基于CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)的水稻定向改良研究進(jìn)展

李文龍，欒鑫，張強(qiáng)，余寧，馮曉敏，劉志霞

（1.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所/ 廣東省水稻育種新技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/ 廣東省水稻工程實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華南優(yōu)質(zhì)稻遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510640；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，廣東 廣州 510642）

水稻是功能基因組學(xué)研究的模式作物，同時(shí)也作為世界上重要的糧食作物養(yǎng)育了全球超過半數(shù)的人口［1］。我國是目前世界上最大的稻米生產(chǎn)國和消費(fèi)國，約60%的人口以稻米為主食［2］。水稻生產(chǎn)是關(guān)系糧食安全、人民生活福祉和國家長治久安的頭等大事。中國稻作文化源遠(yuǎn)流長，是水稻種植歷史最為悠久的國家，也是水稻種質(zhì)資源富國和稻作科技強(qiáng)國［2］，先后引領(lǐng)了以“矮化育種”和“雜種優(yōu)勢利用”為基礎(chǔ)的兩次水稻“綠色革命”［3］。經(jīng)過一代又一代稻作科學(xué)家的接續(xù)努力，水稻育種技術(shù)發(fā)展迅速，先后經(jīng)歷了純系育種、雜交育種、誘變育種和分子育種等各個(gè)階段，水稻產(chǎn)量記錄不斷刷新［2］。目前，我國水稻育種已經(jīng)進(jìn)入以秈粳亞種間雜種優(yōu)勢利用為基礎(chǔ)的“5G 時(shí)代”［4-5］，將繼續(xù)引領(lǐng)世界稻作發(fā)展。

隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，人民生活水平不斷提高，對(duì)稻米的需求逐步從“吃得飽”到“吃得好”轉(zhuǎn)變，對(duì)水稻的產(chǎn)量、品質(zhì)和抗性提出了更高的要求，高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)多抗新品種的培育已經(jīng)成為水稻育種追求的主要目標(biāo)。稻米需求的升級(jí)為水稻育種技術(shù)帶來了新的要求和挑戰(zhàn)，以往的遺傳改良方法如雜交育種、回交育種、誘變育種、分子標(biāo)記輔助選擇育種和轉(zhuǎn)基因育種等，有的具有明顯缺點(diǎn)或局限，有的面臨一些實(shí)際技術(shù)問題無法大范圍推廣使用，已不利于水稻品種的快速迭代升級(jí)改良：雜交育種、回交育種具有后代分離大、難以快速穩(wěn)定、育種周期較長、盲目性大等缺點(diǎn)；誘變育種具有變異方向不穩(wěn)定不可控、有益突變概率低、精準(zhǔn)性不高等缺點(diǎn)；分子標(biāo)記輔助選擇育種雖然在一定程度上解決了育種精準(zhǔn)性的問題，但也同樣面臨連鎖累贅無法打破、耗時(shí)費(fèi)力等諸多問題；轉(zhuǎn)基因育種可以通過將外源功能基因整合到受體作物的染色體上表達(dá)，達(dá)到精準(zhǔn)定向改良作物性狀的目的，但是由于其會(huì)引入外源DNA 片段，引發(fā)對(duì)轉(zhuǎn)基因食品安全方面的擔(dān)憂而無法全面釋放應(yīng)用。相較于傳統(tǒng)育種方法，新興的CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)能通過預(yù)先設(shè)定的引導(dǎo)序列，精準(zhǔn)地對(duì)內(nèi)源目標(biāo)靶基因位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)突變（插入或缺失）或精準(zhǔn)編輯（堿基替換），達(dá)到敲除或者改變目標(biāo)基因功能的目的。雖然CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)依靠轉(zhuǎn)基因的方式完成，但是由于轉(zhuǎn)基因TDNA 插入位點(diǎn)往往與編輯位點(diǎn)位置不同，可以在編輯后代中通過遺傳分離得到完全沒有轉(zhuǎn)基因元件的編輯突變體。隨著CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)不斷改進(jìn)和發(fā)展，編輯技術(shù)日漸穩(wěn)定成熟，目前已經(jīng)在動(dòng)植物的功能基因研究、種質(zhì)資源創(chuàng)制創(chuàng)新、優(yōu)良新品種培育和定向改良中發(fā)揮重要作用。在水稻品種改良中，CRISPRCas9 系統(tǒng)能快速定向穩(wěn)定目標(biāo)性狀、縮短育種周期，展現(xiàn)出強(qiáng)大的應(yīng)用潛力，有望成為未來水稻育種的重要輔助工具。因此，在當(dāng)前形勢下，加強(qiáng)對(duì)水稻基因編輯技術(shù)的研究具有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義。本文主要綜述了近年來CRISPR-Cas9 基因編輯技術(shù)在水稻性狀定向改良上的研究進(jìn)展，并對(duì)該技術(shù)的未來發(fā)展前景進(jìn)行探討和展望，以期為水稻育種方法的革新與發(fā)展提供新的思路和參考。

