豬圓環(huán)病毒核酸檢測技術研究進展

周婷婷 劉 帥

（1新疆維吾爾自治區(qū)牧業(yè)信息中心，烏魯木齊 830000；2新疆畜牧科學院獸醫(yī)研究所，烏魯木齊 830000）

豬圓環(huán)病毒（porcine circovirus,PCV）是單股負鏈環(huán)狀DNA病毒，為無囊膜的二十面體對稱結(jié)構(gòu)，屬圓環(huán)病毒科（circovirdae）、圓環(huán)病毒屬（circovirus）成員[1]。目前可以將豬圓環(huán)病毒分為豬圓環(huán)病毒1型（PCV1）、豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）、豬圓環(huán)病毒3型（PCV3）以及2019年在我國湖南某豬場新鑒定的豬圓環(huán)病毒4型（PCV4）[2]。PCV基因組大小約為1 700～2 000 kb，主要編碼Rep蛋白和Cap蛋白，根據(jù)PCV的Cap蛋白進行系統(tǒng)發(fā)育分析是劃分PCV基因型的有力工具。目前，PCV2主要流行的基因亞型為PCV2a、PCV2b以及PCV2d，而相關研究表明全球的PCV2流行情況已經(jīng)由PCV2b向PCV2d轉(zhuǎn)變[3-5]。而PCV3也存在多種亞型，主要為PCV3a、PCV3b以及 PCV3c[6]。PCV4在進化關系上與水貂圓環(huán)病毒（MiCV）最近。PCV3和PCV4的報道讓臨床上感染PCV的情況變得復雜，對養(yǎng)豬業(yè)造成了極大的危害。

在致病性方面，PCV1無致病性，而PCV2的致病性較高，主要引起仔豬斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征（postweaning multisystemic wasting syndrome,PMWS）等一系列豬圓環(huán)病毒相關疾病，PCV2感染可以使豬出現(xiàn)免疫抑制，導致疫苗免疫失敗的發(fā)生，造成其他病原的繼發(fā)感染。PCV3首次于2016年在美國報道[7]，當?shù)啬肛i出現(xiàn)繁殖障礙和皮炎腎病（PDNS）問題，經(jīng)相關病原的測序及分析，將該新型病毒歸類為PCV3型，隨后PCV3在世界范圍內(nèi)被相繼報道。PCV4在患有呼吸道疾病、腸炎和PDNS的豬群中首次被鑒定[7]。因此，了解PCV感染所造成的臨床癥狀，建立高通量，快速的抗原、抗體檢測方法具有重要的意義。近年來，科研工作者建立了許多新的檢測PCV的方法，對于PCV致病機理的了解也越來越深入。因此，本文匯總了PCV感染所引起患病豬的臨床癥狀以及近幾年新建立的針對PCV的核酸檢測技術，以期對臨床上根據(jù)不同情況和應用方向來選擇合適的檢測方法提供參考。

1 宏基因組測序分析

宏基因組是指特定環(huán)境中全部微生物的總DNA或RNA。隨著測序技術的發(fā)展，病毒宏基因組學和高通量測序技術（next-generation sequencing,NGS）已能夠廣泛應用于病毒的檢測和鑒定。運用NGS對臨床樣品中存在的幾乎所有微生物的基因組片段進行測序，然后根據(jù)可公開獲得的基因組數(shù)據(jù)庫進行重新組裝，鑒定出樣品中存在的核苷酸序列。PCV3的鑒定得益于這種技術，2016年美國當?shù)氐幕疾∧肛i出現(xiàn)PNDS和木乃伊胎癥狀，而通過PCR鑒定PCV2以及PRRSV等病原的核酸為陰性，Palinski等將[7]相關病料進行宏基因組測序，組裝獲得了2 000 bp的與PCV2相近的核苷酸序列，并通過滾環(huán)擴增鑒定引起這些臨床癥狀的病原為PCV3。Franzo[8]等運用宏基因組學方法在患有仔豬斷奶發(fā)育不全綜合征（periweaning failure-to-thrive syndrome,PFTS）的豬群中檢測出PCV3。此外，也檢測到了PPV6、BoPV2的廣泛存在。Blomstrom等[9]利用宏基因組測序分析技術探究了健康豬和患有PWMS的豬體內(nèi)病毒的共感染情況，發(fā)現(xiàn)PCV2、TTSuV1、TTSuV2廣泛存在于患有PMWS豬體內(nèi)，然而這些病毒在健康豬體內(nèi)也同樣存在，但其含量相對較少。此外，該研究還鑒定了一種新型非典型豬瘟病毒（APPV）存在于歐洲患有PMWS豬的體內(nèi)。Sun等[10]通過宏基因組測序分析，對我國1996—2016年的病料進行了PCV3的回溯性研究，發(fā)現(xiàn)最早于1996年我國的豬群中就已經(jīng)存在PCV3。

