RDS早產(chǎn)兒SPOCK2、RELM-β、miR-21水平變化及相關(guān)性研究*

桂冬梅，尹楊艷，陳丹丹，蔡昌君

海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院兒科，海南?？?570102

呼吸窘迫綜合征(RDS)屬于肺功能不全類疾病，多見于早產(chǎn)、剖宮產(chǎn)、有窒息史的新生兒，發(fā)病時間多在出生后不久[1]。臨床研究指出，多種細(xì)胞因子在肺泡氧化應(yīng)激代償障礙、炎癥損傷等過程中發(fā)揮作用，共同推進(jìn)RDS的發(fā)生、發(fā)展[2]。研究表明，睪素2(SPOCK2)是睪丸細(xì)胞外軟骨素和硫酸乙酰肝素蛋白多糖的成員，與早產(chǎn)兒肺損傷發(fā)生有關(guān)[3]。抵抗素樣分子β(RELM-β)是一種在肺組織、血液等組織中表達(dá)的蛋白，在多種呼吸道疾病中起調(diào)節(jié)肺纖維化進(jìn)程，發(fā)揮炎癥效應(yīng)等作用，目前，關(guān)于RELM-β參與早產(chǎn)兒RDS的發(fā)生、進(jìn)展的研究少見[4]。還有研究顯示，微小RNA-21(miR-21)的高表達(dá)與多種肺部疾病相關(guān)，在中，miR-21表達(dá)與炎癥反應(yīng)進(jìn)程密切相關(guān)[5]。目前臨床關(guān)于RDS早產(chǎn)兒血清SPOCK2、RELM-β、miR-21水平及三者相關(guān)性的研究少見，故對此展開研究，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2019年1月至2020年1月在本院住院的50例RDS早產(chǎn)兒作為研究組，另選取同期于本院產(chǎn)科出生的50例健康早產(chǎn)兒作為對照組。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合《實(shí)用新生兒學(xué)》中新生兒RDS診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]，且胎齡<35周；(2)出生12 h內(nèi)出現(xiàn)發(fā)紺、呻吟、吸氣三凹征和呼吸急促，并呈進(jìn)行性加重；(3)吸室內(nèi)空氣時經(jīng)皮血氧飽和度<85%，動脈血?dú)夥治鲅醴謮?50 mm Hg，出現(xiàn)中央性發(fā)紺，需吸氧才能維持動脈血?dú)夥治鲅醴謮?50 mm Hg；(4)胸部X線檢查顯示有磨玻璃樣改變和支氣管充氣征。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)身體畸形早產(chǎn)兒；(2)先天性疾病早產(chǎn)兒；(3)母親有吸煙史早產(chǎn)兒；(4)肺部感染或其他呼吸系統(tǒng)疾病早產(chǎn)兒；(5)全身重要臟器功能不全早產(chǎn)兒；(6)有哮喘、鼻炎家族史早產(chǎn)兒。兩組胎齡、性別、體質(zhì)量、分娩方式、母親患妊娠期糖尿病和產(chǎn)前使用糖皮質(zhì)激素情況比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性；研究組新生兒窒息發(fā)生率(54.00%)高于對照組(28.00%)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，受試早產(chǎn)兒家長均知情并簽署同意書。

表1 兩組基線資料比較

組別n分娩方式[n(%)]剖宮產(chǎn)自然分娩母親患妊娠期糖尿病[n(%)]產(chǎn)前使用糖皮質(zhì)激素[n(%)]研究組5026(52.00)24(48.00)26(52.00)10(20.00)對照組5019(38.00)31(62.00)19(38.00) 8(16.00)χ2/t1.9802.5970.271P0.1590.1070.603

1.2指標(biāo)檢測

1.2.1病情分度[7]RDS早產(chǎn)兒均行胸部X線檢查，依據(jù)胸部X線片表現(xiàn)分級：Ⅰ級，兩肺野透亮度明顯降低，可見網(wǎng)狀影，均勻散在的細(xì)小顆粒；Ⅱ級，相較于Ⅰ級病變嚴(yán)重，可見支氣管充氣征延伸至肺野中外帶；Ⅲ級：病變明顯加重，支氣管充氣征明顯，心緣、膈面模糊。Ⅳ級：肺野呈白肺，支氣管充氣征呈現(xiàn)似禿葉樹枝狀，心肺界消失。根據(jù)胸部X線片分級判斷患兒病情嚴(yán)重程度，Ⅰ～Ⅱ級為輕度組(20例)，Ⅲ～Ⅳ級為中重度組(30例)。