1 CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)

規(guī)律間隔成簇短回文重復(fù)序列相關(guān)系統(tǒng)（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats associated system，CRISPR/Cas）是細(xì)菌和古細(xì)菌體內(nèi)長期演化過程中形成的一種適應(yīng)性免疫防御機(jī)制，可以利用雙RNA 引導(dǎo)DNA 內(nèi)切酶在目標(biāo)DNA 中引入位點(diǎn)特異性雙鏈斷裂來抵御外源DNA 的侵染［6］。CRISPR/Cas 是繼鋅指核酸酶（ZFN）、轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)因子核酸酶（TALEN）等基因編輯技術(shù)之后的第三代基因編輯系統(tǒng)，不同于ZFN 和TALEN 系統(tǒng)的DNA 識(shí)別是依賴蛋白質(zhì)來完成，CRISPR/Cas 編輯系統(tǒng)的目標(biāo)靶位點(diǎn)識(shí)別是利用一段短RNA 片段實(shí)現(xiàn)的。理論上Cas 蛋白可以在RNA 的引導(dǎo)下對(duì)任何一段特異的基因組DNA 序列進(jìn)行精準(zhǔn)操縱，用來闡釋基因功能、修復(fù)有害突變、抑制被激活的致病基因或者激活病癥的抑制基因；研究者可以通過一次實(shí)驗(yàn)同時(shí)靶向編輯多個(gè)位點(diǎn)驗(yàn)證多個(gè)基因的功能［6］。該技術(shù)目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用于水稻、小麥、玉米、人類、斑馬魚、豬等動(dòng)植物的基因組研究，具有設(shè)計(jì)簡單、操作簡便、成本低廉、精準(zhǔn)高效等優(yōu)點(diǎn)［6-10］。

CRISPR/Cas 系統(tǒng)主要分為3 種類型（圖1A），Ⅱ型主要在細(xì)菌基因組中被發(fā)現(xiàn)，Ⅲ型則主要存在于古細(xì)菌，而Ⅰ型則在細(xì)菌和古細(xì)菌中均有分布［11］。3 類系統(tǒng)均含有靶向DNA 區(qū)域、crRNA區(qū)域，I 型和II 型依賴于前間區(qū)序列臨近基序（Protospacer Adjacent Motif，PAM），而Ⅲ型則不依賴PAM 序列［11］。CRISPR/Cas9 基因編輯系統(tǒng)屬于Ⅱ型系統(tǒng)，是廣泛應(yīng)用于基因編輯、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、表觀遺傳修飾和基因組成像等領(lǐng)域的一個(gè)強(qiáng)大基因編輯平臺(tái)［6］，也是目前為止研究最多最透徹、操作最簡單方便的基因編輯系統(tǒng)。在Ⅰ型、Ⅲ型CRISPR/Cas 系統(tǒng)中，成熟的crRNA 引導(dǎo)幾個(gè)核酸酶Cas 組成的大型蛋白復(fù)合體共同發(fā)揮作用才能順利剪切外源DNA，而Ⅱ型CRISPR/Cas系統(tǒng)僅需要單一的DNA 內(nèi)切酶Cas9 蛋白配合crRNA、tracrRNA 即可識(shí)別和剪切目標(biāo)靶DNA，不依賴于多蛋白復(fù)合體［6,12］。為方便使用，目前常用的 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)經(jīng)過簡化將crRNA 和tracrRNA 合并成一個(gè)嵌合的sgRNA 轉(zhuǎn)錄本，并完全保留了Cas9 介導(dǎo)的序列特異性剪切功能（圖1B），可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求設(shè)計(jì)改造sgRNA，引導(dǎo)Cas9 蛋白到基因組上特定區(qū)段，并在PAM 序列的上游剪切DNA 雙鏈形成平末端裂口［6,11,13］。當(dāng)目的基因雙鏈斷裂后，裂口會(huì)被細(xì)胞中存在的DNA 修復(fù)機(jī)制所修復(fù)。修復(fù)機(jī)制可分為同源修復(fù)（HR）和非同源末端連接（NHEJ），NHEJ 修復(fù)過程中會(huì)在剪切位點(diǎn)產(chǎn)生小片段的插入或缺失引發(fā)基因編碼改變或者提前終止，導(dǎo)致基因沉默；HR 修復(fù)會(huì)恢復(fù)野生型序列；而在有供體 DNA 存在的情況下，斷裂位置會(huì)通過HR 修復(fù)方式進(jìn)行同源修復(fù)精準(zhǔn)地引起DNA 片段插入或替換，達(dá)到基因敲入的目的（圖1B）［6,11］。

