預防HERG 通道攜帶N588K 突變的SQTS1患者的快速心律失常。

Huang等[18]使用健康者和SQTS1 患者（攜帶N588K突變）的hiPSC-CMs檢測藥物對h ERG 通道門控動力學的影響。研究結果顯示，與健康者來源的hiPSC-CMs相比，阿嗎靈、胺碘酮、伊伐布雷定、氟卡尼、奎尼丁、美西律和雷諾嗪對來自SQTS1患者來源的hiPSC-CMs的HERG 通道電流（IKr）的抑制程度較低?？岫『兔牢髀赡軠p少SQTS-hiPSC-CMs和健康者hiPSC-CMs的IKr達到峰值的時間，但阿瑪林、胺碘酮、伊伐布雷定和雷諾嗪產生了相反的效應。由于激活或失活曲線的移動可能會改變窗口電流，因此評估了同一細胞在無藥物和有藥物情況下的IKr窗口電流。在SQTS1-hiPSC-CMs中，奎尼丁、伊伐布定、阿嗎靈和美西律降低了IKr窗口電流，但胺碘酮、氟卡尼和雷諾嗪未能降低IKr窗口電流。這些研究結果提示，窗口電流減少和失活減緩效應可能是藥物在HERG 突變的SQTS1患者發(fā)揮抗心律失常作用的主要機制，這些發(fā)現(xiàn)可能有助于我們尋找治療SQTS1患者的潛在候選藥物。以上研究提示，SQTS患者來源的hiPSC-CMs可為患者選擇有效藥物提供良好的體外模擬平臺。

4 組織水平上構建SQTS模型

對遺傳性心律失常的研究大多集中于hiPSC-CMs的細胞特性，即動作電位特性和離子電流分布。研究更復雜的電生理現(xiàn)象，如傳導和折返在心律失常綜合征（如SQTS），則需要發(fā)展多細胞的組織模型，近年來有學者致力于構建能夠更準確概括組織和器官水平疾病病理生理特征的SQTS模型[19]。Shinnawi等[20]首次報道整合患者的hiPSC-CMs、CRISPR/Cas9基因組編輯和組織工程技術作為工具研究SQTS。該團隊利用的hiPSCs來源于有3代心臟猝死家族史的SQTS患者，基因檢測發(fā)現(xiàn)，該患者KCNH2基因編碼的HERG 通道存在雜合錯義突變（N588K）。利用CRISPR/Cas9基因編輯技術，將該患者來源的hiPSCs系中的突變修正，以建立相同遺傳背景的對照組，然后在細胞水平上檢查hiPSC-CMs的電生理特性。全細胞膜片鉗記錄顯示，與糾正或健康系相比，SQTS-hiPSC-CMs的APD 明顯縮短。進一步的研究發(fā)現(xiàn)，通道蛋白表達增加和失活減弱導致IKr電流增強，這與其他學者[12，14]的在細胞水平上的研究結果是一致的。作者將hiPSCs-CMs作為大型（5 mm）心肌細胞片植入三維模具結構中；這種簡單的類組織結構（SQTS-hiPSCCCSs）使細胞形成功能合胞體，并能均勻增殖。光學標測（optical mapping）顯示SQTS-hiPSC-CCSs的APD 明顯縮短，但與正常組相比，傳導速率無明顯改變；SQTS-hiPSCCCSs經程序性電刺激后發(fā)生折返性心律失常的敏感性增加，與SQTS患者心室顫動誘發(fā)性增加一致；并在該模型上證實奎尼丁和二吡嗪通過延長APD 發(fā)揮抗心律失常作用。該項研究表明，使用患者特異性hiPSC-CMs在細胞和組織水平上再現(xiàn)SQTS疾病表型的能力，并為SQTS患者心律失常的起始、持續(xù)和治療提供新的見解，以及為藥物研發(fā)和測試提供獨特的實驗平臺。

5 結語

hiPSCs具有無限增殖和多向分化的潛能，據此分化獲得的hiPSC-CMs 可以模擬多種心血管疾病模型，結合CRISPR/Cas9基因編輯技術也極大地促進了hiPSC-CMs在SQTS等多種遺傳性心臟病中的應用，為SQTS的遺傳病理生理機制探討以及潛在治療藥物的檢測提供了很好的研究平臺。