1.2.2標(biāo)本采集 于清晨采集所有受試早產(chǎn)兒空腹靜脈血6 mL，分裝于兩管。一管4 mL(不抗凝)，以轉(zhuǎn)速3 000 r/min、離心半徑5 cm離心10 min，分離血清；另一管2 mL(抗凝)，以同樣參數(shù)離心分離血漿。將分離后獲得的血清、血漿均置于-80 ℃冰箱保存待檢。

1.2.3SPOCK2、RELM-β水平檢測 于-80 ℃冰箱中取出待檢標(biāo)本，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測血清RELM-β、血漿SPOCK2水平，試劑盒均購自上海裕平生物科技有限公司，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.2.4miR-21水平檢測 取適量血清標(biāo)本于EP管中，應(yīng)用實(shí)時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qPCR)檢測miR-21水平。按照miRNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司)說明書操作步驟，提取總miRNA，以此為模板，按照cDNA合成試劑盒(天根生化科技有限公司)說明書操作步驟，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，反應(yīng)條件：42 ℃ 60 min，95 ℃ 3 min。以U6為內(nèi)參，miR-21上游引物為5′-TCGGCGGTAGCTTATCAGACTGA-3′，下游引物為5′-ATCCAGTGCAGGGTCCGAGG-3′；U6上游引物為5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物為5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。采用Rcute增強(qiáng)型miRNA熒光定量檢測試劑盒(天根生化科技有限公司)，在qPCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)條件：變性95 ℃ 30 s；退火60 ℃ 20 s；延伸72 ℃ 10s，共40個循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計算miR-21的相對表達(dá)水平。

1.2.5隨訪 研究組治療出院后，進(jìn)行為期6個月的隨訪，電話聯(lián)系患兒家屬，對患兒進(jìn)行體格檢查，評估患兒神經(jīng)發(fā)育狀況，依據(jù)患兒神經(jīng)發(fā)育有無損傷，分為預(yù)后良好組(38例)和預(yù)后不良組(12例)。

1.2.6觀察指標(biāo) 記錄并比較各組SPOCK2、RELM-β、miR-21水平，分析研究組SPOCK2、RELM-β、miR-21間的相關(guān)性，比較不同病情嚴(yán)重程度、預(yù)后、臨床病理特征RDS早產(chǎn)兒SPOCK2、RELM-β、miR-21水平，分析SPOCK2、RELM-β、miR-21單獨(dú)和聯(lián)合檢測對早產(chǎn)兒RDS的診斷價值。

2 結(jié) 果

2.1研究組與對照組SPOCK2、RELM-β、miR-21水平比較 研究組SPOCK2、RELM-β、miR-21水平高于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 研究組與對照組SPOCK2、RELM-β、miR-21水平比較

2.2研究組SPOCK2、RELM-β、miR-21水平的相關(guān)性 Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示，SPOCK2水平與RELM-β、miR-21均呈正相關(guān)(r=0.459、0.552，P<0.05)，RELM-β水平與miR-21呈正相關(guān)(r=0.489，P<0.05)，見圖1。

注：A為SPOCK2水平與RELM-β間關(guān)系散點(diǎn)圖；B為SPOCK2水平與miR-21間關(guān)系散點(diǎn)圖；C為RELM-β水平與miR-21間關(guān)系散點(diǎn)圖。圖1 SPOCK2、RELM-β、miR-21間關(guān)系散點(diǎn)圖

2.3不同病情嚴(yán)重程度RDS早產(chǎn)兒SPOCK2、RELM-β、miR-21水平比較 中重度組SPOCK2、RELM-β、miR-21水平高于輕度組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表3。