2 CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)在水稻定向改良中的應(yīng)用

性狀改良是新品種不斷升級(jí)迭代的源動(dòng)力。傳統(tǒng)的水稻品種改良通常采用雜交方式將各種優(yōu)異等位基因聚合于受體親本，周期漫長、費(fèi)時(shí)耗力且無法打破連鎖累贅，在引入優(yōu)良基因的同時(shí)可能會(huì)帶入諸多不利基因。如何實(shí)現(xiàn)目標(biāo)基因的精準(zhǔn)快速改良，克服傳統(tǒng)育種方式的種種弊端是育種家面臨的一個(gè)亟需解決的問題。作為一種新興的基因編輯技術(shù)，由細(xì)菌免疫系統(tǒng)發(fā)展而來的CRISPR/Cas9 僅需改造引導(dǎo)RNA 序列即可實(shí)現(xiàn)基因組靶位點(diǎn)的定點(diǎn)編輯［11］。在基因編輯過程中，由于CRISPR/Cas9 基因編輯植株的轉(zhuǎn)基因標(biāo)簽插入位點(diǎn)往往與編輯位點(diǎn)不在同一位置，易于在后代中獲取沒有外源基因整合的編輯材料，避免了傳統(tǒng)轉(zhuǎn)基因方法導(dǎo)致的食品安全擔(dān)憂問題。因此，CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)在水稻定向改良中具有巨大的應(yīng)用潛力。目前，眾多研究者已經(jīng)利用CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)針對(duì)水稻中的多個(gè)重要靶標(biāo)展開定向改良研究工作，取得一系列研究成果（表1）。

2.1 水稻抗病性的定向改良

稻瘟病是水稻生產(chǎn)中的主要病害之一，全球每年因稻瘟病導(dǎo)致的產(chǎn)量損失約占水稻總產(chǎn)量10%～30%，稻瘟病爆發(fā)時(shí)，輕則引起水稻大幅減產(chǎn)，重則導(dǎo)致絕收［14-15］。因此，改良水稻稻瘟病抗性對(duì)水稻穩(wěn)產(chǎn)增產(chǎn)具有重要意義。目前，水稻中已鑒定出超過100 個(gè)稻瘟病抗性位點(diǎn)，其中超過30 個(gè)稻瘟病抗性基因已被克隆［14,16］。在抗性基因克隆和功能解析的基礎(chǔ)上，通過CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)定點(diǎn)修飾抗性相關(guān)基因，可以有針對(duì)性地定向改良水稻稻瘟病抗性。Zhou 等［16］在秈型光溫敏不育系LK638S 背景下采用CRISPR/Cas9 技術(shù)對(duì)Bsr-d1、Pi21和ERF922等3 個(gè)已知的稻瘟病抗性相關(guān)基因進(jìn)行基因編輯研究，發(fā)現(xiàn)單基因突變體和3 基因突變體的稻瘟病抗性均顯著高于野生型受體品種，同時(shí)突變體的產(chǎn)量性狀基本不受影響，為水稻抗病性的快速定向改良提供了范例。在粳稻Kuiku131 中敲除水稻稻瘟病抗性的負(fù)調(diào)控因子OsERF922也得出類似實(shí)驗(yàn)結(jié)果，突變體在不影響穗數(shù)、株高、千粒質(zhì)量等重要農(nóng)藝性狀的前提下，顯著提高了稻瘟病抗性［17］。在高感稻瘟病的優(yōu)質(zhì)水稻品種大粒香中，利用CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)定點(diǎn)編輯稻瘟病相關(guān)基因pid3，后代無轉(zhuǎn)基因標(biāo)簽的純合突變體材料的稻瘟病抗性有效提高，因病損失率顯著降低，達(dá)到了稻瘟病抗性定向改良的目標(biāo)［15］。編碼區(qū)內(nèi)21 bp 和48 bp 的兩處缺失導(dǎo)致pi21功能喪失，進(jìn)而賦予水稻稻瘟病廣譜抗性，房耀宇等［18］利用CRISPR/Cas9 技術(shù)在Pi21基因的外顯子區(qū)域設(shè)計(jì)2 個(gè)靶標(biāo)位點(diǎn)對(duì)該基因進(jìn)行敲除研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在敲除Pi21的突變體中該基因發(fā)生移碼突變，表達(dá)量較野生型品種明顯降低，稻瘟病抗性則顯著提高。OsVQ25 通過與E3 泛素連接酶OsPUB73和轉(zhuǎn)錄因子OsWRKY53 互作，在平衡水稻的廣譜抗病性和生長發(fā)育中發(fā)揮重要功能［19］。VQ25通過抑制OsWRKY53的功能負(fù)向調(diào)控水稻抗病性，在水稻中敲除VQ25，敲除突變體的稻瘟病抗性得到顯著提高，而其他農(nóng)藝性狀基本不受影響，表明CRISPR/Cas9 技術(shù)改良作物性狀可以做到精準(zhǔn)定向、有效避免連鎖累贅。

