LncRNA NEAT1通過調(diào)控miR-124-3p對食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞遷移、侵襲的影響*

李險(xiǎn)波，張志強(qiáng)，韓小勇，甄志鵬，趙 欽

保定市第一中心醫(yī)院胸外科，河北保定 071000

食管癌是癌癥死亡的第六大主要原因，也是世界第八大常見癌癥類型[1]。食管癌多為食管鱗狀細(xì)胞癌(ESCC)，其占食管癌的90%以上，且侵襲性強(qiáng)，生物學(xué)行為復(fù)雜。ESCC主要由吸煙、飲酒或營養(yǎng)失衡等因素引起[2]。盡管外科手術(shù)、化學(xué)療法或放射療法等治療方法改善了ESCC患者的預(yù)后，但是接受治療的患者5年生存率僅為25%～30%[3-4]。因此，迫切需要探索用于治療ESCC的分子靶標(biāo)。

長非編碼RNA(LncRNA)是一類長度大于200個(gè)核苷酸的RNA分子，不能編碼蛋白質(zhì)[5]。近年來，發(fā)現(xiàn)越來越多的LncRNA在腫瘤中差異表達(dá)，并且在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用[6]。核富集轉(zhuǎn)錄本1(NEAT1)是一個(gè)約3.7 kb的核富集LncRNA，位于染色體11q13.1上[7]。相關(guān)研究表明，LncRNA NEAT1在膀胱癌、肺癌、乳腺癌和結(jié)直腸癌等多種惡性腫瘤中表達(dá)異常[8]，且LncRNA可以充當(dāng)天然“微小核糖核酸(miRNA)海綿”，阻止miRNA與信使RNA結(jié)合，抑制miRNA功能[9]。miR-124-3p作為近年來備受關(guān)注的miRNA之一，其在宮頸癌組織中低表達(dá)，且其表達(dá)水平與腫瘤浸潤深度、組織分化程度、國際婦產(chǎn)科學(xué)聯(lián)盟(FIGO)分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)[10]。但LncRNA NEAT1及miR-124-3p在ESCC發(fā)生、發(fā)展中的具體生物學(xué)功能尚不清楚，因此本研究通過體外培養(yǎng)食管癌Eca109細(xì)胞，探討LncRNA NEAT1及miR-124-3p對ESCC細(xì)胞遷移、侵襲的影響以及可能的分子機(jī)制，以期為ESCC的臨床治療提供重要的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞來源 ESCC細(xì)胞Eca109及正常人食管上皮細(xì)胞(HEEC)均購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)。

1.2主要試劑與儀器 miR-124-3p模擬物(miR-124-3p mimics)及其陰性對照(miR-NC)、miR-124-3p抑制物(anti-miR-124-3p)及其陰性對照(anti-miR-NC)、NEAT1過表達(dá)物(OE-NEAT1)及其陰性對照(OE-NC)、LncRNA NEAT1小干擾RNA(si-NEAT1)及其陰性對照(si-NC)均購自美國ThermoFisher公司；RPMI 1640培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)均購自TaKaRa公司；Transwell小室購自金圖生物科技有限公司；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒購自美國Bio-Rad公司；TaqMan反轉(zhuǎn)錄試劑盒、TransStart?Green qPCR SuperMix、雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒均購自北京全式金生物科技有限公司；熒光定量PCR儀、CO2培養(yǎng)箱均購自德國Sigma公司。

