利用高密度Bin 圖譜定位水稻葉綠素含量QTL

潘俊峰，崔克輝，劉彥卓，王昕鈺,，嚴(yán)博宇,，梁開明

（1.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所/ 廣東省水稻育種新技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/ 廣東省水稻工程實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華南優(yōu)質(zhì)稻遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510640；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)植物科技學(xué)院/作物遺傳改良國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部長(zhǎng)江中游作物生理生態(tài)與耕作重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430070）

【研究意義】水稻是我國(guó)主要糧食作物，其高產(chǎn)與穩(wěn)產(chǎn)對(duì)我國(guó)糧食安全意義重大。氮是植物需求量最大的養(yǎng)分之一。在水稻生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，合理施用氮肥可增加產(chǎn)量，氮營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)不充足則會(huì)導(dǎo)致水稻減產(chǎn)［1］，而過(guò)量施用氮肥會(huì)導(dǎo)致環(huán)境污染等問(wèn)題［2-3］。水稻葉綠素含量是對(duì)氮肥施用最為敏感的表型性狀之一，與植株光合作用密切相關(guān)；研究水稻葉綠素含量的遺傳機(jī)制，對(duì)氮高效的高產(chǎn)水稻品種選育具有重要意義［4-6］?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】水稻葉片葉綠素屬于多基因調(diào)控的數(shù)量性狀，其合成與降解易受環(huán)境影響［7］。利用不同遺傳群體分析苗期、抽穗期和灌漿期等時(shí)期不同部位葉片的水稻葉綠素含量，已成功定位了超過(guò)600 個(gè)QTL，分布于12 條染色體上［7-10］。QTL 定位最終目的是用于基因鑒定和育種應(yīng)用，以往研究大多采用RFLP、SSR 和STS 標(biāo)記構(gòu)建遺傳連鎖圖譜，鑒定的主效QTL 檢出率偏低且鑒定位點(diǎn)數(shù)量也較少［9］。隨著基因組測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展與應(yīng)用，構(gòu)建Bin 圖譜用于QTL 檢測(cè)、候選基因篩選和分子標(biāo)記開發(fā)逐步受到關(guān)注［9,11-12］。已有研究在同一試驗(yàn)點(diǎn)經(jīng)2 年重復(fù)試驗(yàn)，利用Bin 圖譜檢測(cè)到2 個(gè)控制葉綠素含量的QTL，并篩選到9 個(gè)候選基因［9］。前人也在不同氮處理下定位到14 個(gè)控制葉寬的SNP 位點(diǎn)，并鑒定出20個(gè)與高氮和低氮響應(yīng)有關(guān)的SNP 位點(diǎn)，同時(shí)研究者建議，對(duì)易受環(huán)境影響的性狀開展高密度Bin圖譜定位分析時(shí)，結(jié)合多處理、多年、異地環(huán)境的分析更能提高QTL 定位的精準(zhǔn)度［13］。利用高密度Bin 圖譜開展QTL 定位，精確度高，是深入研究重要復(fù)雜生理性狀遺傳規(guī)律的有效方法［9］?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】葉綠素含量是容易受環(huán)境因素影響的數(shù)量性狀［14］，尤其易受氮肥施用量的影響。然而經(jīng)多年份、多時(shí)期開展不同氮肥施用量條件下的有關(guān)葉綠素含量精細(xì)QTL 定位的研究仍鮮有報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究采用不同年份、地點(diǎn)的珍汕97 和明恢63 水稻重組自交系群體為材料，測(cè)定不施氮和正常施氮條件下水稻葉片葉綠素含量，開展不同發(fā)育時(shí)期葉片葉綠素含量高密度Bin 圖譜QTL 定位分析，旨在尋找一些新的、穩(wěn)定的葉綠素含量相關(guān)位點(diǎn)，以期為水稻葉綠素含量相關(guān)基因的鑒定和高光效水稻分子標(biāo)記育種改良提供有利靶標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試水稻材料為珍汕97（ZS97）和明恢63（MH63）重組自交系（RIL），由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳改良國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室水稻研究團(tuán)隊(duì)提供。該群體共210 個(gè)家系，從F11中隨機(jī)選取113個(gè)家系用于本研究。

RIL 高密度圖譜包括1 619 個(gè)重組Bin 標(biāo)記，各染色體Bin 標(biāo)記數(shù)為79～217 個(gè)，總長(zhǎng)1 625.5 cM，平均約1.0 cM/bin，標(biāo)記間平均物理距離約為230 kb［11］。本研究采用的Bin 標(biāo)記詳細(xì)數(shù)據(jù)和圖譜均由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳改良國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室水稻研究團(tuán)隊(duì)提供。