白葉枯病是一種由水稻黃單胞桿菌（Xanthomonas oryzaepv.Oryzae，Xoo）引起的毀滅性水稻病害，白葉枯病頻繁爆發(fā)嚴(yán)重威脅水稻生產(chǎn)。水稻OsSWEET14基因是已知大部分Xoo菌株的易感靶標(biāo)，能夠被Xoo中的轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)子（TAL）通過結(jié)合其啟動(dòng)子區(qū)域的效應(yīng)子結(jié)合元件（EBE）激活表達(dá)，從而負(fù)向調(diào)控水稻的白葉枯抗性，不同研究者分別利用CRISPR/Cas9 技術(shù)定點(diǎn)編輯OsSWEET14的基因編碼區(qū)和啟動(dòng)子序列的EBE 元件，均獲得白葉枯病抗性顯著提高的水稻材料［20-21］，并且可保持主要農(nóng)藝性狀基本不改變［20］。為改良IR24 的白葉枯病抗性，郝巍等［22］利用CRISPR/Cas9 定點(diǎn)編輯了與白葉枯病抗性相關(guān)的Pong2-1、Pong11-1兩個(gè)基因位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)與野生型IR24 相比，突變體pong2-1和pong11-1的主要農(nóng)藝性狀無顯著變化，但對(duì)白葉枯病的抗性顯著提高，由此創(chuàng)制出新的白葉枯病抗性材料。Xig1（Xoo-induced gene 1）是一個(gè)受水稻白葉枯病菌誘導(dǎo)表達(dá)的基因，與感白葉枯病相關(guān)。在秈稻IR24 背景下敲除Xig1的突變體對(duì)白葉枯病菌敏感性降低，接種14 d 后突變體的病斑長度較野生型降低53%～65%，白葉枯病抗性提高且突變株系在主要農(nóng)藝性狀上與野生型IR24 無顯著差異［23］。武廣珩等［24］通過CRISPR/Cas9 技術(shù)敲除水稻的免疫防衛(wèi)相關(guān)基因OsEDR1，白葉枯病原菌XooPXO99 的接種侵染試驗(yàn)結(jié)果顯示，突變體水稻植株病斑長度相較于野生型日本晴減少約50%，白葉枯病抗性明顯增強(qiáng)。除修飾單個(gè)基因位點(diǎn)獲得某一特定抗性外，利用CRISPR/Cas9技術(shù)編輯1 個(gè)抗性基因也可以實(shí)現(xiàn)多種抗病性狀協(xié)同改良的目標(biāo)。研究發(fā)現(xiàn)，Pi21或ERF922的單基因敲除突變體除可顯著提高水稻稻瘟病抗性外，白葉枯病的抗性也得到顯著增強(qiáng)［16］；在水稻中敲除OsVQ25能同時(shí)協(xié)同提升稻瘟病和白葉枯病的抗性［19］。

稻瘟病和白葉枯病是水稻生產(chǎn)中面臨的主要病害，爆發(fā)嚴(yán)重時(shí)會(huì)造成水稻大幅減產(chǎn)甚至絕收［14,20-21］。長期通過噴灑農(nóng)藥防控水稻病害，會(huì)造成環(huán)境污染、藥害、推高水稻生產(chǎn)成本等一系列問題，因此，通過培育抗病新品種來改良水稻的抗病性，是解決水稻病害問題最直接、最有效、最經(jīng)濟(jì)的方法。通過雜交育種方法改良水稻抗病性周期過長，加上病菌進(jìn)化變異速度快，往往經(jīng)過多年雜交、回交導(dǎo)入的抗性基因剛剛穩(wěn)定就已失去對(duì)新的病菌小種的抗性作用，嚴(yán)重制約抗病新品種的培育。前人研究表明，利用CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)定向改良抗病相關(guān)基因，如pid3［15］、Bsr-d1［16］、ERF922［16-17］、Pi21［16,18］、VQ25［19］、OsSWEET14［20-21］、Pong2-1［22］、Pong11-1［22］、Xig1［23］、OsEDR1［24］等，能在基本不改變其他主要農(nóng)藝性狀的前提下，在短期內(nèi)（兩個(gè)水稻生長世代）獲得純合穩(wěn)定、不含轉(zhuǎn)基因標(biāo)簽的定向改良水稻新材料。CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)大大提高了育種效率、縮短了育種年限，為未來水稻抗病性的定向改良提供了參考和范例。