1.3方法

1.3.1細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 將HEEC、Eca109細(xì)胞均置于含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基中，在37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行常規(guī)原代培養(yǎng)。收集對數(shù)期生長的Eca109細(xì)胞，以1×106個(gè)/孔的密度接種到6孔培養(yǎng)板中，待細(xì)胞融合率達(dá)到80%左右時(shí)，利用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒對細(xì)胞進(jìn)行分組轉(zhuǎn)染。細(xì)胞分為空白組(細(xì)胞未轉(zhuǎn)染)、miR-NC組(細(xì)胞轉(zhuǎn)染50 pmol/μL miR-NC)、miR-124-3p mimics組(細(xì)胞轉(zhuǎn)染50 pmol/μL miR-124-3p mimics)、anti-miR-NC組(細(xì)胞轉(zhuǎn)染50 pmol/μL anti-miR-NC)、anti-miR-124-3p組(細(xì)胞轉(zhuǎn)染50 pmol/μL anti-miR-124-3p)、OE-NC組(細(xì)胞轉(zhuǎn)染5 μL OE-NC)、OE-NEAT1組(細(xì)胞轉(zhuǎn)染5 μL OE-NEAT1)、si-NC組(細(xì)胞轉(zhuǎn)染5 μL si-NC)、si-NEAT1組(細(xì)胞轉(zhuǎn)染5 μL si-NEAT1)、anti-miR-124-3p+si-NC組(細(xì)胞共轉(zhuǎn)染50 pmol/μL anti-miR-124-3p和5 μL si-NC)、anti-miR-124-3p+si-NEAT1組(細(xì)胞共轉(zhuǎn)染50 pmol/μL anti-miR-124-3p和5 μL si-NEAT1)，轉(zhuǎn)染48h 后，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.2實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)檢測LncRNA NEAT1及miR-124-3p表達(dá)水平 使用Trizol試劑進(jìn)行總RNA提取，利用TaqMan反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用TransStart?Green qPCR SuperMix試劑盒對LncRNA NEAT1及miR-124-3p進(jìn)行定量。擴(kuò)增反應(yīng)體系：2×TransStart?Green qPCR SuperMix 10 μL，正向引物(10 μmol/L)0.5 μL，反向引物(10 μmol/L)0.5 μL，cDNA模板(1 μg)2 μL，使用RNase-Free H2O補(bǔ)足至20 μL。擴(kuò)增條件：95 ℃，30 s；95 ℃，5 s；60 ℃，20 s；72 ℃，10 s，共40個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，標(biāo)準(zhǔn)化LncRNA NEAT1值；以U6為內(nèi)參，標(biāo)準(zhǔn)化miR-124-3p值。最后采用2-ΔΔCt法計(jì)算LncRNA NEAT1、miR-124-3p表達(dá)水平。所用引物序列見表1。

表1 LncRNA NEAT1、miR-124-3p、GAPDH、U6引物序列

1.3.3Transwell實(shí)驗(yàn)檢測Eca109細(xì)胞遷移情況 收集各組Eca109細(xì)胞，將細(xì)胞水平調(diào)整為1×104/mL，將Eca109細(xì)胞接種到100 μL無血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，然后加入到Transwell上腔室中。同時(shí)，將500 μL含10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基添加到下腔室。在37 ℃下孵育24 h后，將細(xì)胞用0.1%結(jié)晶紫染色20 min，最后在光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)遷移的細(xì)胞數(shù)目。

1.3.4Transwell實(shí)驗(yàn)檢測Eca109細(xì)胞侵襲情況 在上腔室中預(yù)先涂上Matrigel，37 ℃干燥1 h。收集各組Eca109細(xì)胞，將細(xì)胞水平調(diào)整為1×104/mL，其余步驟同上述1.3.3。

1.3.5雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證LncRNA NEAT1與miR-124-3p靶向關(guān)系 使用StarBase v3數(shù)據(jù)庫預(yù)測LncRNA NEAT1與miR-124-3p結(jié)合位點(diǎn)。分別構(gòu)建LncRNA NEAT1的野生型(WT)和突變型(MUT)3′-UTR區(qū)質(zhì)粒，標(biāo)記為WT-NEAT1、MUT-NEAT1。將Eca109細(xì)胞置于含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基中，于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱里培養(yǎng)，待Eca109細(xì)胞密度達(dá)到80%左右時(shí)，按照miR-NC+WT-NEAT1共轉(zhuǎn)染組、miR-124-3p mimics+WT-NEAT1共轉(zhuǎn)染組、miR-NC+MUT-NEAT1共轉(zhuǎn)染組、miR-124-3p mimics+MUT-NEAT1共轉(zhuǎn)染組轉(zhuǎn)染Eca109細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48 h后，通過雙熒光素酶測定系統(tǒng)進(jìn)行熒光素酶報(bào)告基因測定。