1.2 大田試驗(yàn)

本試驗(yàn)分別于2006 年5—10 月在湖北省孝感市新鋪鎮(zhèn)（30°56'' N、113°54'' E）、2007 年5—10 月在湖北省武穴市大金鎮(zhèn)（29°51'' N、115°33'' E）進(jìn)行。兩地稻田表層25 cm 土壤主要養(yǎng)分分別為：新鋪鎮(zhèn)pH 值（1 ∶1 土水比）5.01，有機(jī)質(zhì)含量30.06 g/kg，全氮含量1.39 g/kg（2006年）；大金鎮(zhèn)pH 值（1 ∶1 土水比）5.37，有機(jī)質(zhì)含量22.76 g/kg，全氮含量1.09 g/kg（2007 年）。

采用秧盤育秧，種植密度16.7 cm×20.0 cm，劃行移栽，每個(gè)家系種植1 個(gè)小區(qū)，小區(qū)面積4.8 m2（2.0 m×2.4 m）。小區(qū)采用隨機(jī)區(qū)組排列，設(shè)置正常氮水平（2006：130 kg/hm2；2007：135 kg/hm2）和低氮水平（0 kg/hm2）處理，每個(gè)處理3 次重復(fù)，肥料運(yùn)籌參照文獻(xiàn)［15］。精細(xì)管理并全程防治病蟲害，成熟期掛防鳥網(wǎng)避免產(chǎn)量損失。兩年的試驗(yàn)設(shè)計(jì)與管理措施保持一致。

1.3 葉綠素含量測(cè)定

分別于移栽后30 d（30 Days after transplanting，30 DAT）和抽穗期（Heading，HD），采用502型SPAD（Soil and Plant Analyzer Development）葉綠素儀進(jìn)行水稻葉片葉綠素含量測(cè)定。移栽后30 d，測(cè)定各小區(qū)除邊行外植株的主莖1.5 葉，分別測(cè)定葉片的中部和中部上、下3.0 cm 處，取3 處平均值表示該葉片SPAD 值，每小區(qū)重復(fù)測(cè)定10片葉。由于RIL 群體家系的抽穗期相差較大，各小區(qū)抽穗10%定義為抽穗期。抽穗期直接測(cè)定植株主莖劍葉的SPAD 值，其他操作與移栽后30 d的檢測(cè)方法相同。

采用Statistix 9.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，差異顯著性檢驗(yàn)用獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)和單因子方差分析（one-way ANOVA，LSD）。

1.4 QTL 定位

利用QTL IciMapping V3.4 軟件，采用完備區(qū)間作圖法（Inclusive Composite Interval Mapping，ICIM）在全基因組范圍內(nèi)進(jìn)行掃描［16］，掃描步長(zhǎng)為1.0 cM，分別檢測(cè)不同處理和不同發(fā)育時(shí)期控制葉綠素含量的QTL。以LOD ≥2.5 作為閾值檢測(cè)QTL，計(jì)算每個(gè)QTL 的貢獻(xiàn)率和加性效應(yīng)。QTL 的命名方法參照McCouch 等［17］公布的規(guī)則。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同氮處理下RIL 群體和親本不同發(fā)育時(shí)期的葉綠素表型變異

由表1 可知，2006、2007 年RIL 群體和親本均表現(xiàn)為低氮條件下的葉片葉綠素含量顯著低于正常氮處理。親本葉片葉綠素含量?jī)赡昃憩F(xiàn)為母本珍汕97 高于父本明恢63；在移栽后30 d，同一親本相同處理的不同年份差異不大；在抽穗期，2007 年明恢63 的葉片葉綠素含量顯著高于2006 年。RIL 群體中的葉綠素含量分布均表現(xiàn)為連續(xù)的正態(tài)分布，并且有超親分離現(xiàn)象，呈現(xiàn)數(shù)量性狀的特點(diǎn)（圖1）。

表1 不同氮處理RIL 群體及其親本的葉綠素含量分析Table 1 Analysis of chlorophyll contents in RIL population and its parents under different nitrogen treatments

2.2 不同年份和不同發(fā)育時(shí)期水稻葉片葉綠素含量相關(guān)性分析

移栽后30 d、抽穗期的水稻葉片葉綠素含量相關(guān)系數(shù)分別達(dá)到極顯著水平（表2）。此外，葉綠素含量在不同氮處理、不同發(fā)育時(shí)期均表現(xiàn)出顯著相關(guān)性，兩年表現(xiàn)一致，表明兩年葉綠素含量的環(huán)境穩(wěn)定性較好。