表3 不同病情嚴(yán)重程度RDS早產(chǎn)兒SPOCK2、RELM-β、miR-21水平比較

2.4不同預(yù)后RDS早產(chǎn)兒SPOCK2、RELM-β、miR-21水平比較 預(yù)后不良組SPOCK2、RELM-β、miR-21水平高于預(yù)后良好組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

表4 不同預(yù)后RDS早產(chǎn)兒SPOCK2、RELM-β、miR-21水平比較

2.5不同臨床病理特征RDS早產(chǎn)兒SPOCK2、RELM-β、miR-21水平比較 母親是否患妊娠期糖尿病、是否患妊娠期高血壓、是否雙胎或多胎、是否胎膜早破的RDS早產(chǎn)兒SPOCK2、RELM-β、miR-21水平比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；新生兒窒息、母親產(chǎn)前未使用糖皮質(zhì)激素的RDS早產(chǎn)兒SPOCK2、RELM-β、miR-21水平高于無新生兒窒息、母親產(chǎn)前使用糖皮質(zhì)激素的RDS早產(chǎn)兒，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表4。

表4 不同臨床病理特征RDS早產(chǎn)兒SPOCK2、RELM-β、miR-21水平比較

續(xù)表4 不同臨床病理特征RDS早產(chǎn)兒SPOCK2、RELM-β、miR-21水平比較

2.6SPOCK2、RELM-β、miR-21單獨(dú)和聯(lián)合檢測對早產(chǎn)兒RDS的診斷價值 ROC曲線分析結(jié)果顯示，SPOCK2、RELM-β、miR-21聯(lián)合檢測診斷早產(chǎn)兒RDS的曲線下面積(AUC)、靈敏度、特異度、準(zhǔn)確度分別為0.952、90.0%、92.0%、91.0%，高于SPOCK2、RELM-β、miR-21單獨(dú)檢測的AUC(0.792、0.695、0.730)、靈敏度(78.0%、76.0%、72.0%)、特異度(76.0%、75.0%、76.0%)、準(zhǔn)確度(77.0%、75.0%、76.0%)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表5。

表5 SPOCK2、RELM-β、miR-21單獨(dú)和聯(lián)合檢測對早產(chǎn)兒RDS的診斷價值

圖2 SPOCK2、RELM-β、miR-21單獨(dú)和聯(lián)合檢測診斷早產(chǎn)兒RDS的ROC曲線

3 討 論

RDS是由于早產(chǎn)兒肺發(fā)育尚未成熟，各系統(tǒng)功能均不完善，以及肺表面活性物質(zhì)缺乏或失活所導(dǎo)致的呼吸障礙性疾病，具有較高的病死率。RDS早產(chǎn)兒易發(fā)生代謝性酸中毒、炎性因子浸潤，治療難度較大。目前多采用保護(hù)性機(jī)械通氣等方式治療，可降低RDS早產(chǎn)兒的病死率，然而其效果不太理想。因此，尋找早期診斷早產(chǎn)兒RDS和評估病情嚴(yán)重程度的指標(biāo)有著重要的臨床價值[8-9]。

SPOCK2是骨黏連蛋白家族的細(xì)胞外基質(zhì)鈣黏連蛋白，可能作用于細(xì)胞外蛋白酶級聯(lián)的調(diào)節(jié)[10]。有研究表明，SPOCK2與基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)相互作用，在肺發(fā)育中起關(guān)鍵作用[11]。陳濤等[12]研究結(jié)果顯示，SPOCK2可能參與肺發(fā)育過程，在高氧刺激時對肺組織起保護(hù)作用，SPOCK2的表達(dá)模式可能與肺發(fā)育不成熟密切相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，研究組SPOCK2水平高于對照組，且中度組高于輕度組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，說明SPOCK2水平可以反映患兒的疾病狀態(tài)。MMP-14和MMP-16可抑制pro-MMP-2活化，而SPOCK2則通過NH2末端結(jié)構(gòu)域與SPOCK3的羧基(COOH)末端結(jié)構(gòu)域結(jié)合，消除MMP-14和MMP-16的抑制作用，從而使得MMP-2激活，最終促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的降解和細(xì)胞的遷移、侵襲[13]。