2 多重PCR

多重PCR是通過在一個PCR體系中添加多對引物，同時擴增出多個核酸片段的PCR反應。相比于普通PCR，多重PCR具有快速鑒別診斷不同病原的優(yōu)勢，大大縮短了核酸檢測時間和試劑消耗。Zhang等[11]建立的雙重納米PCR方法鑒別診斷PCV2和PCV3，其對于PCV2的檢測限為9.32×101拷貝/μL，PCV3的檢出限為9.16×101拷貝/μL，其靈敏度比普通雙重PCR方法靈敏100倍，且擴增不會出現(xiàn)其他雜帶。Yang等[12]建立了檢測PCV的多重PCR，該方法對PCV1、PCV2或PCV3的檢出限均為10拷貝/μL，通過擴增條帶大小的不同鑒定檢測結(jié)果。Liu等[13]建立了多重PCR檢測和鑒別豬流行性腹瀉病毒（PEDV）、傳染性胃腸炎病毒（TGEV）、豬A型輪狀病毒（RVA）、豬C型輪狀病毒（RVC）和豬圓環(huán)病毒2（PCV2）等5種豬腹瀉相關病毒，多重PCR的檢測限為50拷貝。運用該方法檢測了69個田間樣品，其中PCV2的陽性率為37.7%、PEDV和RVC為4.3%、TGEV為2.9%、RVA為1.4%。

3 熒光定量PCR

熒光定量PCR是近幾年來常用的臨床檢測病毒的一種方法，通過熒光信號不斷累積而實現(xiàn)實時監(jiān)測PCR過程，然后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的PCR方法。目前有SYBR GreenⅠ染料法和TaqMan探針法，其中染料法操作簡便，而探針法更加特異。Henriques等[14]建立了基于TaqMan探針的實時PCR方法檢測樣品中的PCV2 ORF1基因，該測定法可以檢測至少3個質(zhì)?？截?。李曉菲等[15]建立了檢測PCV3的TaqMan-MGB熒光定量PCR方法，其質(zhì)粒檢測范圍為4.78×101～4.78×109拷貝/μL，較常規(guī)PCR方法的敏感度高100倍。Chen[16]建立了基于SYBR GreenⅠ的實時熒光定量PCR檢測方法用于PCV3的檢測。

此外，雙重或多重熒光定量PCR是在臨床上同時檢測多種病毒的有力工具。Wang等[17]建立了多重qPCR檢測方法用于檢測和區(qū)分PCV3和PCV2。確定為每個反應質(zhì)粒拷貝的檢測下限（LOD），PCV3為17拷貝，PCV2為14拷貝。Li等[18]建立了檢測PCV2和PCV3的雙重熒光定量PCR檢測方法，該方法對PCV2質(zhì)粒的敏感性為2.9拷貝，對PCV3質(zhì)粒的敏感性為22.5拷貝，運用該方法檢測340份臨床樣品，其中PCV2與PCV3的混合感染率為27.6%。Kim等[19]建立了用于PCV2和PCV3快速鑒別診斷的多重熒光定量PCR檢測方法，檢出限均在PCV2和PCV3靶基因的50個拷貝以下。運用該方法檢測國內(nèi)某豬場的PCV感染情況，結(jié)果顯示PCV2和PCV3單獨感染率分別為21.7%和6.5%，而PCV3與PCV2混合感染率為28.3%。Zhao等[20]建立了基于TB GreenⅡ的雙重qPCR以檢測PCV2和PCV3，對于PCV2和PCV3的檢出限分別為10和78拷貝/μL。該方法檢測了56個組織樣本，PCV2與PCV3共感染率為39.28%（22/56）。這些熒光定量PCR方法的建立可以用來對PCV2和PCV3進行快速的調(diào)查，以監(jiān)測它們在豬場中的流行情況。