2 結(jié) 果

2.1HEEC、Eca109細(xì)胞中LncRNA NEAT1、miR-124-3p表達(dá)水平比較 與HEEC細(xì)胞相比，Eca109細(xì)胞中LncRNA NEAT1表達(dá)水平明顯升高，而miR-124-3p表達(dá)水平明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖1。

圖1 HEEC和Eca109細(xì)胞中LncRNA NEAT1、miR-124-3p表達(dá)水平比較

2.2下調(diào)LncRNA NEAT1表達(dá)水平對Eca109細(xì)胞遷移、侵襲的影響 qPCR結(jié)果顯示， si-NEAT1組Eca109細(xì)胞中LncRNA NEAT1表達(dá)水平明顯低于空白組和si-NC組(P<0.05)，提示Eca109細(xì)胞轉(zhuǎn)染si-NEAT1成功，見圖2A。Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與空白組和si-NC組比較，si-NEAT1組Eca109細(xì)胞遷移、侵襲數(shù)均明顯降低(P<0.05)，見圖2B、C、D、E。

注：A為空白組、si-NC組、si-NEAT1組Eca109細(xì)胞中LncRNA NEAT1表達(dá)水平比較；B、C為光學(xué)顯微鏡下(×400)空白組、si-NC組、si-NEAT1組Eca109細(xì)胞遷移(B)、侵襲(C)結(jié)果；D、E為空白組、si-NC組、si-NEAT1組Eca109細(xì)胞遷移(D)、侵襲(E)數(shù)比較；與空白組比較，aP<0.05；與si-NC組比較，bP<0.05。圖2 下調(diào)LncRNA NEAT1表達(dá)水平對Eca109細(xì)胞LncRNA NEAT1表達(dá)水平及遷移、侵襲能力的影響

2.3miR-124-3p過表達(dá)對Eca109細(xì)胞遷移、侵襲的影響 miR-124-3p mimics組Eca109細(xì)胞中miR-124-3p表達(dá)水平明顯高于空白組和miR-NC組(P<0.05)，提示Eca109細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-124-3p mimics成功，見圖3A。與空白組和miR-NC組比較，miR-124-3p mimics組Eca109細(xì)胞的遷移、侵襲數(shù)均明顯降低(P<0.05)，見圖3B、C、D、E。

注：A為空白組、miR-NC組、miR-124-3p mimics組Eca109細(xì)胞中miR-124-3p表達(dá)水平比較；B、C為光學(xué)顯微鏡下(×400)為空白組、miR-NC組、miR-124-3p mimics組Eca109細(xì)胞遷移(B)、侵襲(C)結(jié)果；D、E為空白組、miR-NC組、miR-124-3p mimics組Eca109細(xì)胞遷移(D)、侵襲(E)數(shù)比較；與空白組比較，aP<0.05；與miR-NC組比較，bP<0.05。圖3 miR-124-3p過表達(dá)對Eca109細(xì)胞LncRNA NEAT1表達(dá)水平及遷移、侵襲能力的影響

2.4LncRNA NEAT1靶向調(diào)控miR-124-3p的表達(dá) 利用StarBase v3數(shù)據(jù)庫預(yù)測發(fā)現(xiàn)LncRNA NEAT1與miR-124-3p存在結(jié)合位點(diǎn)，見圖4A。共轉(zhuǎn)染雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示，miR-124-3p mimics+WT-NEAT1組Eca109細(xì)胞的熒光素酶相對活性較miR-NC+WT-NEAT1組明顯降低(P<0.05)，而miR-124-3p imics+MUT-NEAT1組、miR-NC+MUT-NEAT1組Eca109細(xì)胞熒光素酶相對活性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖4B。qPCR檢測結(jié)果顯示，si-NEAT1組Eca109細(xì)胞中miR-124-3p表達(dá)水平明顯高于空白組和si-NC組(P<0.05)，而OE-NEAT1組miR-124-3p表達(dá)水平明顯低于空白組和OE-NC組(P<0.05)，見圖4C。