2.2 水稻品質(zhì)的定向改良

稻米品質(zhì)是復(fù)雜的農(nóng)藝性狀，包括外觀品質(zhì)、加工品質(zhì)、蒸煮食味品質(zhì)和營養(yǎng)品質(zhì)等，是水稻商品價(jià)值的重要衡量因素。香氣被認(rèn)為是優(yōu)質(zhì)稻米的重要指標(biāo)，水稻OsBadh2基因功能的缺失導(dǎo)致2-乙酰-1-吡咯啉（2-AP）的積累是水稻香氣形成的主要原因。研究者在不同的遺傳背景下運(yùn)用CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)對(duì)OsBadh2進(jìn)行敲除研究，發(fā)現(xiàn)敲除突變體材料的2-AP 含量均能顯著提高，可以產(chǎn)生強(qiáng)烈香氣，稻米食味性狀得到快速精準(zhǔn)改良［18,25-26］。直鏈淀粉含量是影響水稻口感的重要因素，黃李春等［27］在粳稻日本晴背景下，利用CRISPR/Cas9 技術(shù)在Wx 基因編碼區(qū)的C 端第12、13 外顯子處設(shè)計(jì)2 個(gè)靶標(biāo)位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)敲除研究，獲得8 種無轉(zhuǎn)基因標(biāo)簽的純合突變材料。與野生型相比，8 種突變材料的農(nóng)藝性狀無顯著變化，但是直鏈淀粉含量從16.79%下降至3.69%～4.44%，得到直鏈淀粉含量極低的糯稻新種質(zhì)。除編輯Wx 基因的編碼區(qū)，研究者還利用CRISPR/Cas9 技術(shù)編輯Wx 基因啟動(dòng)子上的關(guān)鍵順式作用元件，通過調(diào)節(jié)Wx 基因的表達(dá)量，進(jìn)而達(dá)到改良稻米直鏈淀粉含量的目的［28-30］。毛興學(xué)等［28］在秈稻保持系吉豐B 背景下，定向編輯Wx 基因的編碼區(qū)上游序列，得到兩份低直鏈淀粉含量的水稻新種質(zhì)。Huang 等［29］通過分析Wx基因啟動(dòng)子序列上的順式作用元件，并選擇7 個(gè)靶標(biāo)作為編輯位點(diǎn)，通過下調(diào)Wx 基因的表達(dá)量調(diào)節(jié)稻米直鏈淀粉含量，獲得6 個(gè)新的Wx 等位基因類型。利用CRISPR/Cas9 技術(shù)編輯Wx 基因的啟動(dòng)子序列，Zeng 等［30］也在高直鏈淀粉含量的保持系天豐B 背景下獲得了直鏈淀粉含量不同程度降低的一系列新材料。Sun 等［31］運(yùn)用CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)對(duì)水稻淀粉分支酶基因SBEI、SBEIIb進(jìn)行敲除研究，結(jié)果表明sbeI突變體與野生型相比無明顯差異，而sbeIIb突變體的直鏈淀粉、抗性淀粉含量分別提高至25%、9.8%，創(chuàng)制了高直鏈淀粉、高抗性淀粉含量新種質(zhì)。在外觀品質(zhì)方面，為獲得優(yōu)質(zhì)長粒水稻，徐善斌等［32］利用CRISPR/Cas9 技術(shù)將水稻的GS3和GS9基因位點(diǎn)進(jìn)行編輯，高效地將圓粒形粳稻龍粳11 改造成長粒。Cheng 等［33］在粳稻日本晴背景下敲除粒形基因GS3和GL3.1，發(fā)現(xiàn)GS3敲除突變體呈現(xiàn)細(xì)長粒，同時(shí)堊白率降低；而GS3/GL3.1雙敲除突變體表現(xiàn)為大粒和高堊白，表明敲除GS3和GL3.1可以快速改良粒形并影響稻米品質(zhì)。

