血清miR-223-3p和miR-17-5p水平與前列腺癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的關(guān)系及其預(yù)測價值分析*

孫江江，劉 博，周少英△，李 敏

邯鄲市中心醫(yī)院：1.泌尿外科；2.檢驗科，河北邯鄲 056000

前列腺癌是男性泌尿生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，近年來我國男性前列腺癌發(fā)病率呈升高趨勢，有報道顯示，2019年我國前列腺癌發(fā)病率僅次于肺癌，位居男性惡性腫瘤的第二位[1]。目前，臨床上對于前列腺癌患者主張早期行前列腺癌根治術(shù)治療。有研究顯示，采用同一手術(shù)方案治療的不同患者預(yù)后并不完全相同[2]，提示除手術(shù)方案外，前列腺癌患者的預(yù)后還與多種因素有關(guān)。腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是造成患者死亡的主要原因，研究前列腺癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移有效預(yù)測指標具有重要的臨床意義。微小RNA(miRNA)是一類具有調(diào)控基因表達功能的內(nèi)源性小RNA分子，參與機體多種生理、病理過程[3]。已有研究表明，miR-223-3p和miR-17-5p均是能夠調(diào)節(jié)細胞增殖的miRNA，與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[4-5]。有報道顯示，miR-223可以促進胃癌細胞的轉(zhuǎn)移[6]，miR-17-5p可以促進結(jié)直腸癌細胞的增殖和轉(zhuǎn)移[7]，但兩者是否與前列腺癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移有關(guān)仍未完全明確。故本研究對本院收治的前列腺癌患者血清miR-223-3p和miR-17-5p水平進行了分析，旨在為前列腺癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的預(yù)測提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2015年1月至2017年6月本院收治并行前列腺癌根治術(shù)治療的120例患者作為研究對象，另選擇同期30例體檢健康志愿者作為對照組。術(shù)前采集患者臨床資料，包括年齡、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、吸煙史、糖尿病史、高血壓病史、前列腺癌家族史、收縮壓、舒張壓、前列腺體積、臨床分期。納入標準：(1)所有患者診斷均符合前列腺癌診斷標準，并經(jīng)穿刺活檢及術(shù)后病理診斷證實為前列腺癌[8]；(2)患者初次患病就診，臨床資料完整；(3)患者具有前列腺癌根治性手術(shù)治療指征，未接受放療、化療及免疫治療；(4)患者及家屬對本研究知情同意。排除標準：(1)合并嚴重心、肺、腎功能障礙者；(2)術(shù)前合并其他惡性腫瘤者；(3)疾病嚴重，預(yù)計術(shù)后生存期小于12個月者；(4)生活不能自理，不能完成本研究者；(5)失訪患者。根據(jù)納入、排除標準，最終納入的116例行前列腺癌根治術(shù)患者作為觀察組，年齡41～78歲，平均(62.14±8.86)歲；BMI 19～27 kg/m2，平均(23.01±2.43)kg/m2；有吸煙史42例，糖尿病史26例，冠心病史16例，高血壓病史33例，前列腺癌家族史6例；術(shù)前收縮壓115～145 mm Hg，平均(127.85±15.82)mm Hg；術(shù)前舒張壓72～95 mm Hg，平均(78.01±10.12)mm Hg；術(shù)前前列腺體積65～80 cm3，平均(71.05±15.56)cm3；臨床分期Ⅰ期35例，Ⅱ期49例，Ⅲ期32例；Gleason評分：≤7分79例，>7分37例。對照組年齡40～80歲，平均(61.07±8.12)歲；BMI 20～28 kg/m2，平均(22.89±2.11)kg/m2。觀察組與對照組年齡、BMI差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會同意。