注：A為StarBase v3數(shù)據(jù)庫預(yù)測LncRNA NEAT1與miR-124-3p的結(jié)合位點(diǎn)；B為雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果；C為LncRNA NEAT1下調(diào)和過表達(dá)對miR-124-3p的靶向調(diào)控作用；與空白組比較，aP<0.05；與si-NC組比較，bP<0.05；與OE-NC組比較，cP<0.05。圖4 LncRNA NEAT1靶向調(diào)控miR-124-3p的表達(dá)

2.5抑制miR-124-3p表達(dá)逆轉(zhuǎn)了下調(diào)NEAT1表達(dá)水平對Eca109細(xì)胞遷移、侵襲的作用 qPCR結(jié)果顯示，si-NEAT1+anti-miR-124-3p組Eca109細(xì)胞中miR-124-3p表達(dá)水平明顯低于si-NEAT1組和si-NEAT1+anti-miR-NC組，提示Eca109細(xì)胞共轉(zhuǎn)染anti-miR-124-3p和si-NEAT1成功，見圖5A。與si-NEAT1組和si-NEAT1+anti-miR-NC組比較，si-NEAT1+anti-miR-124-3p組Eca109細(xì)胞的遷移、侵襲數(shù)均明顯升高(P<0.05)，見圖5B、C、D、E。

注：A為si-NEAT1組、si-NEAT1+anti-miR-NC組、si-NEAT1+anti-miR-124-3p組Eca109細(xì)胞中miR-124-3p表達(dá)水平比較；B、C為光學(xué)顯微鏡下(×400)si-NEAT1組、si-NEAT1+anti-miR-NC組、si-NEAT1+anti-miR-124-3p組Eca109細(xì)胞遷移(B)、侵襲(C)結(jié)果；D、E為si-NEAT1組、si-NEAT1+anti-miR-NC組、si-NEAT1+anti-miR-124-3p組Eca109細(xì)胞遷移(D)、侵襲(E)數(shù)比較；與si-NEAT1組比較，aP<0.05；與si-NEAT1+anti-miR-NC組比較，bP<0.05。圖5 同時(shí)抑制miR-124-3p及LncRNA NEAT1表達(dá)對Eca109細(xì)胞遷移、侵襲能力的影響

3 討 論

腫瘤細(xì)胞的遷移、侵襲被認(rèn)為是惡性腫瘤最重要的生物學(xué)特性之一，是惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展的重要因素。據(jù)統(tǒng)計(jì)，約90%的癌癥患者死于腫瘤細(xì)胞侵襲和遷移[11]。ESCC是常見的癌癥類型之一，由于缺乏特異性癥狀和有效的早期診斷方法，導(dǎo)致大多數(shù)ESCC患者確診時(shí)已出現(xiàn)腫瘤局部浸潤和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，隨之而來的是腫瘤浸潤、轉(zhuǎn)移引起的并發(fā)癥，這成為ESCC患者死亡的主要原因[12-13]。因此，更好地了解ESCC腫瘤發(fā)生的分子機(jī)制和篩選生物標(biāo)志物，對ESCC的早期診斷和治療具有重要意義。