水稻品質(zhì)是稻米商品價(jià)值的重要影響因素，是水稻不斷升級(jí)改良的重要目標(biāo)，同時(shí)也是調(diào)控最復(fù)雜的重要性狀之一。水稻品質(zhì)性狀調(diào)控涉及方面廣、參與基因多、調(diào)控網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜。傳統(tǒng)方式對(duì)品質(zhì)性狀的遺傳改良中，往往不同性狀之間相互制約、相互影響，難以多方面協(xié)調(diào)改良。CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)不僅可以精準(zhǔn)定點(diǎn)修飾目標(biāo)基因、有效避免不利的連鎖效應(yīng)，還能同時(shí)編輯多個(gè)基因位點(diǎn)，協(xié)同改良多個(gè)性狀，是復(fù)雜性狀定向改良的理想工具。此外，控制水稻重要品質(zhì)性狀的基因往往只有一個(gè)到幾個(gè)有限的等位基因類型，多樣性有限，采用傳統(tǒng)遺傳改良方法創(chuàng)制新的等位基因類型十分困難，而CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)能通過編輯基因的啟動(dòng)子序列不同程度地上調(diào)或下調(diào)基因的表達(dá)量，從而產(chǎn)生一系列自然變異中不存在的新等位基因類型［28-30］，以滿足不同的需求。在未來水稻品質(zhì)定向改良、新優(yōu)異種質(zhì)資源創(chuàng)制中具有廣闊的應(yīng)用前景。

2.3 水稻育性的定向改良

在兩系法雜交水稻中，光溫敏核不育系（TGMS）是雜種優(yōu)勢利用的基礎(chǔ)，TMS5是調(diào)控光溫敏核不育的主效基因。梁敏敏等［34］利用CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)在早秈品種中早70 中敲除TMS5，獲得了敗育穩(wěn)定的溫敏不育系材料。在粳稻武運(yùn)粳7 號(hào)背景下敲除TMS5，同樣可以快速獲得粳型溫敏雄性不育系［35］。通過CRISPR/Cas9 技術(shù)編輯TMS5基因，Zhou 等［36］僅用1 年時(shí)間即獲得具有商業(yè)應(yīng)用潛力的秈型和粳型溫敏核不育系11 個(gè)，大大提高了不育系的育種效率。水稻秈粳間雜種不育是亞種間雜種優(yōu)勢利用的主要障礙。在水稻秈粳雜種F1代，多個(gè)拷貝的Sc-i通過高表達(dá)等位抑制Sc-j導(dǎo)致花粉敗育，利用CRISPR-Cas9 敲除1～2 個(gè)Sc-i基因拷貝可以有效克服秈粳雜交F1代的雄性不育［37］，該研究為克服秈粳雜種不育、充分利用水稻亞種間雜種優(yōu)勢奠定了基礎(chǔ)。雜種優(yōu)勢的固定是一系法水稻的前提和基礎(chǔ)。Khanday 等［38］研究表明，敲除REC8、PAIR1、OSD1等3 個(gè)介導(dǎo)減數(shù)分裂的主要基因，同時(shí)異位表達(dá)BBM1 能夠調(diào)控水稻的無性繁殖而實(shí)現(xiàn)雜種優(yōu)勢固定。Wang 等［39］通過使用CRISPR/Cas9 系統(tǒng)在雜交水稻中同時(shí)編輯REC8、PAIR1、OSD1、MTL等4 個(gè)內(nèi)源基因，在雜種一代水稻中獲得了克隆雜一代種子，有望實(shí)現(xiàn)雜種優(yōu)勢的固定，使一系法水稻的創(chuàng)制成為可能。

水稻育性是關(guān)乎產(chǎn)量的重要農(nóng)藝性狀。在雜交水稻中，不育系是雜種優(yōu)勢利用的基礎(chǔ)，前人研究表明，利用CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)在不同的遺傳背景下均可以快速創(chuàng)制光溫敏核不育系［34-36］，這將大大拓寬水稻雜種優(yōu)勢的利用范圍。理論上通過利用CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)，未來我們可以將任何一個(gè)水稻材料快速定向改造成不育系應(yīng)用于雜交水稻生產(chǎn)。秈粳雜種不育一直是水稻亞種間雜種優(yōu)勢利用的主要障礙，以往以秈粳架橋或?qū)ふ抑行杂H和基因的克服雜種不育策略，受到嚴(yán)重不育和資源的制約而困難重重，今后可以利用CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)敲除秈粳亞種間雜種不育相關(guān)位點(diǎn)，精準(zhǔn)快速創(chuàng)制親和性材料，將為充分利用水稻秈粳亞種間雜種優(yōu)勢掃清障礙。