表2 不同氮處理水稻葉片葉綠素含量的相關(guān)系數(shù)Table 2 Correlation coefficients of chlorophyll contents in leaves of rice under different nitrogen treatments

2.3 水稻葉片葉綠素含量的QTL 檢測(cè)

低氮處理下葉片葉綠素含量，兩年共檢測(cè)到5 個(gè)QTL（2006 年1 個(gè)、2007 年4 個(gè)），分別位于第3、6、10 號(hào)染色體；正常氮處理下葉片葉綠素含量，兩年共檢測(cè)到10 個(gè)QTL（2006 年4 個(gè)、2007 年11 個(gè)），分別位于第1、2、3、6、7、10、11 號(hào)染色體（表3），正常氮處理下檢測(cè)到的QTL 明顯多于低氮處理。在第4、5、8、9 號(hào)染色體上沒有檢測(cè)到控制葉綠素含量的QTL。15個(gè)QTL 在染色體上的分布如圖2 所示。

表3 不同氮處理下水稻葉片葉綠素含量的QTL 檢測(cè)結(jié)果Table 3 QTL detection for chlorophyll contents in leaves of rice under different nitrogen treatments

第1、2、11 號(hào)染色體上分別檢測(cè)到1 個(gè)QTL。其中，q30CHL1位于第1 染色體，在2006年低氮處理水稻葉片中被檢測(cè)到，影響移栽后30 d 的葉綠素含量，解釋14.57%的表型變異，增效基因來(lái)自珍汕97；qHDCHL2位于第2 號(hào)染色體，在2007 年正常氮處理水稻葉片中被檢測(cè)到，等位基因來(lái)自明恢63，解釋8.50%的表型變異；qHDCHL11位于第11 號(hào)染色體，在2007 年正常氮處理水稻葉片中被檢測(cè)到，對(duì)表型的貢獻(xiàn)率為7.41%。

第3 染色體上共檢測(cè)到4 個(gè)QTL，均于2007年的水稻葉片中被檢測(cè)到，等位基因均來(lái)自明恢63；在低氮處理葉片中檢測(cè)到2 個(gè)QTL，q30CHL3-1影響移栽后30 d 的葉綠素含量，解釋11.75%的表型變異，qHDCHL3-1影響抽穗期的葉綠素含量，解釋1.21%的表型變異。另外兩個(gè)QTL（q30CHL3-2和qHDCHL3-2）在正常氮處理水稻葉片中被檢測(cè)到，分別解釋11.38%和11.46%的表型變異。

第6 染色體上共檢測(cè)到 4 個(gè) QTL，均影響抽穗期劍葉的葉綠素含量，且等位基因均來(lái)自珍汕97；在2006 年的水稻葉片中檢測(cè)到2 個(gè)QTL，低氮和正常氮處理下各1個(gè)，均位于染色體8.45～9.12 Mb 處，命名為qHDCHL6-1，低氮和正常氮處理檢測(cè)到的QTL 分別解釋28.01%和19.46%的表型變異；在2007 年的水稻葉片中也檢測(cè)到2個(gè)QTL，qHDCHL6-1在低氮水平下同樣被檢測(cè)到，解釋1.55%的表型變異，qHDCHL6-2在正常氮水平下檢測(cè)到，解釋9.35%的表型變異。qHDCHL6-1在2 年低氮處理下和2006 年正常氮水平下均被檢測(cè)到，表現(xiàn)出較強(qiáng)的穩(wěn)定性。

第7 染色體上共檢測(cè)到2 個(gè)QTL，均為正常氮水平下影響抽穗期劍葉葉綠素含量的QTL，且等位基因均來(lái)自珍汕97；qHDCHL7-1于2006 年的水稻葉片中被檢測(cè)到，可解釋8.42%的表型變異；qHDCH7-2于2007 年的水稻葉片中被檢測(cè)到，可解釋8.74%的表型變異。

第10 染色體上共檢測(cè)到2 個(gè)QTL，均于2007 年的水稻葉片中被檢測(cè)到，增效等位基因均來(lái)自珍汕97；qHDCHL10-1在低氮處理下被檢測(cè)到，是所有QTL 中效應(yīng)最大的位點(diǎn)，解釋40.74%的表型變異；qHDCHL10-2在正常氮處理下被檢測(cè)到，可解釋7.53%的表型變異。