RELM-β最早在結(jié)腸被發(fā)現(xiàn)，后來被證實(shí)在肺等組織中也有表達(dá)，RELM-β作為促有絲分裂因子，刺激氣道上皮細(xì)胞增殖，促進(jìn)多種轉(zhuǎn)化介質(zhì)的產(chǎn)生，參與肺血管重塑[14]。馬艷英等[15]研究結(jié)果顯示，非小細(xì)胞肺癌患者RELM-β水平升高，且與非小細(xì)胞肺癌病理分期呈正相關(guān)，可通過檢測RELM-β水平對非小細(xì)胞肺癌進(jìn)行診斷及病理分期評估。上述結(jié)果提示RELM-β與肺部疾病具有一定的聯(lián)系。本研究結(jié)果顯示，研究組RELM-β水平較對照組高(P<0.05)，且隨著RDS早產(chǎn)兒病情嚴(yán)重程度加重，其水平也逐漸升高(P<0.05)。RELM-β具有Th2細(xì)胞因子依賴性，可刺激肺血管內(nèi)皮細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞增殖，促進(jìn)膠原沉積和參與炎癥反應(yīng)，從而促進(jìn)微血管新生，調(diào)節(jié)毛細(xì)血管通透性，改善肺泡氧合，修復(fù)肺損傷，改善停滯的肺發(fā)育，當(dāng)病情進(jìn)展，肺損傷加重時，機(jī)體或選擇進(jìn)一步增加RELM-β的分泌來代償加重的肺損傷[16-17]。

miR-21在心血管系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)等多種疾病中均發(fā)揮作用，臨床上對早產(chǎn)兒RDS的治療包括抑制B細(xì)胞的增殖[18]。本研究結(jié)果顯示，miR-21水平在RDS早產(chǎn)兒中呈高表達(dá)(P<0.05)，且隨著患兒病情加重，其水平也逐漸升高(P<0.05)。目前對于miR-21水平升高是否促進(jìn)RDS早產(chǎn)兒疾病進(jìn)展尚不清晰。miR-21與抑癌基因PTEN的mRNA結(jié)合，抑制PTEN的表達(dá)[19]。另外有研究表明，PTEN下調(diào)可加強(qiáng)中性粒細(xì)胞的功能，提高免疫力，減少肺部細(xì)菌感染的發(fā)生[20]。在RDS患者中，miR-21上調(diào)可降低PTEN表達(dá)，對肺部起保護(hù)作用。同時，miR-21可逆向調(diào)控腫瘤壞死因子-α的表達(dá)，而腫瘤壞死因子-α可減少肺表面活性物質(zhì)表達(dá)。所以，miR-21可通過增加肺表面活性物質(zhì)、增強(qiáng)中性粒細(xì)胞功能，進(jìn)而在RDS中發(fā)揮作用[21]。

Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示，SPOCK2、RELM-β、miR-21互為正相關(guān)(P<0.05)；單因素分析結(jié)果顯示，新生兒窒息、母親產(chǎn)前未應(yīng)用糖皮質(zhì)激素的RDS早產(chǎn)兒SPOCK2、RELM-β、miR-21水平更高(P<0.05)?？赡芤?yàn)橹舷⒃谝欢ǔ潭壬蠐p傷了肺泡上皮細(xì)胞，抑制了肺表面活性物質(zhì)的合成及活性，以致發(fā)生RDS。ROC曲線分析結(jié)果顯示，SPOCK2、RELM-β、miR-21單獨(dú)檢測對早產(chǎn)兒RDS均有一定診斷價值，而這3項指標(biāo)聯(lián)合檢測診斷早產(chǎn)兒RDS的效能要優(yōu)于單獨(dú)檢測的診斷效能，提示檢測患兒SPOCK2、RELM-β、miR-21水平可能有助于RDS的診斷。本研究仍存在不足之處，如納入樣本量較少，結(jié)果可能受偏倚影響，需增大樣本量，獲取更為準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)，進(jìn)一步證實(shí)本研究。

綜上所述，RDS早產(chǎn)兒SPOCK2、RELM-β、miR-21水平升高且相互呈正相關(guān)，3項指標(biāo)聯(lián)合檢測對早產(chǎn)兒RDS的診斷價值較高。