2.4 水稻耐受非生物脅迫的定向改良

除了改良上述農(nóng)藝性狀，CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)在水稻非生物脅迫相關(guān)性狀改良中也展現(xiàn)了廣闊的應(yīng)用前景［40］。利用 CRISPR/Cas9 定向編輯水稻ALS基因，Sun 等［41］成功獲得不含轉(zhuǎn)基因元件的抗除草劑水稻品系。Li 等［42］使用CRISPR/Cas9 編輯水稻EPSPS基因，在后代中獲得具有除草劑草甘膦抗性的水稻。這些研究為水稻耐除草劑篩選和抗除草劑育種打下基礎(chǔ)。研究者在水稻中編輯OsNAC041基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)突變體水稻對(duì)鹽分敏感性發(fā)生變化，影響其耐鹽性［43］。在秈稻品種MTU1010 中敲除OsDST基因后，葉片增寬、氣孔密度降低、葉片保水能力提高，水稻的抗旱性和耐鹽性得到提高［44］。Chen 等［45］利用CRISPR/Cas9 敲除OsFTIP1基因，獲得更加耐旱的水稻材料。高溫是影響水稻生產(chǎn)的重要脅迫因素，Kan 等［46］研究發(fā)現(xiàn)敲除水稻TT2基因能有效提高水稻的耐熱性，同時(shí)發(fā)現(xiàn)敲除鈣敏轉(zhuǎn)錄因子SCT1和SCT2同樣可增強(qiáng)水稻耐熱性，為耐高溫水稻品種的定向改良提供了新思路。

隨著全球氣候變化加劇，極端天氣（如超高溫、極端低溫）頻發(fā)，加上鹽漬化土壤增多，這為未來水稻品種耐受非生物脅迫提出了更高要求。CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)已經(jīng)在水稻的耐鹽性［40,44］、除草劑抗性［41-42］、耐干旱［44-45］和耐高溫［46］等性狀改良中嶄露頭角，今后或?qū)⒃诟喾巧锩{迫性狀的定向改良中發(fā)揮更重要的作用。

2.5 水稻其他性狀的定向改良

抽穗期是水稻的重要農(nóng)藝性狀，抽穗期性狀的定向改良對(duì)擴(kuò)展水稻品種的區(qū)域適應(yīng)性具有重要意義。Li 等［47］通過設(shè)計(jì)特異靶點(diǎn)在7 個(gè)主栽品種中定向編輯Hd2、Hd4、Hd5等3 個(gè)抽穗期基因，結(jié)果顯示敲除后代均能在不同程度上縮短抽穗期，達(dá)到生育期定向改良的目標(biāo)?？沟狗潜ＷC水稻穩(wěn)產(chǎn)的重要性狀，在水稻中敲除OsRhoGDI2基因可以縮短水稻第Ⅱ、第Ⅲ莖節(jié)，顯著降低株高，提高水稻的抗倒伏能力［48］。王新等［49］運(yùn)用CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)將水稻的SD1基因敲除，突變體中GA 水平降低，水稻株高降低，有效改良了優(yōu)質(zhì)香糯品種的抗倒性。水稻株型、穗粒數(shù)和穗型是產(chǎn)量相關(guān)的重要農(nóng)藝性狀，研究者通過編輯IPA、Gnla、DEP1等基因，定向改良了水稻株型、穗粒數(shù)和穗型等性狀［50］。水稻開花時(shí)間是影響雜交水稻制種的主要因素，Wang 等［51］通過敲除DFOT1基因?qū)⒕局谢?1在一天中的花時(shí)提前約2.5 h，成功改良了粳稻晚花性狀，有望應(yīng)用于秈粳雜交育種中以提高秈粳雜交制種的產(chǎn)量。隨后，Xu 等［52］報(bào)道了早花基因EMF1，缺失該基因能提高漿片的吸水能力，引起早花，無論在秈稻還是粳稻中敲除該基因均能提早花時(shí)2.0～2.5 h，這為不育系花時(shí)改良提供了新途徑。為探索高油酸水稻種質(zhì)資源的創(chuàng)制，任代勝等［53］利用CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)在粳稻日本晴中靶向敲除脂肪酸去飽和酶基因OsFAD2，敲除突變體籽粒中的油酸含量較野生型水稻提高25%～30%，為高油酸稻米育種和稻米油產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供了材料基礎(chǔ)。

CRISPR/Cas9 作為新一代基因編輯技術(shù)，以其強(qiáng)大的編輯能力、極簡便的可操作性和廣闊的應(yīng)用前景，逐步成為現(xiàn)代水稻育種過程中不可或缺的重要補(bǔ)充，其應(yīng)用已經(jīng)深入到水稻性狀定向改良的各個(gè)方面（圖2），必將在水稻育種方式不斷革新中發(fā)揮更加重要的作用。