2.4 主效QTL 區(qū)段中候選基因的篩選

利用水稻基因組注釋數(shù)據(jù)庫(kù)（http://rice.uga.edu/）對(duì)重復(fù)檢測(cè)到的qHDCHL6-1區(qū)間內(nèi)的基因進(jìn)行功能注釋。qHDCHL6-1位于第6 號(hào)染色體的8.45～9.12 Mb 處，經(jīng)查詢，該區(qū)間內(nèi)共有113 個(gè)注釋基因，除去不轉(zhuǎn)錄蛋白、逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子蛋白、修復(fù)蛋白、假定蛋白等相關(guān)基因89 個(gè)，共篩選到4 個(gè)有關(guān)葉綠素代謝和影響水稻葉色的候選基因（表4）。

表4 qHDCHL6-1 區(qū)間內(nèi)的基因預(yù)測(cè)Table 4 Predicted genes in interval of qHDCHL6-1生物與非生物脅迫響應(yīng)等方面發(fā)揮重要調(diào)控作用［18］。

LOC_Os06g15370已被克隆，為硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)子/肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因OsNPF3.1，該基因通過(guò)調(diào)控水稻株高、抽穗期和千粒重，影響水稻氮肥利用效率。LOC_Os06g15420已被克隆，為天冬酰胺合成酶基因OsAS2。LOC_Os06g15590注釋為類似細(xì)胞數(shù)目調(diào)節(jié)蛋白，影響細(xì)胞增殖和生長(zhǎng)，負(fù)向調(diào)控器官的形態(tài)發(fā)育。LOC_Os06g15620注釋為受赤霉素誘導(dǎo)的基因家族蛋白（GAST），GAST 家族在植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、葉片發(fā)育及

3 討論

3.1 本研究定位的QTL 中已鑒定的功能基因

前人利用不同的定位群體和標(biāo)記類型檢測(cè)到大量控制不同時(shí)期、不同處理以及不同部位葉片葉綠素含量的QTL，但這些位點(diǎn)對(duì)表型的貢獻(xiàn)率均較低、主效基因較少，表明水稻葉片葉綠素含量的遺傳背景較為復(fù)雜［7-8］。本研究采用高密度Bin 連鎖圖譜，從兩年的水稻葉片中共檢測(cè)到15個(gè)控制移栽后30 d 和抽穗期葉片葉綠素含量的QTL，其中7 個(gè)對(duì)表型的貢獻(xiàn)率超過(guò)10%，表明設(shè)置不同氮肥處理更有利于揭示葉綠素含量的遺傳規(guī)律。

本研究檢測(cè)到的QTL 與前人定位或克隆的QTL 有交叉重疊（表5）。例如，q30CHL1位于第1 染色體33.84～34.74 Mb 處，在該區(qū)域已經(jīng)克隆S-磺基半胱氨酸合酶基因（GRA78），該基因主要功能是直接調(diào)控葉綠體內(nèi)基粒和類囊體的生長(zhǎng)發(fā)育，在水稻苗期和分蘗期分別調(diào)控Chla、Chlb 和總?cè)~綠素含量性狀，突變體的葉綠素含量在苗期和分蘗期分別比野生型降低63.6%和32.5%［19］。前人在qHDCHL2區(qū)域發(fā)現(xiàn)了1 個(gè)光系統(tǒng)I（PSI）色素結(jié)合膜蛋白（Lhca），該蛋白與PSI 結(jié)合形成的復(fù)合體對(duì)太陽(yáng)能具有極高的轉(zhuǎn)化效率［20］。qHDCHL6-1位于第6 染色體8.45～9.12 Mb 處，前人利用F2群體在該區(qū)段定位到一個(gè)與氮肥利用效率密且相關(guān)的qNUE6位點(diǎn)，利用近等基因系進(jìn)行生理分析發(fā)現(xiàn)，該位點(diǎn)存在2 個(gè)與擬南芥AtNPF3.1和ASN2高度同源的基因［21］。qHDCH7-2位于第7 染色體7.26～8.41 Mb 處，該區(qū)域已經(jīng)克隆了亮氨酸羧基甲基轉(zhuǎn)移酶基因（OsMTS1），該基因突變會(huì)導(dǎo)致水稻葉傾角增大、葉片葉綠素含量降低40%、葉片早衰和產(chǎn)量顯著降低［22］，過(guò)表達(dá)則能夠提高水稻產(chǎn)量15.69%［23］。qHDCHL10-1對(duì)表型的貢獻(xiàn)率為40.74%，前人在該區(qū)段鑒定到2 個(gè)Chla 加氧酶基因OsCAO1和OsCAO2，它們?cè)谌旧w上是串聯(lián)的，Chla 加氧酶承擔(dān)催化Chla 合成Chlb 的功能，OsCAO1在有光條件下起主要作用，而OsCAO2主要在黑暗或無(wú)光照條件下發(fā)揮作用［24］。本研究中，qHDCHL10-1僅在低氮條件下檢測(cè)到，該基因是否受到低氮處理的強(qiáng)烈誘導(dǎo)目前仍不清楚。qHDCHL10-2在正常氮處理下檢測(cè)到，前人用秈粳交群體在該區(qū)域定位到拔節(jié)期和抽穗期葉綠素含量穩(wěn)定表達(dá)的qCJ10和qCH10。前人利用粳粳交RIL 在第11 號(hào)染色體定位到成熟期劍葉葉綠素含量相關(guān)的QTL，與qHDCHL11有重疊片段［25］。