4 環(huán)介導等溫核酸擴增技術

環(huán)介導等溫核酸擴增（LAMP）檢測方法是一種快速而簡單的檢測方法，可適用于實驗室診斷和田間檢測，該方法只需常規(guī)水浴或熱阻即可進行反應。Zhou等[21]建立了用于快速檢測PCV2 ORF2基因的LAMP方法。在63℃下60 min即可完成擴增，檢測限接近DNA質(zhì)粒的1個拷貝，比PCR更加靈敏。Park等[22]開發(fā)了一種使用羥基萘酚藍的LAMP分析方法，用于快速可視化檢測PCV3 Cap基因，擴增可以在62℃下40 min內(nèi)完成，并且可以用肉眼目測檢測結(jié)果，檢測限為50個PCV3 DNA拷貝，與qPCR的拷貝數(shù)相當。Zheng等[23]建立的LAMP方法檢測PCV3，在60℃水浴60 min即可完成擴增。該方法檢測極限約為1×101拷貝。Wang等[24]建立了檢測PCV3的LAMP方法，其檢測限為1×101拷貝/μL。因此，RT-LAMP比常規(guī)PCR靈敏度更高，操作更加簡便。

5 聚合酶螺旋反應

聚合酶螺旋反應（PSR）同樣屬于一種恒溫擴增核酸的方法，其原理是運用一對寡核苷酸引物，在引物的5’端添加互為反向的核苷酸片段，在恒溫條件下使目的基因螺旋式延伸，從而完成核酸的擴增。Ji等[25]建立的PSR可以在62℃水浴50 min即可精確擴增PCV3基因組。可以通過凝膠電泳或使用包含酚紅和甲酚紅指示劑的染料進行結(jié)果鑒定，檢測極限為1.13×102拷貝/μL，特異性良好，運用PSR檢測臨床樣品中的PCV3，其陽性檢出率要高于RT-LAMP檢測。

6 原位雜交技術

原位雜交技術（in situ hybridization,ISH）是利用設計的探針與組織或細胞上待測核酸互補配對，結(jié)合形成專一的核酸雜交分子，然后將待測核酸在組織或細胞上的位置顯示出來的一種核酸檢測方法。王曉捷等[26]針對PRRSV N基因和PCV2 Rep基因序列設計了2組特異性探針，利用RNAscope原位雜交技術分別檢測了同一豬肺泡巨噬細胞（PAMs）中PRRSV和PCV2單獨感染或PRRSV與PCV2共感染的情況，其檢測結(jié)果與IFA結(jié)果一致。Phan等[27]利用原位雜交技術檢測PCV3在感染豬的心臟和肺臟中的分布情況，結(jié)果表明PCV3在心肌細胞和心肌中的炎癥細胞等多處存在，這些細胞都顯示出彌漫性的肌漿、胞漿反應，而在肺組織切片未能檢測到PCV3。Mora-Díaz等[28]運用原位雜交技術驗證了PCV3分離株在CD/CD模型豬體內(nèi)的復制，結(jié)果表明PCV3在心肌細胞、動脈中膜和內(nèi)皮細胞以及炎性細胞內(nèi)均有陽性信號。此外，在腎小管上皮、內(nèi)皮細胞中同樣存在PCV3 DNA。

7 小結(jié)

豬圓環(huán)病毒病對我國養(yǎng)豬業(yè)的危害日益嚴重，雖然有針對PCV2的滅活疫苗和亞單位疫苗在田間使用，但PCV2仍然在田間流行。隨著對PCV3的檢出以及對PCV3的回顧性研究越來越多，發(fā)現(xiàn)PCV3早在多年前便存在于豬體內(nèi)[29]，臨床上PCV2與PCV3的共感染情況嚴重，有研究表明PCV2與PCV3存在抗原性差異，PCV2疫苗并不能免疫豬群免受PCV3感染[30]，且由于PCV3的存在是否會影響PCV2疫苗的免疫效果尚不清楚[31]。目前仍沒有PCV3的疫苗在臨床上應用。此外，定期監(jiān)測PCV抗體和開展PCV分子流行病學調(diào)查同樣具有重要意義。

多重PCR、qPCR在快速鑒別診斷方面發(fā)揮著重要的作用，通過一次反應就能夠鑒別出樣品中的不同病毒，大大縮短了檢測時間。而RT-LAMP、PSR由于其可視化、恒溫快速的優(yōu)勢則更適合田間檢測。而ISH和IHC更適合研究病毒在宿主體內(nèi)的分布情況，能夠準確檢測病毒在組織或細胞中的定位情況。