3 展望

目前水稻育種已經(jīng)進(jìn)入新時(shí)代，對(duì)水稻品種的產(chǎn)量、品質(zhì)、抗性等方面都提出了更高要求，以育種家經(jīng)驗(yàn)為基礎(chǔ)的傳統(tǒng)育種方式已逐漸不能滿足新時(shí)代的育種要求。CRISPR/Cas9 技術(shù)以其在水稻性狀定向改良中展現(xiàn)出來的無可比擬的精準(zhǔn)性、可預(yù)見性和高效性，已然成為新時(shí)期水稻育種的重要輔助手段。此外，創(chuàng)制多樣化的種質(zhì)資源類型以滿足不同人群的消費(fèi)需求也是未來水稻育種的重要方向。傳統(tǒng)遺傳方法難以在水稻中創(chuàng)制新的等位基因類型，而通過修飾基因的調(diào)控區(qū)域，CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)能達(dá)到調(diào)節(jié)基因表達(dá)的目的，從而創(chuàng)制一些自然變異中不存在的新等位基因，這將在未來突破性、多樣化水稻新品種的培育中具有廣闊的應(yīng)用前景。

目前，CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)對(duì)作物改良研究仍處于基礎(chǔ)研究或技術(shù)儲(chǔ)備階段，真正應(yīng)用到水稻生產(chǎn)實(shí)踐中仍面臨著不少挑戰(zhàn)和問題。首先，國際上對(duì)基因編輯作物的監(jiān)管普遍采用基于過程或基于產(chǎn)品的兩種管理方法。其中，歐盟采用基于過程的監(jiān)管方式，將基因編輯作物視作轉(zhuǎn)基因作物監(jiān)管；美國、加拿大和阿根廷等國家則是基于產(chǎn)品監(jiān)管，將基因編輯作物視作非轉(zhuǎn)基因作物監(jiān)管［54］。截至目前，我國對(duì)這種經(jīng)過轉(zhuǎn)基因過程產(chǎn)生的且不帶有轉(zhuǎn)基因元件的基因編輯產(chǎn)物，尚未按照非轉(zhuǎn)基因作物對(duì)待全面放開推廣釋放，這意味著基因編輯作物的大范圍推廣仍面臨不確定性。其次，水稻重要性狀的調(diào)控往往是涉及眾多基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，其中發(fā)揮重要功能的基因有些是正向調(diào)控，有些是負(fù)向調(diào)控。目前基于CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)的研究絕大部分是敲除或失活基因，對(duì)增強(qiáng)正向調(diào)控或功能獲得性基因敲入的研究還非常少，這在很大程度上限制了CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)在實(shí)際育種中的應(yīng)用。未來，根據(jù)需要對(duì)CRISPR/Cas9 基因編輯平臺(tái)與其他基因組改造技術(shù)進(jìn)行深入交叉融合升級(jí)［9］，進(jìn)一步擴(kuò)展CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)的應(yīng)用范圍，實(shí)現(xiàn)無轉(zhuǎn)基因元件殘存的基因增強(qiáng)和基因敲入功能，將大大擴(kuò)寬該技術(shù)的育種應(yīng)用。再次，目前主流應(yīng)用的CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)，編輯靶位點(diǎn)設(shè)計(jì)和選擇往往需要依賴PAM序列，這將嚴(yán)重限制敲除位點(diǎn)的靈活選擇，難以實(shí)現(xiàn)任意位點(diǎn)的基因編輯，也將是CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的主要限制因素。研究發(fā)現(xiàn)Ⅲ型CRISPR/Cas 系統(tǒng)的基因編輯不需要依賴PAM 序列［11］，未來或?qū)⒕哂懈訌V闊的應(yīng)用前景。最后，CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)在應(yīng)用過程中會(huì)存在一定程度的脫靶現(xiàn)象，這將引起非目標(biāo)區(qū)域的基因突變，導(dǎo)致編輯結(jié)果的不確定性或者偏差。以上這些因素都會(huì)影響CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)在實(shí)踐中的大規(guī)模商業(yè)化應(yīng)用。

CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)作為一種新的育種輔助手段，盡管還存在各種制約問題，但仍以其獨(dú)特的精準(zhǔn)改造基因能力吸引著越來越多的研究者對(duì)其開展深入研究。隨著研究的不斷推進(jìn)和深入，上述制約問題或?qū)⒂卸狻０袠?biāo)任意選擇、精準(zhǔn)定點(diǎn)替換、基因敲入的實(shí)現(xiàn)將大大擴(kuò)展CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在育種中的適用范圍，助推育種技術(shù)不斷革新。