1.2方法

1.2.1治療方法 所有患者在全身麻醉下行腹腔鏡前列腺癌根治術(shù)?；颊哐雠P位，臍下切口建立人工氣腹，氣腹壓力維持在12～15 mm Hg，經(jīng)臍下將Trocar置入腹腔鏡，在臍下腹直肌兩側(cè)第一Trocar放置5 mm和12 mm Trocar，髂前上棘內(nèi)側(cè)放置5 mm Trocar，置入腔鏡，并進行操作，分離髂血管及神經(jīng)，清掃脂肪組織及淋巴結(jié)組織。切斷恥骨前列腺韌帶，離斷陰莖背深靜脈叢，切開尿道前后壁，并游離精囊，切斷兩側(cè)輸精管，切開尿道的前、后、側(cè)壁，進行前列腺癌根治術(shù)，重建膀胱頸，吻合尿道，縫合切口。術(shù)后常規(guī)留置導(dǎo)尿，抗感染及補液治療。術(shù)后根據(jù)不同形態(tài)結(jié)構(gòu)的前列腺癌成分占比多少，將前列腺癌分成主要分級區(qū)和次要分級區(qū)，各區(qū)評分范圍為1～5分(分越低，分化越好，惡性程度則越低，反之亦然)，將主要分級區(qū)和次要分級區(qū)評分相加，即為前列腺癌的Gleason評分，范圍為2～10分。

1.2.2血清的采集及保存 采集患者術(shù)前和健康體檢者體檢當日清晨空腹外周靜脈血10 mL，血液標本室溫下靜置10 min，以離心半徑6 cm、轉(zhuǎn)速3 500 r/min離心10 min，分離血清，將血清置于-80 ℃冰箱保存待檢。

1.2.3血清miR-223-3p和miR-17-5p水平檢測 采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qPCR)檢測血清miR-223-3p和miR-17-5p水平。應(yīng)用Trizol(美國Invitrogen生產(chǎn)，批號：20151123)提取血清總RNA，采用美國哈希DR3800分光光度計測量260 nm處的吸光度值在1.8～2.0，表明樣本有效。應(yīng)用Taq Man RT kit(日本Takara生產(chǎn)，批號：160216)進行反轉(zhuǎn)錄，提取總cDNA，應(yīng)用TaqMan MicroRNA assay(廣州銳博生物公司生產(chǎn)，批號160118)進行擴增反應(yīng)，以U6為內(nèi)參，引物序列(表1)由蘇州吉瑪有限公司合成。反應(yīng)體系：cDNA 1.33 μL，TaqMan MicroRNA assay 1.00 μL，Taq Man 2×Universal PCR Master Mix 10.00 μL，ddH2O 7.67 μL，共計20 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性15 s，55 ℃退火15 s，60 ℃延伸60 s，共計45個循環(huán)，并重復(fù)3次，完成后通過2-ΔΔCt法計算miR-223-3p和miR-17-5p相對表達水平。

表1 miR-223-3p、miR-17-5p及內(nèi)參U6的引物序列

1.2.4血清前列腺特異抗原(PSA)及睪酮檢測 采用酶聯(lián)免疫吸附試驗及配套試劑盒(購自上海恒遠生物科技有限公司)檢測患者血清PSA水平，計算血清游離前列腺特異抗原/總前列腺特異抗原(fPSA/tPSA)；采用羅氏Cobase 601電化學發(fā)光分析儀及配套試劑盒(購自廣州兆康生物科技有限公司)檢測血清睪酮水平。均嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.2.5隨訪 所有患者通過門診或電話隨訪3年，隨訪截止時間為2020年6月，隨訪期間每3個月通過電話或患者到門診進行復(fù)查，如患者出現(xiàn)以下情況則認定為復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移：患者血清PSA持續(xù)上升或PSA水平連續(xù)兩次≥0.2 ng/mL；直腸指檢發(fā)現(xiàn)異常硬結(jié)；骨掃描CT發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移病灶；經(jīng)直腸超聲檢查或活檢證實轉(zhuǎn)移[9]。隨訪3年，4例患者失訪，予以剔除，剩余116例患者中，其中37例發(fā)生復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的患者作為復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組，79例未發(fā)生復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的患者作為未復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組。

2 結(jié) 果

2.1觀察組與對照組血清miR-223-3p、miR-17-5p水平比較 觀察組血清miR-223-3p、miR-17-5p水平分別為2.664±0.706、3.145±0.923，對照組血清miR-223-3p、miR-17-5p水平分別為0.829±0.128、1.203±0.221，觀察組血清miR-223-3p、miR-17-5p水平明顯高于對照組(t=14.141、11.412，P<0.05)。

2.2臨床資料在復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組與未復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組間的比較 復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組與未復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組年齡、BMI，吸煙史、糖尿病史、高血壓病史、前列腺癌家族史患者比例，以及收縮壓、舒張壓、前列腺體積比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組臨床分期為Ⅲ期、Gleason評分>7分、血清PSA>20.33 ng/mL、fPSA/tPSA≤0.1、睪酮≤3.0 ng/mL的患者比例明顯高于未復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組(P<0.05)，見表2。