表5 本研究定位的QTL 和已知葉綠素含量相關(guān)位點(diǎn)/基因的位置比較Table 5 Comparison of known QTL/genes contributed to chlorophyll content with QTL detected in this study

3.2 qHDCHL6-1 是控制葉綠素含量的主效QTL

本研究結(jié)果顯示，在正常氮處理水稻葉片中檢測(cè)到的QTL 數(shù)量明顯多于低氮處理，表明低氮處理限制了部分QTL 的表達(dá)。前人研究建議，對(duì)氮肥敏感的數(shù)量性狀應(yīng)加強(qiáng)在多環(huán)境下的分析［13］。qHDCHL6-1在2006 年抽穗期的兩個(gè)氮處理中均被檢測(cè)到，在2006 年的正常氮處理中也被檢測(cè)到，表明該位點(diǎn)屬于控制抽穗期葉綠素含量的穩(wěn)定表達(dá)的QTL。通過(guò)水稻基因組注釋數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)發(fā)現(xiàn)，該區(qū)間中存在4 個(gè)候選基因，其中LOC_Os06g15370和LOC_Os06g15420兩個(gè)基因已克隆，分別為硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)子/肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因OsNPF3.1和天冬酰胺合成酶基因OsAS2，兩個(gè)基因均對(duì)氮素吸收利用具有重要作用［26-27］；低氮處理會(huì)刺激OsAS2和OsNPF3.1表達(dá)，增加水稻對(duì)氮素的吸收利用［26,28］，本研究結(jié)果也驗(yàn)證了這一點(diǎn)。LOC_Os06g15620是GAST 家族基因，該基因已在2009 年克隆，被命名為OsGSR1，是GA 信號(hào)的正調(diào)節(jié)因子，在油菜素內(nèi)酯（BR）和GA 信號(hào)通路中起重要作用，并介導(dǎo)兩者互作，在器官形態(tài)建成中正向調(diào)控細(xì)胞分裂，此外還密切參與植物組織抵抗生物脅迫和氧化還原反應(yīng)［18,29］，但LOC_Os06g15620對(duì)葉片葉綠素含量的調(diào)控機(jī)理目前仍不清楚。LOC_Os06g15590為類似細(xì)胞數(shù)目調(diào)節(jié)蛋白基因，該基因仍未被克隆，但在第2 染色體上的同源基因OsCNR1（LOC_Os02g52550）已被克隆，其負(fù)調(diào)控器官細(xì)胞的數(shù)量和大?。?0］，該基因是否調(diào)控葉綠體大小或葉片厚度，目前仍不清楚。因此，推測(cè)qHDCHL6-1作為控制葉綠素含量的主效QTL，OsGSR1和LOC_Os06g15590有可能參與調(diào)控葉片細(xì)胞的分化、排布和器官形態(tài)建成。綜上所述，qHDCHL6-1是多方面調(diào)控水稻葉片葉綠素含量的熱點(diǎn)區(qū)間，具有深入挖掘的潛力，同時(shí)對(duì)高光效、氮高效水稻品種改良也具有重要應(yīng)用價(jià)值。

4 結(jié)論

本研究以珍汕97×明恢63 重組自交系（F11）113 個(gè)家系為QTL 分析的試驗(yàn)材料，在大田栽培條件下，設(shè)置低氮和正常氮兩種氮肥處理，分別在兩年和兩個(gè)發(fā)育時(shí)期測(cè)定葉片葉綠素含量，利用高密度Bin 遺傳圖譜和完備區(qū)間作圖法共檢測(cè)到15 個(gè)控制葉片葉綠素含量的QTL。其中，低氮處理共檢測(cè)到5 個(gè)QTL，正常氮處理共檢測(cè)到10個(gè)QTL。發(fā)現(xiàn)1 個(gè)低氮和正常氮水平下穩(wěn)定表達(dá)的QTLqHDCHL6-1，等位基因來(lái)自珍汕97，控制抽穗期劍葉葉綠素含量，在該區(qū)段篩選到4 個(gè)候選基因。