近年來，研究發(fā)現(xiàn)LncRNA通過表觀遺傳修飾、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、miRNA海綿等多種途徑驅(qū)動腫瘤的發(fā)生與發(fā)展[14]，差異表達(dá)的LncRNA與腫瘤的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移和預(yù)后密切相關(guān)，有可能成為腫瘤治療的新靶點(diǎn)[15]。據(jù)報(bào)道，LncRNA NEAT1在喉鱗狀細(xì)胞癌組織中的表達(dá)水平明顯高于癌旁組織，且頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或臨床分期晚期患者的LncRNA NEAT1表達(dá)水平較高[16]；LncRNA NEAT1在ESCC細(xì)胞中高表達(dá)，能增強(qiáng)ESCC細(xì)胞活力和侵襲能力[17]；沉默LncRNA NEAT1后，胃癌細(xì)胞的增殖及侵襲能力明顯降低[18]。表明LncRNA NEAT1在多種腫瘤中具有促癌作用。本研究結(jié)果顯示，LncRNA NEAT1在ESCC細(xì)胞中高表達(dá)，下調(diào)LncRNA NEAT1表達(dá)水平可明顯抑制Eca109細(xì)胞的遷移、侵襲能力，這與前述研究結(jié)果一致。提示LncRNA NEAT1在ESCC中發(fā)揮癌基因的作用，LncRNA NEAT1可能成為治療ESCC的潛在靶點(diǎn)。

LncRNA可作為一種競爭性內(nèi)源性RNA與miRNA相互作用，參與靶基因的表達(dá)調(diào)控[19]。為了進(jìn)一步探究LncRNA NEAT1在ESCC細(xì)胞遷移、侵襲中的具體分子機(jī)制，本研究通過StarBase數(shù)據(jù)庫預(yù)測LncRNA NEAT1與miR-124-3p可以靶向結(jié)合，并通過雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)miR-124-3p是LncRNA NEAT1的靶基因。據(jù)相關(guān)研究報(bào)道，miR-124-3p能抑制肝癌增殖、遷移、侵襲和淋巴道轉(zhuǎn)移，同時(shí)具有促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡的作用[20]；miR-124-3p可通過下調(diào)靶基因STAT3的表達(dá)，進(jìn)而影響其下游的p-STAT3、細(xì)胞周期素D2和基質(zhì)金屬蛋白酶2信號通路，從而促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞凋亡，抑制鼻咽癌細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲[21]；miR-124-3p還能通過靶向CRKL抑制肝癌細(xì)胞的遷移、侵襲[22]；miR-124-3p也可通過靶向整合素β3抑制胃癌細(xì)胞的遷移、侵襲，且miR-124-3p可能成為治療胃癌的分子靶標(biāo)[23]。本研究結(jié)果顯示，miR-124-3p過表達(dá)可明顯抑制Eca109細(xì)胞遷移、侵襲，提示miR-124-3p在ESCC中發(fā)揮著抑癌作用。為進(jìn)一步驗(yàn)證LncRNA NEAT1靶向調(diào)控miR-124-3p對ESCC細(xì)胞的遷移和侵襲作用，本研究將Eca109細(xì)胞共轉(zhuǎn)染si-NEAT1和anti-miR-124-3p，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，抑制miR-124-3p表達(dá)逆轉(zhuǎn)了下調(diào)LncRNA NEAT1表達(dá)水平對Eca109細(xì)胞遷移、侵襲的抑制作用。提示下調(diào)LncRNA NEAT1表達(dá)水平對ESCC細(xì)胞的遷移、侵襲涉及的分子機(jī)制可能與激活miR-124-3p表達(dá)有關(guān)。LIU等[24]的研究表明LncRNA NEAT1敲低通過上調(diào)miR-124-3p表達(dá)水平而減弱肝癌細(xì)胞生長，與本研究結(jié)果一致。本研究只是在體外細(xì)胞水平上證明了LncRNA NEAT1/miR-124-3p在ESCC細(xì)胞遷移、侵襲過程中的作用，后續(xù)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)尚需進(jìn)一步深入研究。

綜上所述，下調(diào)LncRNA NEAT1表達(dá)水平可能通過激活miR-124-3p的表達(dá)來抑制ESCC細(xì)胞的遷移、侵襲能力，其為ESCC生物靶向治療提供了可能的靶點(diǎn)。