表2 臨床資料在復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組與未復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組間的比較或n(%)]

2.3復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組與未復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組血清miR-223-3p、miR-17-5p水平比較 復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組血清miR-223-3p、miR-17-5p水平均明顯高于未復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組(P<0.05)，見表3。

表3 復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組患者與未復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組血清miR-223-3p、miR-17-5p水平比較

2.4前列腺癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的影響因素分析 以前列腺癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移情況為因變量(復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移賦值1，未復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移賦值0)，以表2、3中差異有統(tǒng)計學意義的指標為自變量，建立Cox風險比例回歸模型?；貧w過程采用逐步后退法，以進行自變量的選擇和剔除，設(shè)定α剔除=0.10，α入選=0.05。分析結(jié)果顯示，臨床分期Ⅲ期、Gleason評分>7分、PSA>20.33 ng/mL、fPSA/tPSA比值≤0.1、睪酮≤3.0 ng/mL、miR-223-3p>3.192、miR-17-5p>3.556是前列腺癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的危險因素(P<0.05)，見表4。

表4 前列腺癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移影響因素的Cox風險比例回歸模型分析

2.5miR-223-3p、miR-17-5p及血清PSA單獨和聯(lián)合檢測對前列腺癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的預(yù)測價值 以復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組為陽性樣本，未復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組組為陰性樣本，繪制ROC曲線，分析結(jié)果顯示，血清miR-223-3p、miR-17-5p、PSA單獨檢測預(yù)測前列腺癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的曲線下面積(AUC)為0.783(95%CI：0.585～0.975)、0.742(95%CI：0.503～0.977)、0.722(95%CI：0.479～0.964)；3項指標聯(lián)合檢測預(yù)測前列腺癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的AUC為0.859(95%CI：0.755～0.957)，準確度為0.853(99/116)，均明顯高于3指標單獨檢測。見表5、圖1。

表5 血清miR-223-3p、miR-17-5p、PSA單獨和聯(lián)合檢測對前列腺癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的預(yù)測價值

圖1 血清miR-223-3p、miR-17-5p、PSA單獨和聯(lián)合檢測預(yù)測前列腺癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的ROC曲線

3 討 論

前列腺癌發(fā)生、發(fā)展是一個多因素、多基因參與的復(fù)雜過程，患者術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移是造成患者死亡的重要原因之一[10]。miRNA是一類長度在18～25個核苷酸的內(nèi)源性非編碼小RNA分子，可與靶基因mRNA 3′端非編碼序列結(jié)合，發(fā)揮轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的作用[11]。研究表明，在機體內(nèi)miRNA可以調(diào)控多種細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，參與細胞增殖、凋亡、分化和遷移等過程，尤其是在惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展及復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移中，miRNA發(fā)揮重要的作用[12-13]。

miR-223-3是miR-223家族的重要成員，由一個獨立的啟動子轉(zhuǎn)錄。有報道顯示，miR-223-3主要在循環(huán)系統(tǒng)及肌細胞中高度表達，具有抑制成肌細胞增殖及促進成肌細胞分化的作用[14-15]。近年來有學者發(fā)現(xiàn)，miR-223-3可以調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境及癌基因、抑癌基因的表達水平，進而調(diào)節(jié)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[16]。目前研究表明，miR-223-3在調(diào)節(jié)腫瘤發(fā)生、發(fā)展中具有促癌和抑癌兩種作用[17-18]。YUAN等[19]報道，在淋巴瘤細胞系中轉(zhuǎn)染miR-223-3，淋巴瘤細胞的生長速度、集落形成、遷移和侵襲性降低。戚欣等[20]發(fā)現(xiàn)，在肝癌SMMC-7721細胞中，miR-223-3水平升高，并通過靶向RAC1促進肝癌細胞增殖，抑制肝癌細胞凋亡，從而促進肝癌的發(fā)生。miR-17-5p是miR-17-92簇中最重要的成員之一，是細胞增殖、自噬和凋亡等基本過程的重要調(diào)節(jié)因子[21]。目前研究發(fā)現(xiàn)，miR-17-5p在乳腺癌[22]、結(jié)直腸癌[23]、肺癌[24]和卵巢癌[25]中呈高表達，其水平與腫瘤的侵襲性和對化療藥物治療的反應(yīng)性有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，觀察組術(shù)前血清miR-223-3p、miR-17-5p水平明顯高于對照組(P<0.05)，且復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組血清miR-223-3p、miR-17-5p水平也明顯高于未復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組(P<0.05)，表明miR-223-3p、miR-17-5p可能促進前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展，與前列腺癌術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移及預(yù)后有關(guān)。推測其可能原因：PI3K/AKT信號通路是腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要信號通路，在前列腺癌中存在PI3K/AKT信號通路的異常激活，并影響基質(zhì)金屬蛋白酶的表達，后者起到降解細胞外基質(zhì)，促進前列腺癌表皮細胞向間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化的作用；另外，PI3K/AKT信號通路還可以促進肌動蛋白的細絲重構(gòu)，提高腫瘤細胞的運動能力[26]。郭金蘭等[27]報道，miR-17-5p可以靶向PI3K/AKT信號通路，調(diào)控皮膚鱗狀細胞癌細胞增殖、凋亡。ZHU等[28]報道，在胰腺癌中，下調(diào)microRNA-223水平可抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路的激活，從而抑制胰腺癌的發(fā)生。因此，本研究推測，miR-223-3p、miR-17-5p可能激活PI3K/AKT信號通路，升高基質(zhì)金屬蛋白酶的水平，從而增加細胞外基質(zhì)的降解，促進前列腺癌表皮細胞向間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化及肌動蛋白的細絲重構(gòu)，進而促進前列腺癌的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移。

本研究結(jié)果顯示，復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組臨床分期為Ⅲ期、Gleason評分>7分、血清PSA>20.33 ng/mL、fPSA/tPSA≤0.1、睪酮≤3.0 ng/mL的患者比例明顯高于未復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組(P<0.05)。臨床分期為Ⅲ期的患者腫瘤進展快，治療難度大，術(shù)后發(fā)生復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的風險也較高[23]。Gleason評分是目前臨床上廣泛采用的前列腺癌組織分級方法，與前列腺癌的生物行為和預(yù)后具有很高的關(guān)聯(lián)性，Gleason評分>7分為高危前列腺癌，患者術(shù)后發(fā)生復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的風險也較高[29]。PSA是一種含有237個氨基酸的多肽分子，正常情況下由前列腺產(chǎn)生，僅少量存在，具有分解精液中的主要膠狀蛋白的作用[30]。當發(fā)生前列腺疾病時，血清PSA水平會升高，其表達具有組織特異性[31]。fPSA/tPSA、睪酮也是目前臨床上診斷前列腺癌的重要指標，本研究結(jié)果表明上述指標與前列腺癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移及患者預(yù)后有關(guān)。

miR-223-3p、miR-17-5p水平升高可能通過調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境及癌基因水平來提高前列腺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移能力[32-33]，而PSA是評價前列腺疾病的重要血清學標志物，提示miR-223-3p、miR-17-5p與血清PSA在評價前列腺癌上可能有很好的一致性。本研究結(jié)果還顯示，臨床分期為Ⅲ期、Gleason評分>7分、血清PSA>20.33 ng/mL、fPSA/tPSA≤0.1、睪酮≤3.0 ng/mL、miR-223-3p>3.192、miR-17-5p>3.556是前列腺癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的危險因素。因此，對于存在以上因素的前列腺癌患者應(yīng)予以警惕，并有針對性的采取多學科協(xié)同治療，以改善患者預(yù)后。ROC曲線分析結(jié)果顯示，miR-223-3p、miR-17-5p、PSA單獨檢測預(yù)測前列腺癌術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移均有較高的靈敏度、特異度，但值得注意的是在前列腺炎、良性前列腺疾病中也可能出現(xiàn)PSA水平升高，臨床上應(yīng)注意鑒別[34]，故常采用3項指標聯(lián)合檢測，以改善對前列腺癌術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移預(yù)測的準確性。

綜上所述，血清miR-223-3p、miR-17-5p水平與前列腺癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移有關(guān)，二者對前列腺癌術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的預(yù)測具有較高價值。臨床分期、Gleason評分和血清PSA、miR-223-3p、miR-17-5p水平升高，以及fPSA/tPSA、睪酮水平降低是前列腺癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的危險因素，對存在這些危險因素的患者，應(yīng)早期給予綜合治療，以改善患者預(yù)后。